畢錫麟，王 鍇，李鵬飛，景炅婕，韓 琦，呂麗華*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，太谷 030801； 2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，太谷 030801)

牛屬于單胎動物，在每個發(fā)情周期中，只有一個卵泡發(fā)育成熟并最終排卵[1]，卵泡的生長發(fā)育與排卵在牛繁殖過程中起重要作用。在牛卵泡發(fā)育過程中，會受到多種因素的影響，激素類物質(zhì)如促卵泡素FSH會啟動牛卵泡發(fā)育波[2]、促黃體素LH則在卵泡成熟排卵及黃體形成時發(fā)揮作用[3]；生長因子與細(xì)胞因子也在牛卵泡發(fā)育過程中起重要作用，如胰島素樣生長因子IGFs會促進(jìn)卵泡顆粒細(xì)胞(granulosa cells, GCs)與內(nèi)膜細(xì)胞增殖與分化，促進(jìn)GCs分泌E2[4]；此外，一些重要的基因與蛋白(如CART等)也會在牛卵泡發(fā)育過程中起重要作用[5]。本課題組前期以母牛為研究對象，利用高通量深度測序技術(shù)篩選出10個與牛卵泡發(fā)育相關(guān)的基因，其中PRSS35在轉(zhuǎn)錄組(PDF1和ODF1)的差異表達(dá)倍數(shù)為2.4，推測PRSS35可能與牛卵泡發(fā)育密切相關(guān)[6]。研究表明，PRSS35特異性表達(dá)于小鼠卵巢，并在小鼠卵泡發(fā)育和排卵過程，以及黃體形成與退化中表達(dá)量上調(diào)，推測其可能會促進(jìn)卵泡發(fā)育并誘導(dǎo)排卵[7-10]。功能研究表明，PRSS35可能與卵母細(xì)胞受精潛力[11]、人唇腭裂[12]、腎纖維化[13]相關(guān)。目前有關(guān)PRSS35的研究主要集中于模式動物小鼠與人上，在牛上未見報道，根據(jù)基因在物種之間的保守性，推測其在牛上具有相同效果。本研究通過實時熒光定量PCR(qRT-PCR)和Western blotting試驗分別從mRNA和蛋白水平對PRSS35在牛卵泡GCs的表達(dá)進(jìn)行定量研究，通過免疫組織化學(xué)試驗對PRSS35蛋白在牛卵泡中的表達(dá)進(jìn)行定位分析；應(yīng)用基因沉默技術(shù)合成siRNA并轉(zhuǎn)染GCs，通過qRT-PCR和細(xì)胞凋亡檢測等觀察PRSS35對GCs增殖的影響，初步探明PRSS35與牛卵泡發(fā)育的關(guān)系，為進(jìn)一步揭示PRSS35及其家族蛋白在牛卵泡發(fā)育過程中的作用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及樣品采集

選取18月齡正常發(fā)情的海福特母牛，PGF2α同期發(fā)情處理后，B超超聲波監(jiān)測(每12 h 1次)并記錄卵泡大小變化，當(dāng)其中一個卵泡直徑增長率顯著高于其它卵泡時，即出現(xiàn)優(yōu)勢卵泡(dominant follicle, DF)，其它卵泡則為從屬卵泡(subordinate follicles, SF)。屠宰并采集雙側(cè)卵巢，分離DF和SF。本試驗3頭牛的DF和SF用于總RNA提取，另3頭 牛的DF和SF用于總蛋白提取，1頭牛的DF和SF用于免疫組織化學(xué)研究(以上材料均為課題組前期保存)；細(xì)胞培養(yǎng)用GCs采自山西省文水縣肉牛屠宰場。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA和總蛋白的提取 將分離的DF和SF分別置于滅菌DPBS中，用手術(shù)剪將卵泡剪開，刮刀輕刮卵泡內(nèi)壁并收集GCs。Trizol法提取總RNA，提取步驟按RNAiso Plus試劑盒說明書進(jìn)行；將GCs分別置于液氮預(yù)冷的研缽中研磨后，PMSF以1∶1 000比例制備RIPA裂解液提取總蛋白。測定總RNA和總蛋白濃度，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 RT-PCR 按照RT-PCR kit說明書合成cDNA鏈。采用兩步法，第1步：去除gDNA反應(yīng)，建立10 μL反應(yīng)體系：總RNA 1 μL，gDNA Eraser 1 μL，5×gDNA Eraser Buffer 2 μL，RNase Free dH2O定容至10 μL，充分混勻，置于PCR儀，42 ℃ 2 min；第2步：反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將EP管從PCR儀中取出，繼續(xù)加入PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 μL，RT Primer Mix 1 μL，5×PrimeScript Buffer Ⅱ 4 μL，RNase Free dH2O 4 μL，用手輕彈EP管使其混勻，置于PCR儀，37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 qRT-PCR檢測 根據(jù)NCBI上公布的牛PRSS35 mRNA序列(NM_001035457.3)和內(nèi)參基因RPLP0 mRNA序列(NM_001012682.1)，使用Primer 5.0設(shè)計引物(表1)。qRT-PCR引物跨越內(nèi)含子，引物跨越內(nèi)含子會避免基因組DNA的影響，從而提高試驗的準(zhǔn)確性。

