吳燕麗 張海燕

（華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院，湖北 武漢 430030）

急性胰腺炎（AP）是由于多種原因導致胰蛋白酶在胰腺內被激活，引起胰腺組織自體消化、壞死等的一種急性胰腺炎癥反應。流行病學研究表明，約15%～20%AP 患者可進展為重癥急性胰腺炎（SAP）［1］。 SAP具有疾病進展速度快、并發(fā)感染率高、致死率高等特征，嚴重者發(fā)生全身性炎癥反應，累及腎臟、肺等重要器官，其中SAP導致的急性腎功能衰竭是危害患者生命安全的重要并發(fā)癥之一［2］。因此，有效地預防腎功能損傷對改善SAP患者預后和生存率具有重要意義。研究顯示，炎癥因子如腫瘤壞死因子（TNF）、白介素（IL）等參與SAP疾病進展，調控炎癥因子水平可能控制SAP 疾病進展［3］。 核因子-κB（NF-κB）通路是機體重要的信號通路之一，在炎癥性疾病如膿毒血癥中發(fā)揮作用，抑制NF-κB通路可有效緩解炎癥反應［4］。丹參素是從植物丹參中提取的芳香酸類復合物，具有抗血栓、抗炎、抗氧化等功效，已有研究證明丹參對急性腎損傷具有保護作用，但其主要成分丹參素在SAP所致腎損傷中的作用尚不清楚［5］。本研究通過建立急性壞死性胰腺炎（ANP）大鼠模型，觀察丹參素對ANP大鼠腎損傷的保護作用，并初步探究其作用機制，旨在探究丹參素治療ASP疾病的潛在作用。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康SD大鼠，SPF級，60只，體質量170～190 g，購自上海邦耀公司，許可證號：SCXK（滬）-2014-0002。本研究實驗動物均在本院實驗動物中心進行常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲水/食，術前12 h進行禁食處理、不禁水。本研究中所有實驗均經動物實驗倫理委員會批準。

1.2 試劑與儀器 丹參素（純度≥98%，批號：67920-52-9），購自成都瑞芬思生物科技公司；醋酸奧曲肽注射液（規(guī)格：0.1 mg，以奧曲肽計，批號：H20090291），購自江蘇奧賽康藥業(yè)公司；4%多聚甲醛、HE染色試劑盒、蛋白提取試劑盒，購自上海生工生物技術公司；戊巴比妥鈉、BCA試劑盒、戊二醛，購自碧云天公司；大鼠TNF-α ELISA試劑盒、大鼠IL-6 ELISA試劑盒、大鼠IL-8 ELISA試劑盒，購自美國R&D Systems公司；兔源一抗 Anti-NF-κB、Anti-cleaved-caspase3、Anti-GAPDH、羊抗兔二抗，購自美國abcam公司；DAB顯色試劑盒，購自北京百奧萊生物公司；全自動生化檢測儀（AU5800），購自美國 Beck C公司；光學顯微鏡（CX23），購自日本奧林巴斯公司；蛋白電泳儀、全能型蛋白轉印系統，美國Bio-Rad公司；石蠟切片機（SDSGA9000）等，購自上?？茀R生物公司等。

1.3 模型制備 參照文獻中方法制備ANP模型大鼠［6］。手術開始前，給予各大鼠麻醉處理，腹腔注射2.5%戊巴比妥鈉（40 mg/kg），切開大鼠腹部正中，暴露并分離出十二指腸，采用注射器刺開胰膽管與十二指腸膜乳頭開口下緣，于硬膜外置入5 cm導管，緩慢推進后扎合切口；將輸液轉換器接于導管末端，以0.2 mL/min速度逆行泵入5%牛黃膽酸鈉（0.1 mL/kg），持續(xù)10 min，移除扎合線，退出導管，迅速縫合手術切口，歸位十二指腸，逐層縫合腹腔，消毒后送回動物中心。假手術組，不穿刺泵藥，僅打開腹腔后縫合。本研究制備SNP模型過程中無大鼠死亡，共50只大鼠造模成功，術后進行常規(guī)飼養(yǎng)。

