楊敏光 黃 佳 宋長明 金 昊 李 瓏 柳維林 陶 靜 ，2，3 陳立典 ，2，3，4△

（1.福建中醫(yī)藥大學康復醫(yī)學院，福建 福州 350122；2.福建省康復技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，福建福州 350122；3.康復醫(yī)療技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，福建 福州 350122；4.國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)康復研究中心，福建 福州 350122）

腦卒中患者認知功能障礙的發(fā)生，會對患者日常生活造成嚴重影響。認知功能障礙對患者的康復效率產(chǎn)生了嚴重影響，并會阻礙其全面康復，對患者、家屬以及社會來說都是極大的負擔和影響［1］。學習記憶的基礎(chǔ)是突觸的可塑性，突觸結(jié)構(gòu)和功能的可塑性變化是神經(jīng)康復的基礎(chǔ)，突觸蛋白在突觸前膜有大量分布，其在突觸連接的形成、維持與調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放過程中均可發(fā)揮重要的作用。突觸素（SYN）可以促進突觸的形成，參與神經(jīng)生長、修復再生和突觸重塑，是突觸重建的重要標志。其具體的含量與突觸數(shù)目的數(shù)量呈正相關(guān)，并且會影響學習記憶能力［2-3］。課題組前期基礎(chǔ)和臨床研究均已證實［4-5］：針刺對腦卒中后的認知功能障礙療效明確，但其作用機制還有待探討。基于此，本研究通過觀察電針神庭、百會穴對大腦中動脈阻塞大鼠的海馬CA1區(qū)突觸素的影響及其對認知功能的改善，探究其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 由上海斯萊克實驗動物責任有限公司［許可證號：SCXK（滬）2012-003］提供 SPF 級雄性SD大鼠，體質(zhì)量（250±30）g，在福建中醫(yī)藥大學實驗動物中心［許可證號：SYXK（閩）2013-005］分籠并進行適應性喂養(yǎng)1周，隨后對大鼠編號并稱重。實驗過程均嚴格按照國際動物保護和使用指南的規(guī)定操作。

1.2 試劑與儀器 一抗：SYN antibody（ab8049），Abcam 生產(chǎn)；二抗：Alexa Fluor 488（A21202），Life Technologies生產(chǎn)，批號為1562298。線栓（廣州佳靈生物技術(shù)有限公司，3800AAA）、G6805型電針儀（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）、7.0 T小動物核磁共振儀（Pharmascan；microMRI，Bruker，Germany）、Barnes 迷宮（上海欣軟信息科技有限公司）、熒光倒置顯微鏡系統(tǒng)DMI4000B（徠卡儀器公司）、Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)。

1.3 造模與分組 本試驗設(shè)立假手術(shù)組、模型組、電針組3組，由于MCAO大鼠尚無絕對明確的針灸配穴因而未設(shè)置陽性對照組。利用隨機數(shù)字表將25只健康雄性SD大鼠隨機分為造模手術(shù)組（n=19）和假手術(shù)組（n=6），參考 Koizumi方法［6］，對造模手術(shù)組行左側(cè)大腦中動脈栓塞造模（MCAO）。麻醉選用腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g），沿頸正中線切開皮膚，隨后分離左側(cè)頸總，頸外和頸內(nèi)動脈。用不可吸收線結(jié)扎頸總及頸外動脈，并用血管夾夾閉頸內(nèi)動脈。于左側(cè)頸總動脈的結(jié)扎點上方近側(cè)端用維納斯剪剪開一“V”形小口，將線栓由此口向頸內(nèi)動脈方向輕緩推入，行進到夾閉處時松開血管夾，隨后把插入頸內(nèi)動脈的線栓繼續(xù)輕推至顱內(nèi)，待感到輕微阻力時不再推入，造成局灶性腦缺血并縫合皮膚，清潔創(chuàng)口。推入線栓90 min后抽出部分線栓并剪斷暴露在創(chuàng)口外的部分，形成再灌注。假手術(shù)組僅對大鼠的左側(cè)頸總、頸內(nèi)、頸外動脈進行分離，并不結(jié)扎，隨后縫合皮膚，清潔創(chuàng)口。術(shù)中注意保暖，待大鼠蘇醒并恢復活動后進行神經(jīng)行為學評分。采用Zea Longa 5分評價法在手術(shù)完成2 h后判斷手術(shù)是否成功。利用隨機數(shù)字表法將評分在1～3分的12只大鼠隨機分為模型組和電針組，每組各6只，0分及4分的7只則剔除，假手術(shù)組也為6只。

