梁 圣,趙新新,2,3*,程安春,2,3*

(1. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)研究所，成都 611130；2. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院禽病防治研究中心，成都 611130；3. 動(dòng)物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 611130)

多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida)是一種重要的畜禽病原菌，隸屬于巴氏桿菌科、巴氏桿菌屬多殺亞種[1]。其宿主譜廣泛，可引起多種動(dòng)物(如鴨、雞、火雞、牛、豬)的接觸性傳染病[2]。人們依據(jù)多殺性巴氏桿菌不同的表面抗原將其劃分為不同的血清型：根據(jù)莢膜類型可分為A、B、D、E、F 5個(gè)型，根據(jù)脂多糖(LPS)抗原的不同分為1～16個(gè)型[3-4]。不同血清型的宿主嗜性是不同的，比如牛出血性敗血癥的病原菌血清型一般是B:2和E:5，D血清型的菌株主要引起豬萎縮性鼻炎，而禽霍亂主要由血清型A:1、A:3和A:4的菌株引起[5]。普遍認(rèn)為，呼吸道是禽多殺性巴氏桿菌入侵宿主的主要途徑，細(xì)菌首先入侵、定殖于上呼吸道的黏膜，然后擴(kuò)散到氣囊和肺，最終通過(guò)某種途徑(可能是黏膜巨噬細(xì)胞)進(jìn)入血液循環(huán)并遷移至肝、脾等實(shí)質(zhì)器官，引發(fā)系統(tǒng)性疾病[6]。禽霍亂的感染會(huì)導(dǎo)致火雞、雞、鴨、鵝等禽類的高發(fā)病率和高死亡率，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。病原體能夠在宿主體內(nèi)持續(xù)存在[7]，污染飼養(yǎng)環(huán)境，給養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展和公共衛(wèi)生安全造成嚴(yán)重威脅。

目前我國(guó)針對(duì)禽霍亂的治療主要依賴于抗生素，但隨著抗生素耐藥和殘留問(wèn)題日趨嚴(yán)重，發(fā)展安全、高效的禽霍亂疫苗成為疾病防控的迫切需求。目前預(yù)防該病的商品化疫苗包括油乳劑滅活疫苗、減毒CU疫苗等，然而均存在一些缺陷。油乳劑滅活苗的免疫保護(hù)期短暫，并且容易在注射部位引起不良反應(yīng)，而自然篩選的減毒苗為經(jīng)驗(yàn)性研制，其基因背景不清楚，毒力返強(qiáng)的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生[8]。隨著多殺性巴氏桿菌的致病機(jī)制和免疫學(xué)的發(fā)展，多種毒力因子和保護(hù)性抗原被逐漸揭示，與之相關(guān)的減毒疫苗、亞單位疫苗、DNA疫苗得到發(fā)展。本文概述幾種近年來(lái)禽霍亂新型疫苗的研究進(jìn)展，旨在為研制高效、安全的疫苗提供參考。

1 新型減毒疫苗

滅活苗通常提供的交叉保護(hù)力不足，而多殺性巴氏桿菌血清型眾多，在實(shí)際應(yīng)用中常發(fā)生免疫失敗。為了解決這一現(xiàn)實(shí)問(wèn)題，人們轉(zhuǎn)向研究交叉免疫更具潛力的減毒疫苗。制備減毒疫苗首要條件是高度減毒，由于技術(shù)受限，早期的減毒疫苗一般是通過(guò)篩選自然減毒株或化學(xué)誘變減毒而制成的。在20世紀(jì)70年代，來(lái)自Clemson University的Bierer和Derieux[9]從火雞禽霍亂的病例中分離到一株血清3型的多殺性巴氏桿菌減毒株，并將該減毒株通過(guò)飲水免疫火雞，發(fā)現(xiàn)該菌株能幫助火雞預(yù)防禽霍亂的發(fā)生。之后經(jīng)研究該菌株被優(yōu)化為CU疫苗，這是第一個(gè)被廣泛應(yīng)用的禽霍亂活疫苗。Hertman等[10]用化學(xué)物質(zhì)亞硝基胍誘導(dǎo)突變血清Ⅰ型菌株，得到無(wú)毒力菌株M3G，將M3G免疫火雞后能抵抗同源菌株和血清3型菌株的感染。但這類疫苗存在使疾病暴發(fā)的潛在風(fēng)險(xiǎn)，其安全性不容忽視[11]。