1.4 分組與給藥 按照隨機數表法將50只ANP大鼠隨機分為ANP組，奧曲肽組，丹參素低、中、高劑量組，每組10只，另設假手術組10只。丹參素低、中、高劑量組于術前 7 d， 定時給予丹參素 5、10、20 mg/（kg·d）灌胃治療；奧曲肽組于術前7 d，定時給予奧曲肽2.4 mg/（kg·d）灌胃治療；假手術組及 ANP 組于術前7 d，定時給予等體積0.9%氯化鈉注射液灌胃。

1.5 標本采集與檢測 造模24 h后，給予麻醉各組大鼠，腹主動脈血采血5 mL，用于腎功能及炎癥因子檢測；立即取出大鼠胰臟、腎臟，洗凈后分別對稱切半，一半置于4%多聚甲醛中固定，制備石蠟切片，用于后續(xù)實驗；一半切碎后置于液氮中速凍，轉入-80℃冰箱保存。1）腎功能檢測。采用低溫離心機以3000 r/min轉速，將血液標本離心10 min，取部分上清液，采用全自動生化檢測儀測定各組大鼠血清中血尿素氮（BUN）和血清肌酐（Scr）含量。 2）蘇木素-伊紅（HE）染色法觀察胰腺組織及腎組織病變。對大鼠胰腺組織和腎組織石蠟切片脫蠟、水化后，采用HE染色試劑盒對各切片進行染色，中性膠封片，置于光學顯微鏡下，觀察大鼠胰腺組織、腎組織形態(tài)并采用半定量病理評估法對大鼠胰腺組織和腎小管損傷程度進行評價。3）血清TNF-α、IL-6、IL-8水平測定。采用大鼠TNF-α ELISA試劑盒、大鼠IL-6 ELISA試劑盒、大鼠IL-8 ELISA試劑盒檢測各大鼠血清中IL-6、IL-8、TNF-α水平。4）蛋白印跡法檢測NF-κB蛋白表達水平。制備大鼠腎組織勻漿液，采用細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒分別提取細胞質及細胞核總蛋白，采用BCA試劑盒分別測定細胞質及細胞核蛋白總量。SDS-凝膠電泳分離蛋白，采用全能型蛋白轉印系統將蛋白轉印至PVDF膜；加入5%脫脂奶粉，封閉1 h；PBS沖洗后分別加入兔源一 抗 Anti-NF-κB、Anti-cleaved-caspase3、Anti-GAPDH（1∶500）進行孵育，4 ℃過夜；加入羊抗兔二抗（1∶4000）孵育，室溫 1 h。 經化學發(fā)光試劑作用后，采用Tanon軟件檢測、分析并拍攝圖像。

1.6 統計學處理 應用SPSS24.0統計軟件。計量數據以（±s）表示，采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 丹參素對ANP大鼠胰腺、腎組織結構的影響1）胰腺組織。假手術組大鼠胰腺細胞規(guī)則，排列緊密，呈現胰島；ANP組大鼠胰腺組織現空泡樣改變、炎性細胞浸潤、不規(guī)則間隙及壞死組織；與ANP組比較，丹參素低、中、高劑量組大鼠胰腺組織損傷明顯改善，呈劑量依賴效應。見圖1。2）腎臟組織。假手術組大鼠腎小管和腎小體結構清晰、腎間質無水腫、腎皮質組織結構完整；與假手術組比較，ANP組大鼠腎小管結構腫脹、腎小球萎縮、腎皮質出現細胞水腫、壞死、有炎性細胞、小管腔凝固壞死等病變；丹參素低、中、高劑量組大鼠腎皮質細胞損傷減輕，腎小球萎縮減輕等病理程度減輕。見圖2。病理評分結果顯示，與假手術組比較，ANP組大鼠胰腺組織、腎組織的評分顯著上升，差異有統計學意義（P＜0.05）；與ANP組比較，丹參素低、中、高劑量組大鼠胰腺組織、腎組織評分明顯下降（P＜0.05），呈劑量依賴效應。見表1。

