孫 曄，曾梓菡，賈璨燦，寧彩波，吳望軍，趙 芳*，劉紅林*

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，南京 210095； 2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 動(dòng)物遺傳育種研究室，南京 210095)

現(xiàn)代集約化動(dòng)物生產(chǎn)過(guò)程中難以避免應(yīng)激的發(fā)生[1-2]。應(yīng)激是指動(dòng)物機(jī)體對(duì)威脅自身穩(wěn)態(tài)事件所產(chǎn)生的一系列生物反應(yīng)。應(yīng)激發(fā)生后，機(jī)體下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA)系統(tǒng)被激活，下丘腦釋放促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(corticotropin releasing hormone，CRH)，CRH促使垂體釋放促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotropic hormone，ACTH)，ACTH作用于腎上腺皮質(zhì)，上調(diào)皮質(zhì)醇等腎上腺皮質(zhì)類(lèi)激素的分泌，從而調(diào)動(dòng)機(jī)體各個(gè)組織器官應(yīng)對(duì)外界刺激[3-4]。在豬生產(chǎn)中，應(yīng)激被認(rèn)為是損害豬生產(chǎn)性能的主要因素[5-6]。斷奶或環(huán)境因素產(chǎn)生的應(yīng)激會(huì)影響豬的采食量，降低豬日增重和飼料轉(zhuǎn)化率，造成豬生長(zhǎng)緩慢[7-8]。熱應(yīng)激會(huì)破壞豬的腸道屏障功能，降低部分消化酶活性，影響腸道微生物菌群平衡[9]。運(yùn)輸應(yīng)激引起豬緊張不安，導(dǎo)致體溫升高，降低豬肉品質(zhì)[10]。除了對(duì)生長(zhǎng)性能的影響，應(yīng)激還會(huì)損害動(dòng)物的免疫系統(tǒng)。研究發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激后豬血清中細(xì)胞炎癥因子IL-2、IFN-γ及TNF-α水平改變，機(jī)體的細(xì)胞免疫功能被抑制[11]。運(yùn)輸后豬的血清總蛋白下降，抗體生成減少，極易發(fā)生腹瀉或呼吸道疾病甚至猝死[12-13]。對(duì)于生產(chǎn)母豬，溫度升高會(huì)降低母豬的采食量及泌乳量，進(jìn)而降低母豬體重，影響仔豬生長(zhǎng)速率[14]。此外，應(yīng)激會(huì)嚴(yán)重影響母豬的繁殖性能。應(yīng)激導(dǎo)致母豬體內(nèi)激素分泌紊亂，使母豬卵巢卵泡發(fā)育受阻、排卵減少，延遲母豬斷奶后發(fā)情，嚴(yán)重時(shí)會(huì)誘發(fā)卵巢囊腫，增加母豬繁殖障礙的幾率，給養(yǎng)殖場(chǎng)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[15-17]。因此，研究應(yīng)激反應(yīng)的作用機(jī)制對(duì)了解豬的應(yīng)激損傷意義重大。

血液中皮質(zhì)醇濃度升高是衡量應(yīng)激發(fā)生的重要指標(biāo)。皮質(zhì)醇刺激脂解和糖質(zhì)新生，增加血糖供應(yīng)，為機(jī)體應(yīng)激應(yīng)答提供更多的能量[18]。外源ACTH注射顯著增加血液皮質(zhì)醇水平，上調(diào)血糖水平，模擬應(yīng)激的發(fā)生[19]。作為血糖來(lái)源的主要器官，肝中存在與糖原合成、糖原分解、糖酵解、糖異生、磷酸戊糖途徑等糖代謝相關(guān)的酶類(lèi)，它們的表達(dá)及活性是決定葡萄糖代謝正常進(jìn)行的關(guān)鍵因素[20-22]。盡管近年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)豬應(yīng)激的研究取得了一定的進(jìn)展，但應(yīng)激對(duì)血糖指標(biāo)變化的作用機(jī)理還有待進(jìn)一步探討。