隨著分子生物學(xué)和DNA重組技術(shù)的發(fā)展，對(duì)禽多殺性巴氏桿菌基因進(jìn)行改造的減毒方法日益受到人們的推崇。其中aroA基因便是典型例子，該基因所編碼的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶參與催化合成芳香族氨基酸的中間反應(yīng)。由于脊椎動(dòng)物不具備該合成途徑，因此ΔaroA缺失株在宿主體內(nèi)因缺乏重要氨基酸而毒力減弱[12]。1997年，Homchampa等[13]通過(guò)無(wú)痕缺失構(gòu)建的ΔaroA缺失株在小鼠上高度減毒，并且該缺失株能夠針對(duì)致死劑量的野毒感染為免疫動(dòng)物提供完全保護(hù)。之后，Scott等[14]同時(shí)構(gòu)建了血清1型和血清3型的ΔaroA缺失株，分別將106CFU和108CFU的兩種缺失株肌肉途徑免疫雞后，發(fā)現(xiàn)免疫動(dòng)物能夠完全抵御107CFU野毒的呼吸道感染。其免疫試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同的接種方式會(huì)影響免疫保護(hù)效果。在比較了肌內(nèi)注射、氣管內(nèi)注射、口服幾種免疫方式之后，發(fā)現(xiàn)口服免疫的動(dòng)物存活率最低，肌內(nèi)注射、氣管內(nèi)注射方式所提供的免疫保護(hù)較好?？赡艿臋C(jī)制是，與消化道途徑相比，呼吸道作為多殺性巴氏桿菌的天然感染途徑能最大化地激發(fā)毒力相關(guān)抗原的表達(dá)，而肌肉途徑能使抗原相對(duì)緩慢地釋放。

除了像缺失aroA這樣的代謝基因達(dá)到減毒的目的，還可以通過(guò)改造細(xì)菌的毒力因子(如莢膜、脂多糖)來(lái)實(shí)現(xiàn)減毒。一些研究者在進(jìn)行菌株的分離與鑒定時(shí)發(fā)現(xiàn)莢膜A型菌株常導(dǎo)致禽霍亂，于是莢膜參與多殺性巴氏桿菌發(fā)病機(jī)制的猜測(cè)就產(chǎn)生了。Chung等[15]在對(duì)莢膜合成位點(diǎn)的核酸序列進(jìn)行分析后，將四環(huán)素抗性基因插入到莢膜多糖輸出蛋白基因hexA的序列中，使其失活，從而構(gòu)建了血清型A:1菌株ΔhexA突變株。該菌株在雞上完全減毒，將其通過(guò)肌內(nèi)注射免疫自然宿主雞，發(fā)現(xiàn)它能夠提供高水平的同源保護(hù)效力[16]。透明質(zhì)酸是A型莢膜的主要組成成分，但也普遍存在于禽類和哺乳類的組織里，因此其免疫原性很弱。莢膜缺失使細(xì)菌的抗原更有效地暴露，從而使宿主獲得免疫保護(hù)，這可能是莢膜缺失株提供免疫保護(hù)的機(jī)制之一。國(guó)內(nèi)的禽多殺性巴氏桿菌的血清型多以A:1、A:3為主，這種缺失莢膜的減毒策略對(duì)于我國(guó)研制活疫苗具有很好的參考價(jià)值[17-18]。