1.4 干預方法 在手術(shù)完成后第2日（該日為干預第1日），電針組取穴百會、神庭。百會：頂骨正中。神庭：在額頂?shù)那罢芯€上的骨縫交界線前方。兩穴均采用45°角斜刺2 mm。電針儀參數(shù)設(shè)置如下：疏密波，頻率1/20 Hz，電流強度 1～3 mA，每次電針 30 min，選擇每日上午的相同時間進行電針，同時對假手術(shù)組和模型組行同等條件抓取30 min后回籠飼養(yǎng)，不予任何其他干預，至干預7 d后將3組實驗動物處死。

1.5 觀察項目 1）Barnes巴恩斯迷宮測試：Barnes迷宮實驗可以檢測實驗動物的空間學習記憶能力［7］。檢測前將大鼠會被置于目標盒內(nèi)30 s，測試時采用恒定的光刺激和聲刺激等干擾因素作為大鼠進入目標盒的動機。電針第3日開始檢測，實驗時把大鼠放置在圓形平臺中央的起始盒內(nèi)（黑色，不透明），撤走起始盒的同時開啟聲刺激和光刺激并開始300 s倒計時，攝像頭記錄其進入目標盒所用的時間（既逃避潛伏期）和探索錯誤洞口的次數(shù)，連續(xù)5 d。若大鼠在時間結(jié)束前未能進入目標盒，將逃避潛伏期算作300 s。每次測試結(jié)束后順時針旋轉(zhuǎn)上層圓形平臺18°并用消毒酒精紗布進行擦拭清洗平臺和目標盒，每次僅旋轉(zhuǎn)上層平臺但保持目標盒的相對空間位置不改變。2）Zea Longa評分：手術(shù)完成后2 h及干預的第1、3、7日進行Zea Longa神經(jīng)功能缺損評分，該評分由不知情的觀察者來完成。3）小動物磁共振儀掃描：小動物核磁共振成像分析系統(tǒng) （MiniMR-60 MRI system 7.0 T）對實驗大鼠進行T2WI掃描，觀察大鼠左側(cè)大腦梗死體積。T2WI掃描參數(shù) ：TR 2738 ms，TE 33 ms，TR/TE ＝4111.669/55 ms，F(xiàn)oV＝32×32mm，Averages＝2，Matrix＝256×256，Slices＝21，Slice Thickness=0.8 mm，Time=5 min 50 s， 每次掃描21層。T2WI掃描出的原始數(shù)據(jù)用Image J軟件進行腦梗死區(qū)域的計算。

1.6 免疫熒光染色 3組大鼠均于造模后第8日取材。選用腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉。先腹主動脈放血，夾閉腹主動脈切口近心端，迅速剪斷肋骨，打開胸腔，暴露心臟。在右心耳處剪一小口，隨后將灌胃針從左心尖部插入至主動脈弓，用注射器先后灌注0.9%氯化鈉溶液200 mL、4%多聚甲醛200 mL，迅速取出完整大腦，浸泡固定于4%多聚甲醛溶液。石蠟包埋切片。玻片微波修復后滴加5%驢血清和5%牛血清混合液封閉，37℃孵育2 h。滴加SYN一抗（ab8049，ABCAM，1∶50） 后置于 4 ℃冰箱內(nèi)孵育過夜，次日復溫后用0.01 mol/L PBS沖洗3次，每次5 min。于避光條件下滴加熒光二抗，在37℃烘箱內(nèi)避光孵育2 h，0.01 mol/L PBS清洗3次，每次5 min。 用PBS稀釋 DAPI（1∶1000），孵育 1 min，PBS 清洗 5 min?？篃晒獯銣缣幚砑胺馄?，封片劑風干后，立即用熒光倒置顯微鏡 （徠卡儀器公司）100倍下觀察，Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)對免疫熒光染色切片進行圖像分析，陽性細胞的免疫反應強度用平均光密度（OD值）表示。

1.7 統(tǒng)計學處理 應用SPSS20.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示。各個組間的比較均采用單因素方差分析，方差齊者用LSD法，方差不齊則用Games Howell法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較 見表1。缺血再灌注后2 h和干預第1、3、7日對各組大鼠進行Zea Longa神經(jīng)行為學評分，如表1所示：假手術(shù)組神經(jīng)功能正常；電針干預前模型組和電針組大鼠均存在不同程度的神經(jīng)功能缺損癥狀，組間比較無明顯差異（P＞0.05）；與假手術(shù)組相比，模型組和電針組均有明顯的差異（P＜0.01，P＜0.05）。干預后第 3、7 日，模型組和電針組大鼠Zea Longa評分逐漸下降，神經(jīng)功能障礙有不同程度的恢復，干預后第7日，電針組與模型組相比有顯著差異 （P＜0.05），表明電針百會、神庭穴對MCAO大鼠的神經(jīng)功能缺損癥狀改善明確。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較（分，±s）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較（分，±s）