qRT-PCR反應(yīng)體系20 μL，反應(yīng)條件： 95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃ 5 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，45個循環(huán)；熔解曲線分析：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。目的基因和內(nèi)參基因均在同一反應(yīng)條件下進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后測定CT值。

表1qRT-PCR引物序列

Table1PrimersofqRTPCR

基因名稱Gene symbol引物序列(5′→3′)Primer sequence退火溫度/℃Annealing temperaturePRSS35F:CCGACAGCAGGTTCAGCAT,R:AGTGGGCAGCGGTTAGGAC65RPLP0F:CAACCCTGAAGTGCTTGACAT,R:AGGCAGATGGATCAGCCA65

1.2.4 免疫組織化學(xué)檢測 分離后的DF和SF置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，經(jīng)脫水、浸蠟、包埋，制成6 μm厚的切片。按照SP Rabbit HRP Kit(DAB)說明書進(jìn)行操作，二甲苯脫蠟后梯度酒精水化；試劑A(endogenous peroxydase enzymes blocking buffer)室溫孵育10 min，PBS清洗；試劑B(normal goat serum for blocking)室溫孵育10 min，PBS清洗；試驗組滴加兔抗PRSS35(1∶100稀釋)，對照組滴加PBS作為對照，濕盒4 ℃過夜孵育14 h；37 ℃恒溫培養(yǎng)箱復(fù)溫30 min，PBS清洗；試劑C(goat anti-rabbit IgG)室溫孵育10 min，PBS清洗；試劑D(streptavidin-HRP)室溫孵育10 min，PBS清洗；DAB顯色10 min，蒸餾水沖洗；蘇木精復(fù)染40 s，蒸餾水沖洗；梯度酒精脫水，二甲苯透明；中性樹膠封片。利用Olympus光學(xué)顯微鏡觀察并采集圖像。

1.2.5 Western blotting檢測 根據(jù)SDS-PAGE Gel Kit說明書配置12%的分離膠和5%的濃縮膠，蛋白上樣緩沖液與蛋白樣品以1∶4比例混合，95 ℃ 5 min蛋白變性后，上樣至凝膠加樣孔，上樣量為20 μL。80 V 30 min濃縮膠電泳；120 V 50 min分離膠電泳。將目的條帶所在的膠條進(jìn)行割膠，與NC膜貼合，100 V 90 min，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜電泳。5%封閉蛋白干粉封閉90 min。一抗4 ℃孵育過夜14 h，試驗組PRSS35兔抗以1∶1 000稀釋，對照組一抗β-actin 兔多克隆抗體以1∶2 000稀釋，TBST清洗10 min，重復(fù)3次；二抗室溫孵育90 min，HRP-山羊抗兔IgG以1∶3 000稀釋，TBET清洗10 min，重復(fù)3次；NC膜涂發(fā)光液后凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光。

1.2.6 siRNA的設(shè)計與合成 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫已知的牛PRSS35基因序列(NM_001035457.3)，按照siRNA設(shè)計原則[14]，Invitrogen在線設(shè)計1對PRSS35基因的siRNA前體寡核苷酸序列，序列及陰性對照(siNC)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表2)。