如同其他革蘭陰性菌的LPS，多殺性巴氏桿菌的LPS具有內(nèi)毒素活性，其結(jié)構(gòu)變化直接影響著細(xì)菌的存活與毒力。當(dāng)缺失了LPS的外核心寡糖上磷酸膽堿基團(tuán)后，導(dǎo)致禽霍亂的VP161菌株在宿主體內(nèi)的存活能力明顯下降[19]。由于多殺性巴氏桿菌的LPS中類脂A的結(jié)構(gòu)與基因序列尚不清楚，目前人們僅針對(duì)缺失LPS的核心寡糖來(lái)構(gòu)建減毒株，動(dòng)物毒力試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其中的庚糖缺失株ΔhptC是明顯減毒的[20]，但由于該菌株是通過(guò)單交換插入突變的，具有毒力回復(fù)的可能，使得其作為疫苗候選株的安全性大大降低。另外， Harper等[21]發(fā)現(xiàn)，與親本株制成的滅活苗相比，外核心寡糖缺失株制成的滅活苗在針對(duì)同血清型菌株的攻毒時(shí)無(wú)法為雞提供好的免疫保護(hù)。這表明滅活疫苗所激發(fā)的免疫保護(hù)應(yīng)答依賴于LPS的結(jié)構(gòu)相似性，而不同血清型菌株的LPS結(jié)構(gòu)具有多樣性，這或許是滅活疫苗的交叉免疫保護(hù)力不佳的部分原因。與之相反的是，以ΔaroA缺失株制成的減毒活疫苗的免疫保護(hù)效果卻不受外核心寡糖結(jié)構(gòu)變化的影響，無(wú)論LPS的結(jié)構(gòu)是否保持完整，ΔaroA缺失株均能提供高水平的同源及異源的免疫保護(hù)，這提示活疫苗提供的免疫保護(hù)不依賴于LPS。造成這種差異的原因可能是由于活疫苗能夠激發(fā)宿主產(chǎn)生更好的細(xì)胞免疫應(yīng)答，但具體發(fā)揮作用的免疫保護(hù)因子和免疫保護(hù)相關(guān)指標(biāo)有待進(jìn)一步研究。此外，目前還未開(kāi)展單獨(dú)的LPS缺失株的疫苗免疫試驗(yàn)，LPS在活疫苗的免疫應(yīng)答中的參與作用還需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。

隨著對(duì)細(xì)菌致病機(jī)制的研究深入，人們了解到更多的與毒力相關(guān)的調(diào)控基因可以作為實(shí)現(xiàn)毒力降低的靶基因?；谄渌锾m陰性菌(如大腸桿菌、沙門菌)的研究證實(shí)，crp基因和phoP基因是兩個(gè)重要的全局調(diào)控基因。crp編碼的cAMP受體蛋白參與細(xì)菌的碳水化合物和氨基酸代謝，并調(diào)控諸多毒力基因的表達(dá)[22]；phoP編碼的PhoP蛋白和位于膜上的PhoQ蛋白(一種組氨酸蛋白激酶)構(gòu)成的雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)參與了一系列生物學(xué)過(guò)程，包括調(diào)控毒力基因的表達(dá)、增強(qiáng)細(xì)菌的免疫逃避能力以及對(duì)多種限制性生長(zhǎng)環(huán)境的適應(yīng)性等[23]。本研究小組通過(guò)將沙門菌的這兩個(gè)基因序列與多殺性巴氏桿菌Pm70全基因組序列比對(duì)篩選獲得多殺性巴氏桿菌的crp、phoP基因序列，并通過(guò)異源回補(bǔ)試驗(yàn)證實(shí)了這兩個(gè)基因的正確性。然后通過(guò)分別缺失crp、phoP基因構(gòu)建了血清A型菌株的減毒株。相比于親本株，ΔphoP缺失株經(jīng)鼻途徑的LD50增加了153倍。將該缺失株通過(guò)滴鼻免疫雛鴨，能針對(duì)同源菌株達(dá)到54.5%的保護(hù)效力[24]。而Δcrp缺失株通過(guò)滴鼻免疫雛鴨后，誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生了顯著的血清IgY應(yīng)答，并使免疫動(dòng)物獲得60%的同源保護(hù)力[25]。