與假手術(shù)組比較，*P＜0.01，**P＜0.001；與模型組比較，△P＜0.05

?組 別 n 干預前 第1日 第3日 第7日假手術(shù)組 6模型組 6 0 0 0 0 2.6 7±0.2 1*2.5 0±0.2 2*2.0 0±0.2 4**1.8 3±0.1 7*電針組 6 2.3 3±0.3 3 2.1 7±0.3 3 1.1 7±0.3 1△ 0.5 0±0.2 2△

2.2 各組大鼠腦梗死體積比較 見圖1，表2。各組大鼠在干預前（即造模后第24小時）及干預7 d后進行小動物磁共振T2WI檢測腦梗死體積。如圖1所示，其中缺血梗死部位為高信號白色區(qū)域。結(jié)果如表2所示：假手術(shù)組無高信號區(qū)域；干預前模型組和電針組未存在顯著差異（P＞0.05），而與模型組相比，電針百會、神庭7 d后腦梗死體積明顯降低（P＜0.01），表明電針百會、神庭穴對MCAO大鼠的腦部病變有明確療效。

圖1 各組大鼠磁共振T2加權(quán)成像

表2 各組大鼠腦梗死體積百分比比較（%，±s）

表2 各組大鼠腦梗死體積百分比比較（%，±s）

與假手術(shù)組比較，△P＜0.001；與模型組比較，▲P＜0.01，▲▲P＜0.001

組 別 n 干預前 第7日假手術(shù)組 6模型組 6 0 0 2 9.1 6 1±0.0 0 5△ 2 7.8 3±0.0 1 5△電針組 6 2 8.8 2 8±0.0 1 2 1 9.7 4 3±0.0 0 5▲

2.3 各組大鼠空間學習記憶能力比較 見圖2，表3、表4。Barnes迷宮實驗結(jié)果如表3、表4所示：模型組和電針組逃避潛伏期相較于假手術(shù)組均顯著增加；且與假手術(shù)組相比，模型組逃避潛伏期一直明顯延長，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。 在第 3、4、5、6 日各時間點，電針組的逃避潛伏期與模型組均明顯縮短，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。在電針干預的第7日，電針組逃避潛伏期明顯較模型組縮短，其差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。與此同時，電針組和模型組探索錯誤洞口次數(shù)較假手術(shù)組均顯著增加；但與模型組相比，電針組MCAO大鼠探索錯誤洞口的次數(shù)顯著減少，差異具有統(tǒng)計學意義（3 d：P＜0.05；4 d：P＜0.01；5 d：P＜0.05；6 d：P＜0.01；7 d：P＜0.001）。 從圖 2 中看出，電針干預第7日，假手術(shù)組探索路程最短，能快速找到目標盒，電針組探索路程稍長，耗時稍多。而模型組大鼠的探索軌跡遍布整個平臺，沒有明確的方向，進入目標盒的探索路程和時間均為最長。以上實驗結(jié)果表明電針百會、神庭穴對MCAO大鼠損傷的空間學習記憶能力有明顯改善。

圖2 干預第7日各組大鼠尋找目標洞口軌跡圖

表3 兩組大鼠逃避潛伏期比較（s，±s）

表3 兩組大鼠逃避潛伏期比較（s，±s）

與假手術(shù)組比較，△P＜0.001；與模型組比較，▲P＜0.01，▲▲P＜0.001

組 別 n 第3日 第4日 第5日第6日 第7日假手術(shù)組 6模型組 6 1 1 8.5 8±1 3.1 9 1 0 9.7 4±1 5.1 3 9 3.2 1±1 1.5 1 2 3 2.3 4±1 4.4 1△ 2 2 8.6 9±1 6.9 2△ 2 2 3.4 5±2 3.5 4△7 8.9 7±9.8 8 7 2.9 2±7.5 3 2 1 7.4 5±2 2.2 0△ 1 9 7.6 5±2 0.5 0△電針組 6 1 7 8.0 8±1 9.8 2▲ 1 7 1.9 6±9.0 6▲ 1 3 3.8 9±1 8.1 6▲1 2 9.4 8±1 6.5 8▲ 1 0 7.6 6±1 1.2 9▲▲

表4 兩組大鼠進入錯誤洞口次數(shù)比較（次，±s）

表4 兩組大鼠進入錯誤洞口次數(shù)比較（次，±s）

與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01，△△△P＜0.001

?組 別 n 第3日 第4日 第5日第6日 第7日假手術(shù)組 6模型組 6 1 4.7 2±1.7 5 1 1.5 6±0.8 7 1 3.1 7±1.2 5 2 4.1 1±1.8 0**2 0.8 3±1.5 3***2 1.6 7±2.8 1*1 1.0 0±0.8 2 8.5 0±0.7 6 1 8.3 3±1.8 9** 1 5.5 0±1.4 8**電針組 6 1 7.2 1±1.7 1△ 1 4.2 8±1.7 2△△ 1 3.5 0±1.6 9△1 2.5 0±1.2 3△△ 6.3 3±1.2 8△△△