圖1 各組大鼠胰腺組織結構（HE染色，400倍）

圖2 各組大鼠腎組織結構（HE染色，400倍）

2.2 丹參素對ANP大鼠腎功能的影響 見表2。與假手術組比較ANP組大鼠血清中BUN和Scr含量明顯增高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與ANP組比較，丹參素低、中、高劑量組大鼠血清中BUN和Scr含量明顯減少（P＜0.05），呈劑量依賴效應。

表1 各組ANP大鼠胰腺組織、腎組織病理評分比較（分，±s）

表1 各組ANP大鼠胰腺組織、腎組織病理評分比較（分，±s）

與假手術組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與丹參素低劑量組比較，※P＜0.05；與丹參素中劑量組比較，◇P＜0.05。 下同

組 別 n 胰腺組織 腎組織假手術組 1 0 0.3 9±0.0 6 0.4 5±0.0 8 A N P 組 1 0 8.1 3±1.6 3* 4.9 9±0.9 8*奧曲肽組 1 0 3.2 4±0.6 4*# 2.8 9±0.5 6*#丹參素低劑量組 1 0 6.5 0±1.2 7*# 4.4 2±0.8 7*#丹參素中劑量組 1 0 4.1 7±0.8 4*#※ 3.6 8±0.7 4*#※丹參素高劑量組 1 0 2.6 8±0.5 2*#※◇ 2.7 5±0.5 5*#※◇

表2 各組ANP大鼠腎功能指標比較（±s）

表2 各組ANP大鼠腎功能指標比較（±s）

組 別 n B U N（m m o l/L） S c r（μ m o l/L）假手術組 1 0 8.1 4±1.6 1 2 7.3 7±5.4 6 A N P 組 1 0 3 7.5 4±7.4 9* 2 0 3.5 4±3 9.4 6*奧曲肽組 1 0 1 4.1 9±2.8 2*# 1 0 3.2 8±1 9.9 7*#丹參素低劑量組 1 0 3 1.0 5±6.1 9*# 1 8 6.5 3±3 5.3 6*#丹參素中劑量組 1 0 2 0.3 7±4.0 6*#※ 1 3 5.4 9±2 6.9 8*#※丹參素高劑量組 1 0 1 2.9 3±2.5 7*#※◇ 9 8.3 6±1 9.6 5*#※◇

2.3 丹參素對ANP大鼠炎癥反應的影響 見表3。與假手術組比較，ANP組大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-8水平顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與ANP組比較，丹參素低、中、高劑量組大鼠血清組織中TNF-α、IL-6、IL-8 水平顯著降低（P＜ 0.05），呈劑量依賴效應。

表3 各組大鼠血清中 TNF-α、IL-6、IL-8 水平比較（pg/mL，±s）

表3 各組大鼠血清中 TNF-α、IL-6、IL-8 水平比較（pg/mL，±s）

組別 n T N F-α假手術組 1 0 1 5 3.1 7±2 6.7 8 A N P 組 1 0 3 0 2.9 3±5 9.7 2*奧曲肽組 1 0 1 8 4.9 6±3 1.0 5*#丹參素低劑量組 1 0 2 6 7.4 1±5 0.6 7*#丹參素中劑量組 1 0 2 0 1.6 7±3 8.5 4*#※丹參素高劑量組 1 0 1 7 6.7 1±3 4.4 3*#※◇I L-6 I L-8 1 1 1.3 2±2 1.9 7 1 0 3.7 6±2 0.4 5 3 2 1.6 3±6 2.3 1* 2 8 6.8 1±5 1.2 3*1 4 9.2 7±2 9.4 9*# 2 5 1.4 2±4 8.9 7*#2 7 3.9 8±5 3.2 5*# 1 6 7.6 5±3 1.2 8*#2 3 2.6 1±4 3.6 7*#※ 1 1 9.2 4±2 1.7 6*#※1 3 7.5 4±2 5.7 6*#※◇ 1 1 1.3 9±2.1 4*#※◇