從上述研究可知，基因缺失是構(gòu)建減毒疫苗的有效策略，一些基因缺失株展示了良好的免疫保護(hù)潛力。然而缺失不同靶基因造成的毒力降低程度及缺失株提供的免疫保護(hù)效果有所差異。aroA、hexA缺失造成菌株高度減毒，而Δcrp、Δphop缺失株僅部分減毒。同時(shí)在強(qiáng)毒株高劑量(107CFU、108CFU)攻毒挑戰(zhàn)下，ΔaroA或ΔhexA缺失株免疫動(dòng)物全部存活，而Δcrp、Δphop缺失株僅能提供中等程度的免疫保護(hù)。顯然ΔaroA或ΔhexA缺失株是更好的疫苗候選株。造成這種差異的原因之一在于仍有一定毒力的Δcrp、Δphop缺失株存在免疫劑量的妥協(xié)，即免疫劑量較低。顯然影響多殺性巴氏桿菌毒力的遠(yuǎn)不止這四個(gè)基因，在未來(lái)研究中我們一方面需要去探討已知的毒力基因(如莢膜合成基因[16]、LPS合成基因[21]、全局調(diào)控基因fis[26]、hfq[27])在疫苗研究中的應(yīng)用；另一方面還需去挖掘更多的毒力基因，進(jìn)行毒力基因的組合缺失，因?yàn)閱位蛉笔Р⒉蛔阋员ＷC疫苗株的安全性。

2 重組亞單位疫苗

傳統(tǒng)的亞單位疫苗是通過(guò)化學(xué)分解或蛋白質(zhì)水解去除與菌體無(wú)關(guān)甚至有害的成分、僅提取具有免疫活性的成分制成的。此類疫苗的缺陷是生產(chǎn)工藝復(fù)雜、成本高，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，利用重組DNA技術(shù)來(lái)研發(fā)基因工程亞單位疫苗成為現(xiàn)代疫苗學(xué)的一個(gè)新方向。這類亞單位疫苗是通過(guò)基因重組技術(shù)將編碼保護(hù)性抗原的基因連接載體后，將重組載體導(dǎo)入表達(dá)系統(tǒng)，使其高效表達(dá)后提取純化，再聯(lián)合佐劑而制成的。在多殺性巴氏桿菌上，最早是Bording等[28]在1994年研制的多殺性巴氏桿菌毒素重組亞單位疫苗，該疫苗在豬場(chǎng)的免疫試驗(yàn)中能降低外耳畸形程度和后代感染率。經(jīng)過(guò)多年的嘗試，更多具有免疫保護(hù)作用的多殺性巴氏桿菌蛋白逐漸被揭示和發(fā)現(xiàn)。這類蛋白的作用通常是幫助細(xì)菌黏附、入侵宿主，往往表達(dá)于細(xì)胞膜表面或分泌到細(xì)胞外，易于被宿主免疫系統(tǒng)識(shí)別。因此，這些相關(guān)蛋白被人們選擇應(yīng)用于研制亞單位疫苗。這些蛋白大致包括脂蛋白、外膜蛋白、菌毛蛋白和一些與細(xì)菌黏附入侵相關(guān)的蛋白(表1)。

2007年，Wu等[29]將血清型A:1菌株X-73的脂蛋白合成基因plpE和plpB分別克隆到大腸桿菌中，并使PlpE和PlpB蛋白高效表達(dá)，再加入氫氧化鋁佐劑制成重組疫苗，然后評(píng)估兩種疫苗在小鼠和雞模型上的免疫保護(hù)效力。結(jié)果顯示，rPlpE免疫可使小鼠和雞同時(shí)抵抗同源菌株X-73(血清型A:1)及異源菌株P(guān)-1662(血清型A:4)的感染；相比之下，rPlpB免疫無(wú)法為動(dòng)物提供免疫保護(hù)，可能是由于提純過(guò)程的部分抗原表位丟失。之后，Hatfaludi等[30]通過(guò)對(duì)Pm70全基因組進(jìn)行生物信息學(xué)分析比對(duì)，推測(cè)出71個(gè)潛在的具有免疫原性的蛋白，其中只有PlpE具有免疫保護(hù)作用。王紅勛[31]首次在國(guó)內(nèi)構(gòu)建出多殺性巴氏桿菌plpB基因的表達(dá)載體，該試驗(yàn)為了保留PlpB良好的免疫原性，從包涵體蛋白中通過(guò)優(yōu)化復(fù)性得到生物活性高的蛋白。在免疫保護(hù)試驗(yàn)中，rPlpB免疫小鼠后的保護(hù)率為100%。