為了明確應(yīng)激引起的高皮質(zhì)醇水平對(duì)母豬肝血糖調(diào)控機(jī)制的影響，本試驗(yàn)對(duì)母豬注射促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)，通過(guò)檢測(cè)母豬肝中糖代謝相關(guān)酶類(lèi)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)及酶活性，解析應(yīng)激對(duì)肝血糖調(diào)控的影響機(jī)制，為進(jìn)一步了解應(yīng)激對(duì)母豬生產(chǎn)性能的影響提供一定的理論和試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)?zāi)肛i由江蘇淮陰種豬場(chǎng)提供。選取9頭，體重為(185±25) kg的健康經(jīng)產(chǎn)斷奶蘇淮母豬，產(chǎn)后40天斷奶，隨機(jī)分成處理組(5頭)和對(duì)照組(4頭)。 斷奶當(dāng)天對(duì)母豬進(jìn)行頸靜脈插管手術(shù)，斷奶后第2天開(kāi)始試驗(yàn)(試驗(yàn)的第1天)。處理組于每天的8:00、16:00、24:00時(shí)(間隔8 h)分別注射1 IU·kg-1ACTH，同時(shí)給對(duì)照組受試母豬注射等量生理鹽水，連續(xù)注射7 d。試驗(yàn)?zāi)肛i自由采食、飲水，于試驗(yàn)第8天進(jìn)行屠宰取樣。

1.2 試劑

ACTH(A6303)購(gòu)自Sigma公司；Trizol購(gòu)自Invitrogen公司；M-MLV Reverse Transcriptase、SYBR Premix Ex Taq TM購(gòu)自TaKaRa公司；皮質(zhì)醇放射免疫分析試劑盒購(gòu)自北京北方生物公司。葡萄糖代謝相關(guān)酶活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自索萊寶科技有限公司，具體貨號(hào)： 6-磷酸葡萄糖脫氫酶(BC0260)、丙酮酸激酶(BC0540)、己糖激酶(BC0740)、糖原磷酸化酶(BC3340)、糖原合成酶(BC3330)、丙酮酸羧化酶(BC0730)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(BC3310)、果糖-1,6-二磷酸酶(BC0920)、葡萄糖-6-磷酸酶(BC3320)、果糖-6-磷酸激酶(BC0530)。

1.3 樣品采集

每天采用一次性負(fù)壓采血管(含肝素鈉)由頸靜脈插管采血10 mL。所有血液樣品經(jīng)3 000 r·min-1離心 10 min，分離血漿，于-20 ℃中保存，用于血糖和皮質(zhì)醇水平的測(cè)定。試驗(yàn)?zāi)肛i屠宰后，迅速采集肝組織，置于液氮中凍存。

1.4 血糖及皮質(zhì)醇測(cè)定

將分離的待測(cè)血漿送至南京市軍區(qū)總醫(yī)院，利用全自動(dòng)生化分析儀對(duì)血糖(GLU)進(jìn)行檢測(cè)分析；采用放射免疫法測(cè)定血漿皮質(zhì)醇濃度。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

根據(jù)NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中相應(yīng)基因mRNA的全序列，利用Primer premier5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物由金唯智生物公司合成(引物序列見(jiàn)表1)。Trizol 法提取肝樣品中的總RNA,紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA質(zhì)量和濃度，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：2×SYBR Premix Ex Taq 10 μL， 上下游引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 6.8 μL，總體積20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min； 95 ℃變性10 s，62 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，40個(gè)循環(huán)。被檢樣品均重復(fù)3次，取平均值；以GAPDH作為內(nèi)參基因，利用2- △△Ct法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量[23]，△Ct = Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因；△△Ct=(Ct處理組目的基因-Ct處理組內(nèi)參基因)-(Ct對(duì)照組目的基因-Ct對(duì)照組內(nèi)參基因)，2-△△Ct表示處理組目的基因的表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組的變化倍數(shù)。

1.6 葡萄糖代謝相關(guān)酶類(lèi)活性測(cè)定

根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)，取適量肝組織，按照組織質(zhì)量(g)∶提取液體積(mL)為1∶(5～10)的比例，冰浴勻漿；于8 000 g 4 ℃離心10 min，取上清，置冰上；分光光度計(jì)波長(zhǎng)設(shè)置為340 nm，用蒸餾水調(diào)零，加樣檢測(cè)葡萄糖代謝相關(guān)酶活性。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，利用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析試驗(yàn)組與對(duì)照組之間的差異；*表示處理組與對(duì)照組比較差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。