2.4 丹參素對ANP大鼠腎組織細胞凋亡的影響 見圖3、表4。與假手術組比較，ANP組大鼠腎組織細胞凋亡率顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與ANP組比較，丹參素低、中、高劑量組大鼠腎組織細胞凋亡率明顯降低（P＜0.05），呈劑量依賴效應。

2.5 丹參素對 ANP大鼠腎組織中 NF-κB、cleavedcaspase3蛋白表達的影響 見圖4、表5。與假手術組比較，ANP組大鼠細胞質中cleaved-caspase3蛋白顯著增多、NF-κB蛋白顯著減少，細胞核中NF-κB蛋白明顯增多，差異有統計學意義（P＜0.05）；與ANP組比較，丹參素低、中、高劑量組大鼠細胞質中cleaved-caspase3蛋白顯著減少、NF-κB蛋白顯著增多 （P＜0.05），細胞核 NF-κB 蛋白顯著減少（P＜0.05），呈劑量依賴效應。

圖3 各組ANP大鼠腎組織細胞凋亡情況（TUNEL染色，200倍）

表4 各組ANP大鼠腎組織凋亡細胞比例的比較（±s）

表4 各組ANP大鼠腎組織凋亡細胞比例的比較（±s）

組 別 n 凋亡細胞比例（%）假手術組 1 0 4.7 3±0.9 1 A N P 組 1 0 4 9.4 6±8.6 3*奧曲肽組 1 0 1 2.3 5±2.6 1*#丹參素低劑量組 1 0 3 8.0 8±6.5 7*#丹參素中劑量組 1 0 2 1.6 7±4.1 3*#※丹參素高劑量組 1 0 8.2 9±1.5 1*#※◇

圖4 各組ANP大鼠腎組織NF-κB、cleaved-caspase3蛋白表達

表5 各組ANP大鼠腎組織NF-κB、cleaved-caspase3蛋白表達的比較（±s）

表5 各組ANP大鼠腎組織NF-κB、cleaved-caspase3蛋白表達的比較（±s）

組別 n c l e a v e d-c a s p a s e 3/G A P D H假手術組 1 0 0.9 1±0.1 7 A N P 組 1 0 2.1 9±0.3 9*奧曲肽組 1 0 0.9 4±0.1 5#丹參素低劑量組 1 0 2.1 5±0.4 1*丹參素中劑量組 1 0 1.9 5±0.3 7*#※丹參素高劑量組 1 0 1.2 1±0.2 3*#※◇質 N F-κ B/H i s t o n e H 2 A 核 N F-κ B/G A P D H 1.1 2±0.2 1 0.2 1±0.0 4 0.4 9±0.0 8* 0.8 3±0.1 2*0.6 7±0.1 3*# 0.4 6±0.0 9*#0.5 3±0.1 1*# 0.7 2±0.1 3*#0.7 8±0.1 4*#※ 0.4 9±0.0 9*#※1.0 9±0.1 9*#※◇ 0.1 8±0.0 4*#※◇

3 討 論

AP是一種較為常見的消化系統疾病，其中多數AP患者具有自限性，一般在3～5 d內恢復，預后效果好，但某些AP患者可能繼發(fā)腹膜炎、全身性炎癥反應、多臟器功能衰竭等并發(fā)癥，腎臟是最易累及的器官之一［7］。本研究采用胰膽管逆行穿刺結合牛黃膽酸鈉法復制ANP大鼠模型，HE染色結果顯示，ANP組大鼠胰腺組織現空泡樣改變、炎性細胞浸潤及細胞等病變；腎皮質出現細胞壞死、產生炎性細胞、腎小管結構腫脹、小管腔凝固等病變，且ANP組大鼠血清中BUN和Scr含量明顯增高，表明ANP可導致大鼠腎損傷，模型制備成功。