外膜蛋白普遍存在于不同血清型多殺性巴氏桿菌中，具有很好的免疫原性。其中OmpA作為多殺性巴氏桿菌表面結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定劑，有著黏附素、入侵素等多重角色。OmpH作為外膜上的孔蛋白，具有暴露于細(xì)菌表面的抗原表位，其氨基酸序列高度保守[32]。rOmpA重組疫苗可刺激小鼠產(chǎn)生高水平的IgG1抗體應(yīng)答，但免疫保護(hù)試驗(yàn)顯示這種免疫反應(yīng)不具有保護(hù)效力[33]；研究發(fā)現(xiàn)，多殺性巴氏桿菌15種 血清型之間的OmpH蛋白質(zhì)序列高度相似[34]，預(yù)示著rOmpH是具有潛力的交叉保護(hù)抗原，這促使人們研究其異源免疫保護(hù)潛力。早期人們通過(guò)在變性條件下的Ni-NTA親和層析提純r(jià)OmpH，但是在這個(gè)過(guò)程中rOmpH的化學(xué)結(jié)構(gòu)被改變，導(dǎo)致其免疫保護(hù)效果不甚理想[35]。之后曹素芳和黃青云[36]利用谷胱甘肽瓊脂糖親和層析方法純化rOmpH，然后將其與弗氏完全佐劑混合制成重組亞單位疫苗，發(fā)現(xiàn)其能為免疫雞提供約70%的同源免疫保護(hù)。之后Sthitmatee等[37]在雜合條件下純化rOmpH，其免疫活性得以保留，但這種方法的重復(fù)性低，蛋白的損失量大。之后來(lái)自清邁大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)選擇了電洗脫法，這種方法易于操作、重復(fù)性高且提取的蛋白量多。免疫保護(hù)試驗(yàn)表明電洗脫法不僅能較大程度地保留rOmpH蛋白的免疫原性，還能明顯提高其交叉免疫保護(hù)效率[38]。此后該團(tuán)隊(duì)在電洗脫純化rOmpH的基礎(chǔ)上采用了CpG-ODN和腸毒素作為rOmpH重組疫苗的佐劑，并配合鼻內(nèi)免疫途徑，發(fā)現(xiàn)免疫雞群產(chǎn)生的IgY和sIgA抗體水平顯著提高，并且CpG-ODN免疫組誘導(dǎo)的交叉免疫保護(hù)稍高于腸毒素的免疫組[39]。CpG-ODN是含有CpG基序的DNA序列，而CpG基序是由六個(gè)核苷酸組成的具有免疫刺激活性的特定DNA序列，其基本結(jié)構(gòu)為5′-嘌呤-嘌呤(或T)-CpG-嘧啶-嘧啶-3′。作為一種新型的疫苗佐劑，CpG-ODN不僅能增強(qiáng)體液免疫和細(xì)胞免疫，而且比腸毒素、霍亂毒素等佐劑更安全[40]。

2004年，Ali等[41]從多殺性巴氏桿菌P1059的莢膜中提取出一種相對(duì)分子質(zhì)量為39 ku的蛋白，經(jīng)免疫試驗(yàn)證實(shí)，該蛋白可為小鼠提供完全的針對(duì)同源野生毒株感染的免疫保護(hù)，以及中等程度的針對(duì)異源菌株X-73攻毒挑戰(zhàn)的免疫效應(yīng)。同時(shí)通過(guò)免疫電鏡技術(shù)確定該蛋白是一個(gè)重要的黏附因子[42]，它能夠幫助病原體更有效地黏附到宿主的黏膜上并實(shí)現(xiàn)入侵。之后，Sthitmatee等[37]確定了該蛋白是莢膜中的黏附蛋白(Cp39)，并證實(shí)接種重組疫苗rCp39可幫助免疫雞同時(shí)抵抗同源菌株P(guān)1059 和異源菌株X-73的攻毒挑戰(zhàn)，且異源保護(hù)效力達(dá)到60%。進(jìn)一步地，將該39 ku的蛋白缺失后，發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的基因缺失株無(wú)法使宿主獲得抵抗異源毒株的特異性免疫[43]。恩特馬克·布拉提白等[44]比較了天然Cp39、rCp39和天然莢膜的交叉保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)前兩者均能刺激小鼠免疫系統(tǒng)產(chǎn)生明顯的免疫應(yīng)答，免疫劑量100 μg的天然Cp39和rCp39針對(duì)同源菌株C48-3的保護(hù)率為100%，針對(duì)異源菌株C51-3的保護(hù)率為80%。吾魯木汗·那孜爾別克等[45]分析了16個(gè)血清型多殺性巴氏桿菌cp39基因核苷酸序列相似性在81.5%～100%，說(shuō)明該基因具有高的保守性。并且，Borrathybay等[46]發(fā)現(xiàn)抗rCp39抗體能夠抑制禽多殺性巴氏桿菌對(duì)于雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)的黏附。根據(jù)以上國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果，rCp39的免疫保護(hù)機(jī)制可能是誘導(dǎo)的抗體能阻止禽多殺性巴氏桿菌對(duì)宿主細(xì)胞的黏附從而產(chǎn)生免疫保護(hù)。另外，cp39基因在不同血清型之間的保守性解釋了rCp39的交叉保護(hù)作用。