2 結(jié) 果

2.1 ACTH處理對(duì)母豬血液皮質(zhì)醇濃度及血糖水平的影響

母豬血液皮質(zhì)醇濃度變化如圖1所示。試驗(yàn)第1天，ACTH處理組母豬血液皮質(zhì)醇濃度急劇升高，組間差異極顯著(P<0.01)；試驗(yàn)第1到第4天，ACTH處理組皮質(zhì)醇濃度下降，但仍顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；試驗(yàn)第4到第7天，處理組皮質(zhì)醇濃度穩(wěn)定，處理組與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)。試驗(yàn)期間，對(duì)照組母豬血液中皮質(zhì)醇濃度穩(wěn)定，沒(méi)有顯著變化。

母豬血糖水平變化如圖2所示，試驗(yàn)期間處理組血糖水平均高于對(duì)照組，且同一時(shí)間段組間差異均達(dá)顯著水平(P<0.05)。

表1實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物列

Table1Primersforthereal-timequantitativePCRassay

基因Gene引物對(duì)序列(5′→3′)Sequence of primerNCBI登錄號(hào)NCBI accession No.PYGLF: CATCGTGAAGACCCAAGTATR:GCCCAGGAAGTGGTGTAGNM_001123172.1GYS1F:CTATGTGCTGGTGCTGTGGAR:CTCCATGCAGTAGCGGTGATNM_001195508.1GYS2F:ATGTCACCGTGGTGGTGTTTR:GCTGAGGATGGGATCAGTGGNM_001195511.1HK1F:GTGAAGCTGCTTGAGAAAGCCR:TTGATGCACATCCTGCCCTCNM_001243184.1HK2F: AGATGATCGCCTCGCATCTGR: GCTCCAAGCCCTTTCTCCATNC_010445.3HK3F: CCAGTTGCTACGAGATGCCAR:GGTGTCTACAACCAGCCCAANC_010444.3PFKLF:GGCCCAGACTTACTCACACCR:TCGATGACCTCCATGATGCGXM_013990207PKLRF:CTTCCCTGTGCTCTACCGTGR:CCACGGAGTTTTCCGCTTTCXM_005663320.1G6PCF:TCGGTGCCACTGATAAAGCR:GGGAAATGAGCAGCAAGGTNM_001113445.1FBPF:ATCCTCCAACATCGACTGCCR:ACTAGGGTCGCACTTCCGTANM_001167632.2PCF:CTGGCTACGGGTTCCTGTCCR:CCACCTTGTCTCCCATCTTGCNM_214349.1PCK1F:ATCCGACCTTCCTTGACCATR:TCAGCCTCTTGATGACACCCNM_001123158.1PCK2F:ATGGCGACTTCGTCAAGTGTR:CCGAAAGAGACGATCTCCCGXM_005666229.1GRF:CTCAGCAGCAACGGGACCACR:TGAAGACACTTTCTGTAGCGGCATNM_001008481.1β-actinF: CCTGGACTTCGAGCAGGAGATGGR: TGTCGGCGATGCCTGGGTAXM_003124280.4

F.上游引物；R.下游引物

F.Forward primer; R. Reverse primer

*表示處理組與對(duì)照組比較差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。下圖同
* indicate significant difference (P<0.05), ** indicate extremely significant difference (P<0.01) between treatment and control groups. The same as the following figures
圖1 ACTH處理對(duì)母豬血液中皮質(zhì)醇濃度的影響
Fig.1 Effects of ACTH-treatment on concentrations of cortisol in the blood of sows

2.2 ACTH處理對(duì)母豬肝中糖代謝相關(guān)酶類(lèi)轉(zhuǎn)錄活性的影響

母豬肝糖異生相關(guān)酶類(lèi)mRNA表達(dá)水平如圖3所示。對(duì)照組與處理組母豬肝中丙酮酸羧化酶(PC)、果糖-1,6-二磷酸酶(FBP)及磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶2(PCK2)的mRNA表達(dá)水平差異不顯著(P>0.05)。與對(duì)照組相比，ACTH處理組母豬肝中葡萄糖-6-磷酸酶(G6PC)及磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1(PCK1)的mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05)。

分析ACTH處理對(duì)母豬肝中糖酵解相關(guān)酶類(lèi)mRNA表達(dá)的影響，結(jié)果如圖4所示。母豬肝中磷酸果糖激酶(PFKL)、丙酮酸激酶(PKLR)、己糖激酶1(HK1)和己糖激酶3(HK3)的mRNA表達(dá)水平在兩組間差異不顯著(P>0.05)。但是，處理組母豬肝中己糖激酶2(HK2) mRNA表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