表2siRNA前體寡核苷酸序列

Table2siRNAprecursoroligonucleotidesequence

基因名稱Gene symbol序列(5′→3′)SequencesiPRSS35 FGGAGCCAAGACAGUCUGAATTsiPRSS35 RUUCAGACUGUCUUGGCUCCTTsiNC FUUCUCCGAACGUGUCACGUTTsiNC RACGUGACACGUUCGGAGAATT

1.2.7 卵泡GCs細(xì)胞培養(yǎng)液配置 卵泡GCs細(xì)胞培養(yǎng)液選擇MEMα細(xì)胞培養(yǎng)液，配置方法：雙抗(青霉素100 000 IU·L-1，鏈霉素0.1 g·L-1)、兩性霉素B(1 mg·L-1)、HEPES(0.02 mol·L-1)、BSA(1 g·L-1)、NaHCO3(0.84 g·L-1)、NEAA(1.1 mg·L-1)、NaSeO3(40 μg·L-1)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(5 mg·L-1)、雄烯二酮(10-6mol·L-1)、牛胰島素(10 ng·mL-1)、胰島素樣生長因子(1 ng·mL-1)、FSH(25 ng·mL-1)，MEMα基礎(chǔ)培養(yǎng)液填至50 mL，充分混勻，4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.8 卵泡GCs體外培養(yǎng) 刮取GCs后，用細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞并離心，棄上清；將GCs接種于10 cm無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，補(bǔ)足細(xì)胞培養(yǎng)液至10 mL，輕晃培養(yǎng)皿，37 ℃，5%CO2進(jìn)行原代貼壁細(xì)胞培養(yǎng)。每48 h換一次培養(yǎng)液，當(dāng)觀察到細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿，進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.2.9 siRNA轉(zhuǎn)染卵泡顆粒細(xì)胞 選擇傳代至3代或4代的牛卵泡GCs接種于24孔板進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%～90%時，參照Lipofectamine?3000說明書步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染。培養(yǎng)48 h后熒光顯微鏡檢測。

1.2.10PRSS35基因沉默效果檢測 培養(yǎng)48 h后，取出24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，吸去部分GCs，無菌PBS清洗兩次，分別添加300 μL Trizol提取總RNA；qRT-PCR檢測沉默組(siPRSS35組)、陰性對照(siNC組)和空白對照組(Blank組)中PRSS35 mRNA的表達(dá)。

1.2.11 培養(yǎng)液E2濃度測定及細(xì)胞凋亡檢測 篩選PRSS35基因沉默效果檢測合格的培養(yǎng)組，應(yīng)用牛E2Elisa kit對培養(yǎng)液進(jìn)行E2濃度測定；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒對凋亡細(xì)胞進(jìn)行熒光染色，因細(xì)胞凋亡過程中細(xì)胞核DNA的非正常斷裂，可被熒光染料染色，從而可通過熒光顯微鏡觀察到凋亡的細(xì)胞。使用生物軟件ImageJ對凋亡細(xì)胞與總細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，計算凋亡細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比即為凋亡細(xì)胞百分率。

1.3 數(shù)據(jù)分析

qRT-PCR檢測結(jié)果采用△△CT法計算各目的基因的相對表達(dá)量，各基因的相對表達(dá)水平=2-△△CT；各基因表達(dá)量經(jīng)內(nèi)參基因RPLP0校正，分別設(shè)定PRSS35基因在SF和siNC組的表達(dá)量作為對照組；所有結(jié)果均采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，統(tǒng)計結(jié)果應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 總RNA凝膠電泳檢測

1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖1)，圖1中可清晰看出3條帶，分別為28S RNA、18S RNA、5S RNA?？俁NA的純度比較高，且完整性好，可用于qRT-PCR試驗。

圖1 總RNA瓊脂糖凝膠電泳
Fig.1 Electrophoresis pattern of total RNA

2.2 牛卵泡GCs中PRSS35 mRNA表達(dá)差異分析

牛卵泡GCs qRT-PCR分析結(jié)果顯示(圖2)，PRSS35基因在牛DF中的表達(dá)量是SF的10.69倍(P<0.001)。

**. P<0.001，下同
**. P<0.001,the same as below
圖2 PRSS35基因在牛DF和SF中的表達(dá)
Fig.2 qRT-PCR analysis of PRSS35 mRNA expression in bovine DF and SF