前期研究表明，與細(xì)菌黏附、入侵有關(guān)的絲狀血凝素肽(FHAB2)對(duì)細(xì)菌的毒力有重要影響，其合成基因fbaB2的缺失會(huì)導(dǎo)致菌株的致病性明顯降低，這可能是由于細(xì)菌定殖到黏膜和入侵宿主的能力減弱所致。FHAB2在毒力方面的重要影響促使人們研究其免疫保護(hù)潛力。Tatum等[47-48]證實(shí)來(lái)源于P1059菌株的絲狀血凝素肽制成的亞單位疫苗rFHAB2 具有較高的免疫保護(hù)效果，針對(duì)107CFU的同源菌株的鼻內(nèi)攻毒，該疫苗為免疫火雞提供80%以上的免疫保護(hù)效率。同時(shí)作者發(fā)現(xiàn)fhaB2基因在不同血清型菌株中具有99%的高相似性，預(yù)示著rFbaB2具有發(fā)揮交叉保護(hù)作用的潛力。

此外，研究證實(shí)IV型菌毛蛋白PtfA與多殺性巴氏桿菌的致病性有關(guān)，并且還具有一定的免疫原性[49-50]?；诖?，Gong等[51]制備禽多殺性巴氏桿菌的重組疫苗rPtfA，免疫試驗(yàn)結(jié)果顯示rPtfA免疫組的血清抗體水平持續(xù)上升，稍低于弱毒活疫苗組。攻毒后rPtfA組和弱毒活疫苗組的動(dòng)物存活率為 45%和75%。這表明rPtfA免疫原性不夠好，不足以為禽類提供強(qiáng)的保護(hù)力，但可以將其與其他抗原應(yīng)用于研制多種抗原融合的重組疫苗。

重組亞單位疫苗免疫保護(hù)效果的關(guān)鍵在于候選抗原的選擇以及抗原的表達(dá)純化。目前已篩選到具有良好的同源免疫效力的抗原包括Cp39、PlpE、OmpH、FHAB2，其中前三者還可為免疫動(dòng)物提供一定程度的交叉保護(hù)。同時(shí)為了獲取生物活性良好的重組蛋白，人們對(duì)表達(dá)純化過(guò)程進(jìn)行了很多改良工作，目前已證實(shí)重組的rCp39、rOmpH蛋白與天然形式的蛋白免疫效果相當(dāng)。未來(lái)的研究工作除了繼續(xù)挖掘更多的具有免疫保護(hù)作用的抗原，還應(yīng)以這些候選抗原為基礎(chǔ)優(yōu)化蛋白提純從而制備最優(yōu)的重組亞單位疫苗，并探究它們?cè)谄渌饕酿B(yǎng)殖禽類上的免疫效力。

表1禽霍亂重組亞單位疫苗潛力評(píng)價(jià)