分析ACTH處理對(duì)母豬肝中糖原合成、分解及戊糖磷酸途徑相關(guān)酶類(lèi)mRNA表達(dá)的影響，結(jié)果如圖5所示。與對(duì)照組相比，處理組母豬肝中糖原合成酶1(GYS1)、糖原磷酸化酶(PYGL)及6-磷酸葡萄糖脫氫酶(G6PD)的mRNA表達(dá)水平呈上升趨勢(shì)，但兩組間差異均不顯著(P>0.05)。

2.3 ACTH處理對(duì)母豬肝中葡萄糖代謝相關(guān)酶活性的影響

ACTH處理對(duì)母豬肝中葡萄糖代謝相關(guān)酶類(lèi)活性的影響如圖6所示。處理組母豬肝中丙酮酸羧化酶(PC)、果糖-1,6-二磷酸酶(FBP)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PCK)的活性與對(duì)照組相比差異不顯著(P>0.05)。處理組母豬肝中葡萄糖-6-磷酸酶(G6PC)的活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，磷酸果糖激酶(PFKL)的活性顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。此外，丙酮酸激酶(PKLR)、己糖激酶(HK)、糖原合成酶(GYS)、糖原磷酸化酶(PYGL)及6-磷酸葡萄糖脫氫酶(G6PD)活性在兩組間的差異均不顯著(P>0.05)。

圖2 ACTH處理對(duì)母豬血糖水平的影響
Fig.2 Effects of ACTH-treatment on levels of glucose in the blood of sows

2.4 ACTH處理對(duì)母豬肝中糖皮質(zhì)激素受體mRNA表達(dá)的影響

檢測(cè)處理組與對(duì)照組母豬肝中糖皮質(zhì)激素受體(GR) mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果顯示,處理組GR水平呈上調(diào)趨勢(shì)，但兩組間差異不顯著(P>0.05)(圖7)。

3 討 論

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)母豬注射促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)模擬應(yīng)激發(fā)生，分析應(yīng)激對(duì)母豬肝血糖調(diào)控的影響機(jī)制。試驗(yàn)第1天，處理組皮質(zhì)醇濃度急劇升高，隨著試驗(yàn)持續(xù)進(jìn)行，皮質(zhì)醇濃度略有下降，這可能與皮質(zhì)醇對(duì)HPA軸的反饋調(diào)節(jié)有關(guān)。對(duì)照組皮質(zhì)醇濃度保持平穩(wěn)，說(shuō)明注射處理本身沒(méi)有對(duì)動(dòng)物造成應(yīng)激反應(yīng)。試驗(yàn)期間處理組母豬皮質(zhì)醇濃度一直顯著高于對(duì)照組，且處理組血糖水平明顯高于對(duì)照組，均反映處理組母豬處于應(yīng)激狀態(tài)，應(yīng)激模型建立成功。

血糖是體內(nèi)代謝過(guò)程中的重要物質(zhì)，與部分血脂指標(biāo)及脂肪沉積性狀存在顯著相關(guān)性[24]，可以反映機(jī)體能量變化。肝糖異生是肝糖代謝的重要組成部分，機(jī)體近一半葡萄糖的供應(yīng)依賴(lài)于糖異生作用[25]。糖異生的速度與編碼糖異生途徑限速酶的基因表達(dá)有關(guān)[26-27]。本試驗(yàn)中，處理組肝母豬肝中糖異生途徑的關(guān)鍵酶葡萄糖-6-磷酸酶(G6PC)及磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PCK1、PCK2)的mRNA表達(dá)水平均上調(diào)，且葡萄糖-6-磷酸酶(G6PC)的酶活性明顯上升，表明ACTH處理引起的高濃度皮質(zhì)醇可能通過(guò)糖異生途徑中的限速酶葡萄糖-6-磷酸酶及磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶加速肝中糖異生速度，提高血液中葡萄糖濃度。糖酵解是機(jī)體內(nèi)分解葡萄糖供能的必經(jīng)途徑，酵解過(guò)程有3步反應(yīng)為不可逆反應(yīng)，催化這3步反應(yīng)的酶是己糖激酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶，其中磷酸果糖激酶是糖酵解反應(yīng)的限速酶[28-30]。