2.3 牛卵泡GCs中PRSS35蛋白表達(dá)差異分析

Western blotting對PRSS35在牛DF與SF顆粒細(xì)胞中表達(dá)量進(jìn)行對比分析，并與內(nèi)參蛋白β-actin進(jìn)行比較，從圖3A可見，PRSS35在DF中的條帶較粗較濃；對蛋白印跡進(jìn)行灰度值分析顯示，PRSS35在DF中的表達(dá)量極顯著高于SF(P<0.01)(圖3B)，該結(jié)果與qRT-PCR對PRSS35 mRNA的分析結(jié)果相一致。

2.4 PRSS35在牛卵巢DF和SF中的免疫組織化學(xué)定位分析

免疫組化分析表明，PRSS35在牛卵巢DF和SF均有表達(dá)(圖4A, B, C)，對照組無特異性顯色(圖4a, b, c)；且PRSS35在牛卵巢DF和SF的顆粒層、膜細(xì)胞層均有表達(dá)。

2.5 牛卵泡顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果檢測

設(shè)計并合成的前體寡核苷酸序列siPRSS35和siNC帶有綠色熒光標(biāo)記，轉(zhuǎn)染48 h，熒光顯微鏡檢測表明，與對照組相比，可明顯觀察到綠色熒光(圖5)。

利用qRT-PCR方法對轉(zhuǎn)染siRNA 48 h后PRSS35基因在沉默組、陰性對照組(siNC)以及空白對照組中的表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，PRSS35基因在沉默組的表達(dá)量極顯著低于陰性對照組和空白對照組(P<0.001)，陰性對照組和空白對照組間無顯著差異(圖6)。

2.6 培養(yǎng)液E2濃度檢測

ELISA法檢測培養(yǎng)液E2濃度結(jié)果表明，沉默組E2濃度極顯著低于陰性對照組和空白對照組(P<0.01)，陰性對照組和空白對照組間無顯著差異(圖7)。

*. P<0.01， 下同
*. P<0.01， the same as below
圖3 PRSS35蛋白在牛DF與SF中的Western blotting檢測(A)與灰度值分析(B)
Fig.3 Western blotting bands (A) and grey value analysis (B) of PRSS35 protein in bovine DF and SF

GC.顆粒層；TC.膜細(xì)胞層
GC.Granulosa cells; TC.Theca cells
圖4 卵巢組織PRSS35 的表達(dá)(免疫組化, 400×)
Fig.4 Expressions of PRSS35 in the ovary (immunohistochemistry, 400×)

2.7 牛卵泡顆粒細(xì)胞凋亡檢測

TUNEL細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果顯示，空白對照組、陰性對照組細(xì)胞凋亡數(shù)明顯低于沉默組(圖8)；凋亡細(xì)胞百分率分析結(jié)果顯示，沉默組凋亡細(xì)胞百分率極顯著高于空白對照組和陰性對照組(P<0.001)，空白對照組和陰性對照組間無顯著差異(圖9)。

圖5 siPRSS35和siNC轉(zhuǎn)染效果圖(40×)
Fig.5 Transfection effect of siPRSS35 and siNC(40×)

圖6 轉(zhuǎn)染siRNA 48 h牛顆粒細(xì)胞PRSS35 mRNA的表達(dá)
Fig.6 Expression of PRSS35 mRNA at 48 h after siRNA transfection

圖7 細(xì)胞培養(yǎng)液中E2濃度
Fig.7 The E2concentration in cell culture media

圖8 細(xì)胞凋亡檢測情況(40×)
Fig.8 Cell apoptosis detection(40×)

圖9 顆粒細(xì)胞凋亡率分析
Fig.9 Apoptosis rate analysis of GCs

3 討 論

雌性哺乳動物生殖系統(tǒng)的獨特之處在于每次發(fā)情周期都進(jìn)行著快速、廣泛的組織重構(gòu)，其中卵泡生長、排卵以及黃體的形成與退化均受蛋白的嚴(yán)格調(diào)控[15-16]。牛卵泡生長發(fā)育過程會受到諸如激素類物質(zhì)、生長因子與細(xì)胞因子以及一些重要基因與蛋白的調(diào)控[2-5]。PRSS35是絲氨酸蛋白酶家族成員之一，作為蛋白水解酶在生物體內(nèi)發(fā)揮重要作用。PRSS35首次發(fā)現(xiàn)于小鼠卵巢[8]，有研究顯示，PRSS35在小鼠卵泡的發(fā)育、排卵過程以及黃體的形成與退化中發(fā)揮作用[7-8,10]。