Table1Evaluationoffowlcholerarecombinantsubunitvaccine

抗原成分Immunogen親本株Strains佐劑Adjuvant免疫動(dòng)物、途徑Immunization and route攻毒菌株Challenge 免疫效力/%Immunity參考文獻(xiàn)References脂蛋白PlpEX-73(A:1)氫氧化鋁Alumium hydroxide3周齡的雞BALB/c小鼠;皮下免疫Chicken, mice; s.c.X-73, P1059 P-166280～100[29]莢膜蛋白Cp39P1059(A:3)弗氏不完全佐劑Freunds incomplete adjuvant(FIA)8周齡的雞;皮下免疫Chicken; s.c.P1059X-73100[41]外膜蛋白OmpAP.multocida 232弗氏不完全佐劑Freunds incomplete adjuvant (FIA)BALB/c小鼠;皮下免疫M(jìn)ice;s.c.P.multocida 23253[33]外膜蛋白OmpHX-73(A:1)CpG基序的DNA佐劑CpG-ODN8周齡的雞;鼻內(nèi)免疫Chicken; i.n.X-73,P1059P-166280～100[39]絲狀血凝素肽FHAB2P1059(A:3)TiterMax?Gold Adjuvant5周齡的火雞;皮內(nèi)免疫Turkey; i.d.X-73, P105970～75[48]菌毛蛋白PtfACVCC474弗氏完全佐劑Freunds complete adjuvant4周齡的雞;皮下免疫Chicken; s.c.CVCC47445[51]

3 DNA疫苗

DNA疫苗是將編碼保護(hù)性抗原的基因與真核細(xì)胞表達(dá)載體構(gòu)建的重組質(zhì)粒直接免疫機(jī)體，借助宿主細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)出保護(hù)性抗原，從而激活宿主的免疫系統(tǒng)。DNA疫苗的生產(chǎn)成本低，易于貯存與運(yùn)輸，接種方便，并且可以組合多種抗原基因，使疫苗研制的靈活性大大增加。

2011年，Gong等[52]將編碼外膜蛋白OmpA和OmpH的基因融合，與真核表達(dá)載體重組從而制成DNA疫苗，并在體外通過(guò)間接免疫熒光驗(yàn)證了OmpA和OmpH的表達(dá)。該DNA疫苗針對(duì)同源菌株的攻毒可提供73.3%的保護(hù)效力，激發(fā)免疫雞產(chǎn)生的抗體水平與減毒疫苗組相似。兩年后，同一研究團(tuán)隊(duì)將分別表達(dá)OmpA、OmpH的DNA疫苗(pOMPA、pOMPH)和融合了OmpA、OmpH的DNA疫苗(pOMPHA)同時(shí)接種于4周齡雞，并比較了保護(hù)效果。各免疫組所引起的抗體水平、淋巴細(xì)胞增殖、IFN-γ分泌水平都很顯著，其中融合DNA疫苗pOMPHA為抵抗致死量的野毒感染提供的保護(hù)效果最好，不弱于減毒疫苗免疫組[53]。此外，Okay等[54]選擇了血清型A:3菌株的ompH基因以及plpE基因的兩個(gè)片段(plpEN、plpEC)，通過(guò)融合以上片段和連接pCMV載體制成了3種DNA疫苗：pCMV-ompH、 pCMV-plpEN-ompH和pCMV-plpEC-ompH。同時(shí)比較了這三種DNA疫苗與rPlpE和rOmpH融合的兩種重組亞單位疫苗(rPlpEN-OmpH、rPlpEC-OmpH)的免疫保護(hù)效力。結(jié)果顯示，所有免疫小鼠的IFN-γ水平明顯升高，但免疫保護(hù)效果不理想，其中3種DNA疫苗免疫小鼠均無(wú)法抵抗10倍LD50野生株的腹膜感染，在同一試驗(yàn)條件下PlpE和OmpH融合的亞單位疫苗的保護(hù)效力也僅有40%。說(shuō)明以上DNA疫苗所激活的免疫反應(yīng)不具有保護(hù)性，但具有免疫反應(yīng)顯著的特點(diǎn)，可以考慮將其作為基礎(chǔ)免疫。在國(guó)內(nèi)，曹素芳等[55]通過(guò)將多殺性巴氏桿菌的ompH基因片段插入到真核表達(dá)載體pcDNA3中，從而構(gòu)建了OmpH的真核表達(dá)載體，為之后的DNA疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。