圖3 ACTH處理對(duì)母豬肝糖異生相關(guān)酶類(lèi)mRNA表達(dá)的影響
Fig.3 Effects of ACTH-treatment on mRNA expression of enzymes related to gluconeogenesis in the liver of sows

圖4 ACTH處理對(duì)母豬肝糖酵解相關(guān)酶類(lèi)mRNA表達(dá)的影響
Fig.4 Effects of ACTH-treatment on mRNA expression of enzymes related to glycolysis in the liver of sows

圖5 ACTH處理對(duì)母豬肝糖原合成、分解及戊糖磷酸途徑相關(guān)酶類(lèi)mRNA表達(dá)的影響
Fig.5 Effects of ACTH-treatment on mRNA expression of enzymes related to glycogen synthesis, breakdown and pentose phosphate pathway in the liver of sows

圖6 ACTH處理對(duì)母豬肝中葡萄糖代謝相關(guān)酶活性的影響
Fig.6 Effects of ACTH-treatment on activity of enzymes related to glucose metabolism in the liver of sows

圖7 ACTH處理對(duì)母豬肝中糖皮質(zhì)激素受體mRNA表達(dá)的影響
Fig.7 Effects of ACTH-treatment on mRNA expression of glucocorticoid receptor in the liver of sows

本試驗(yàn)中，處理組肝己糖激酶2(HK2)mRNA表達(dá)上調(diào)；己糖激酶1(HK1)、丙酮酸激酶(PKLR)的mRNA表達(dá)水平呈下調(diào)趨勢(shì)。在正常生理狀態(tài)下，低濃度血糖會(huì)激起肝中丙酮酸激酶的磷酸化，使其活性降低，降低肝中葡萄糖的利用[31]。本研究中，ACTH處理下調(diào)丙酮酸激酶的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，降低磷酸果糖激酶的酶活性，暗示應(yīng)激抑制豬肝中的糖酵解，進(jìn)而抑制肝中葡萄糖的利用。糖原是葡萄糖的一種高效能的貯存形式，糖原的存在保證了機(jī)體最需能量供應(yīng)的腦和肌肉緊張活動(dòng)時(shí)對(duì)能量的需要，同時(shí)也保證不間斷地供給恒定水平的血糖[32-33]。肝是機(jī)體貯存糖原的器官，本研究中，ACTH處理沒(méi)有顯著影響肝中糖原合成酶1(GYS1)的mRNA表達(dá)，此外參與糖原分解的糖原磷酸化酶(PYGL)及參與磷酸戊糖途徑的關(guān)鍵酶6-磷 酸葡萄糖脫氫酶(G6PD) 的mRNA表達(dá)均未發(fā)生顯著變化，暗示ACTH處理未影響肝中糖原合成、糖原分解及磷酸戊糖途徑。

皮質(zhì)醇主要通過(guò)與糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合發(fā)揮其生物學(xué)作用[34-35]，為分析ACTH處理是否影響母豬肝中糖皮質(zhì)激素受體GR的表達(dá)，本研究分析了兩組母豬肝中糖皮質(zhì)激素受體mRNA的表達(dá)差異，結(jié)果顯示，處理組豬肝中糖皮質(zhì)激素受體水平呈上調(diào)趨勢(shì)，但差異未達(dá)顯著水平；這一結(jié)果暗示，ACTH處理對(duì)母豬肝中糖代謝相關(guān)酶類(lèi)轉(zhuǎn)錄活性的影響可能依賴(lài)于GR之外的其它途徑，具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究探討。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)通過(guò)ACTH處理模擬豬生產(chǎn)中應(yīng)激的發(fā)生，致使母豬皮質(zhì)醇濃度升高，其導(dǎo)致血糖水平升高的可能作用機(jī)制：一方面通過(guò)上調(diào)肝中磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶和葡萄糖-6-磷酸酶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，增強(qiáng)糖異生作用；另一方面，通過(guò)下調(diào)肝中磷酸果糖激酶的活性，抑制糖酵解反應(yīng)，降低葡萄糖利用。但ACTH處理不影響肝中磷酸戊糖途徑、糖原合成及分解；且ACTH處理未影響母豬肝中糖皮質(zhì)激素受體的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，提示ACTH處理對(duì)母豬肝中糖代謝相關(guān)酶類(lèi)轉(zhuǎn)錄活性的影響可能依賴(lài)于GR之外的其它途徑。