單胎動物牛在發(fā)情周期中，一般會出現(xiàn)2～3個卵泡波[17]，當(dāng)卵泡波發(fā)生偏差時，一個卵泡會被選擇為DF繼續(xù)生長，直到卵巢上發(fā)生黃體溶解，導(dǎo)致孕酮的分泌減少，隨后的LH脈沖頻率增加，出現(xiàn)一個LH峰，引起LH/FSH的激增，進(jìn)而發(fā)生排卵反應(yīng)[18]，其余卵泡均為SF，則停止生長直至閉鎖。本試驗通過B超超聲波確定并成功分離牛DF與SF，qRT-PCR和Western blotting結(jié)果顯示，牛DF顆粒細(xì)胞中PRSS35在mRNA和蛋白水平表達(dá)均極顯著高于SF(P<0.01)；免疫組化結(jié)果顯示PRSS35蛋白在牛卵泡的DF與SF顆粒層均有表達(dá)。GCs作為卵泡中對卵母細(xì)胞有營養(yǎng)作用與重要調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞，其增殖與分化常作為卵泡發(fā)育的標(biāo)志[19]。

本試驗成功設(shè)計PRSS35 siRNA干擾序列，轉(zhuǎn)染GCs，通過細(xì)胞培養(yǎng)液E2濃度測定與細(xì)胞凋亡計數(shù)來研究PRSS35的功能。E2的分泌能力是卵泡的一個重要特征[20]，而E2由卵泡GCs分泌生成，GCs凋亡個數(shù)增多時，E2分泌能力會顯著下降，卵泡閉鎖的最主要原因是GCs的凋亡[21]。如果觀察到一個發(fā)育卵泡中有10%以上的顆粒細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡，表明該卵泡已經(jīng)或正在閉鎖，且卵泡一旦進(jìn)入閉鎖就不能再回到正常的發(fā)育軌道上。因此當(dāng)E2分泌能力喪失時即發(fā)生卵泡閉鎖[22]。Fortune[23]對牛 發(fā)情周期內(nèi)各卵泡E2的濃度大小進(jìn)行了比較分析，發(fā)現(xiàn)在發(fā)情周期的第5天，DF卵泡液中E2濃度比第3天募集卵泡的濃度要高得多，而第5天的SF卵泡液中E2濃度與第3天的募集卵泡相似。當(dāng)發(fā)生偏差，檢測到DF略大于最大SF時，其卵泡液中的E2濃度更高，GCs會分泌更多的E2。DF是與SF相比具有更大的E2分泌能力[24]。因此DF中GCs會繼續(xù)增殖分化，并通過E2的分泌來維持DF的繼續(xù)生長發(fā)育，為最終的卵泡排卵提供生理基礎(chǔ)；而SF中GCs會停止生長，細(xì)胞逐步凋亡，最終造成卵泡閉鎖。細(xì)胞培養(yǎng)液中添加的FSH會促進(jìn)卵泡GCs增殖與E2的分泌，F(xiàn)SH與GCs上受體結(jié)合，通過cAMP信號途徑激活芳香化酶從而使得雄烯二酮轉(zhuǎn)化為E2的能力增強(qiáng)。GCs上不光有FSH受體，也有胰島素受體。在培養(yǎng)液中添加胰島素可以增強(qiáng)FSH對芳香化酶的刺激作用，增加E2分泌量[25]。沉默PRSS35基因后，可觀察到GCs凋亡個數(shù)與E2濃度的同步降低，說明PRSS35對GCs的增殖分化起促進(jìn)作用，在牛卵泡發(fā)育過程中起促進(jìn)作用。

4 結(jié) 論

PRSS35在牛DF和SF差異表達(dá)，PRSS35基因沉默后，通過抑制牛卵泡GCs增殖，降低卵泡E2分泌，從而調(diào)控牛卵泡的生長發(fā)育。