丹參素是來自藥用植物丹參的主要水提取物之一，是復方丹參注射液等多種藥物的主要功效成分［8］。研究表明，丹參川芎嗪注射液可通過降低血清TNF-α等炎癥因子含量，改善急性顱腦損傷患者臨床癥狀，緩解神經功能障礙［9］。陳芳等曾報道，丹參通脈方可通過降低IL-6等炎性因子的表達，抑制凋亡通路激活，從而減輕人血管內皮細胞內質網應激損傷［10］。以上研究提示，丹參類藥物具有一定炎癥抑制功效，可改善炎癥反應異常所致疾病。但丹參素在ANP所致腎損傷的作用機制尚不清楚。本研究發(fā)現，丹參素可明顯減輕ANP所致大鼠腎功能障礙，減輕胰腺和腎臟組織病理損傷程度，降低血清中BUN和Scr水平，提示丹參素對ANP大鼠腎損傷具有保護作用，但其作用機制并不清楚。

ASP患者血清炎癥反應增強，嚴重者可引發(fā)全身性炎癥反應，威脅肺臟、腎臟等組織器官正常功能，是ASP造成多器官組織損傷的主要原因之一［11］。白細胞介素是一種細胞因子，參與調節(jié)機體免疫反應和炎癥反應等生理過程［12］。腫瘤壞死因子是一種具有較強免疫活性的細胞因子，主要由巨噬細胞、T淋巴細胞等產生，參與炎癥反應等多種生理過程［12-13］。Chen等發(fā)現，白藜蘆醇可通過降低血清和腎組織中炎癥因子水平抑制脂多糖誘導的急性腎損傷所致細胞凋亡，改善腎功能［14］。 Latchoumycandane 等研究顯示，抗炎藥物?；撬崽幚砜赏ㄟ^抑制大鼠腎脂質氧化、減輕炎性細胞浸潤，改善酒精誘導的腎炎性損傷［15］。本研究發(fā)現，與假手術組比較，ANP組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-8水平顯著升高；與ANP組比較，丹參素低、中、高劑量組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-8水平顯著降低，表明丹參素預處理可降低ANP大鼠血清炎癥因子水平，提示丹參素可能通過抑制機體炎癥反應保護ANP所致大鼠腎損傷。

研究表明，炎癥因子的大量產生不僅可以對組織細胞造成損傷，還能激活凋亡相關基因的表達及轉錄［16］。另外，TNF-α等炎癥因子可通過一系列信號傳導，促使NF-κB從其抑制蛋白中分離、釋放，移位進入細胞核而激活，誘導caspase等凋亡蛋白發(fā)生水解活化，激活細胞凋亡，細胞凋亡的異常也是造成腎組織損傷的原因之一［17］。董永喜等發(fā)現，辛芍組方可抑制NF-κB通路的活化，抑制大鼠神經細胞凋亡，從而發(fā)揮神經保護作用［18］。本研究發(fā)現，與假手術組比較，ANP大鼠腎組織凋亡細胞比例明顯升高，丹參素低、中、高劑量組可顯著降低ANP大鼠腎組織凋亡細胞比例，提示丹參素可減輕ANP所致大鼠腎細胞凋亡。另有研究顯示，TNF-α誘導NF-κB通路的激活，在順鉑所致腎小管上皮細胞凋亡中發(fā)揮重要作用［19］。Ozkok等研究表明，抑制NF-κB通路的激活可顯著抑制腎小管細胞凋亡和壞死，改善順鉑所致腎功能損傷［20］。本研究發(fā)現，ANP大鼠腎組織細胞中NF-κB蛋白核移位程度明顯增高、cleaved-caspase3蛋白顯著增多；低、中、高劑量丹參素干預后，ANP大鼠腎組織細胞中NF-κB蛋白核移位程度顯著降低、cleaved-caspase3蛋白顯著減少，表明丹參素具有抑制NF-κB通路和caspase3蛋白激活的功效，提示丹參素可能通過抑制NF-κB通路的激活來保護ANP所致腎損傷。