從上述研究可知，目前應(yīng)用于禽霍亂的DNA疫苗主要是外膜蛋白OmpA、OmpH、脂蛋白PlpE的基因序列，雖然只有二價(jià)融合的DNA疫苗所提供的免疫保護(hù)效果差強(qiáng)人意，但各疫苗誘導(dǎo)的體液免疫和細(xì)胞免疫都很顯著。另一方面，花費(fèi)低廉、技術(shù)受限少也是此類疫苗不容忽視的優(yōu)點(diǎn)。未來(lái)這類疫苗研究的主攻方向是在穩(wěn)定外源抗原表達(dá)水平的前提下，進(jìn)一步提高DNA疫苗的免疫效果。隨著DNA疫苗研究的深入和技術(shù)上的改進(jìn)，這類新型疫苗有望在防治禽霍亂方面發(fā)揮顯著作用。

4 總結(jié)與展望

禽霍亂的流行對(duì)養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展造成重大威脅。抗生素治療仍是我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)控制該病的主要手段，但隨著流行菌株抗生素耐藥性問(wèn)題的日益嚴(yán)重，疫苗這一預(yù)防疾病最經(jīng)濟(jì)有效的手段應(yīng)在未來(lái)發(fā)揮更重要的作用。如前所述，目前的商品化禽霍亂疫苗均存在一定的缺陷，因此發(fā)展更加安全、高效的疫苗成為疾病防控的重要需求。

傳統(tǒng)的滅活苗在預(yù)防禽霍亂的早期發(fā)揮了重要的作用，但該種疫苗具有副反應(yīng)較大、交叉保護(hù)力不足等缺陷。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，多殺性巴氏桿菌的致病機(jī)制被逐步揭示，這顯著推動(dòng)了新型減毒疫苗的發(fā)展。相比傳統(tǒng)弱毒苗，新型減毒疫苗具有基因背景明確的優(yōu)點(diǎn)；相比傳統(tǒng)滅活苗，減毒疫苗又具有可同時(shí)激發(fā)體液免疫、細(xì)胞免疫、可經(jīng)黏膜接種、交叉保護(hù)力強(qiáng)等多種優(yōu)勢(shì)。但減毒疫苗的安全性令人擔(dān)憂，因此，在保持菌株免疫原性的前提下，通過(guò)致病機(jī)制的深入研究發(fā)現(xiàn)更多毒力基因，以及利用多種毒力基因的組合缺失等策略提高減毒疫苗的安全性是未來(lái)研究的重要內(nèi)容。同時(shí)，分子生物學(xué)、免疫學(xué)的發(fā)展也促使多殺性巴氏桿菌的多種保護(hù)性抗原被逐步發(fā)現(xiàn)，人們將這些抗原以蛋白質(zhì)或DNA的形式制備成兩種新型疫苗——亞單位疫苗和DNA疫苗。這兩種疫苗也具有其特定的優(yōu)勢(shì)，包括制備方便、安全穩(wěn)定、基因靶向明確、可制備多聯(lián)、多價(jià)疫苗等。由于這兩種疫苗的研制大多情況下都需要加入佐劑以提高免疫原性，因此如何開(kāi)發(fā)新型佐劑激發(fā)免疫系統(tǒng)，尤其是通過(guò)激活固有免疫提升適應(yīng)性免疫應(yīng)答是發(fā)展這兩種疫苗所需解決的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題。

綜上，本文綜述了預(yù)防禽霍亂新型疫苗種類的發(fā)展與現(xiàn)狀，這一發(fā)展過(guò)程表明高效疫苗的研制有賴于致病機(jī)制與免疫保護(hù)機(jī)制的深入研究。一種理想的疫苗是能提供長(zhǎng)期的同源和異源免疫保護(hù)效力，不僅能夠阻止疾病暴發(fā)，而且能治愈已感染動(dòng)物，同時(shí)在生產(chǎn)實(shí)際中接種簡(jiǎn)易，便于儲(chǔ)存以及價(jià)格低廉。減毒疫苗符合上述大部分要求，但其安全性仍是人們所擔(dān)憂的問(wèn)題。在實(shí)際免疫程序中，應(yīng)在免疫減毒疫苗之后接種安全無(wú)毒的滅活疫苗，達(dá)到既杜絕疾病暴發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)又高效預(yù)防禽霍亂的目的。