2.4 各組大鼠海馬CA1區(qū)突觸素SYN表達的影響見圖3。免疫熒光結(jié)果顯示，假手術(shù)組海馬CA1區(qū)SYN表達最好，鏡下可見大量熒光著色細胞且分布密集；模型組大鼠SYN的表達（0.163±0.033）較假手術(shù)組（0.340±0.045）表達明顯減少（P＜0.05）；電針組 SYN 表達（0.300±0.103）較模型組顯著增加（P＜0.05）。 鏡下觀察到散在熒光作著色細胞，分布較密集。證明電針促進了MCAO大鼠海馬CA1區(qū)SYN的表達，進而可能增強其突觸可塑性。

圖3 各組海馬CA1區(qū)SYN表達（免疫熒光染色，100倍）

3 討 論

腦卒中是當前人類最主要的致殘因素和第二大死因，腦卒中后患者普遍會出現(xiàn)認知功能障礙。據(jù)國外研究報道，卒中后患者有大約2/3會出現(xiàn)認知障礙，而在中國，卒中后發(fā)生認知障礙的患者約占55.9%［8］。頭為諸陽之會、神明之府，調(diào)控人的認知與情感，且手足陽經(jīng)皆匯集于頭部，而督脈總督一身之陽脈，是人體“陽脈之海”。因此選擇督脈的穴位治療認知功能障礙具有扎實的理論基礎(chǔ)。百會穴，主醒腦開竅，是督脈要穴，其穴居巔頂，聯(lián)系腦部，古人稱之為“三陽五會”。其對于調(diào)節(jié)人體的陰陽平衡，使經(jīng)氣通達周身的大小經(jīng)穴起著重要的作用。神庭穴為上行之氣之聚集，《針灸甲乙經(jīng)》記載其有寧神、開竅之功。因此本研究選用神庭、百會穴配伍。

針刺對腦缺血模型大鼠的神經(jīng)功能缺損療效顯著。黃衛(wèi)玲等［9］研究表明電針百會、四神聰?shù)妊ǖ木C合療效優(yōu)于對照組，治療后，神經(jīng)功能缺損程度評分亦優(yōu)于對照組。譚峰等［10］研究發(fā)現(xiàn)針刺百會、大椎穴可顯著改善大鼠腦梗死后神經(jīng)功能，且效果優(yōu)于同時間點腦梗死組。潘江等［11］研究發(fā)現(xiàn)針刺督脈經(jīng)穴能減小腦梗死體積和腦梗死率，具有抗神經(jīng)損傷及神經(jīng)修復的作用。張?zhí)N等［12］研究表明，電針能明顯減少MCAO大鼠腦梗死體積，保護腦部神經(jīng)元，改善學習記憶功能障礙。本實驗證明電針神庭、百會穴可以顯著降低MCAO大鼠腦梗死的體積并對其神經(jīng)功能損傷有明顯療效。

針刺對癡呆模型大鼠的認知功能障礙療效顯著。何甜等［13］通過對血管癡呆模型大鼠針刺后進行水迷宮測試研究發(fā)現(xiàn)與模型組相比，針刺組在訓練時游泳距離明顯縮短，測試時穿越平臺次數(shù)較模型組增加明顯，這表明電針可以明顯改善VD大鼠的空間學習記憶的獲得和儲存能力。張全愛等［14］通過對SAMP8模型小鼠研究發(fā)現(xiàn)在水迷宮測試中，針刺組在有效區(qū)停留時間顯著延長，穿越次數(shù)顯著升高，提示針刺能有效改善該模型小鼠的學習記憶能力。本研究采用Barnes迷宮檢測實驗動物的學習記憶能力，研究發(fā)現(xiàn)電針組大鼠進入目標洞口的時間顯著縮短、進入錯誤洞口的次數(shù)明顯減少，提示電針對MCAO大鼠的認知功能障礙起到改善作用。

SYN是位于突觸前膜的特異性標志蛋白，突觸的數(shù)量及生成密度可以由SYN的數(shù)量和分布密度間接反映，同時SYN與神經(jīng)可塑性密切相關(guān)［15］。卿鵬等［16］通過針刺局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠百會、曲池、后三里穴發(fā)現(xiàn)，海馬CA3區(qū)SYN的表達顯著增加，表明針刺能有效促進大鼠神經(jīng)功能的恢復及中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能重塑。韓永升等［17］研究表明電針組SYN表達在各時間點較模型組顯著增加，差異均有顯著性，提示針刺可促進局灶性腦梗死大鼠腦缺血區(qū)周圍皮質(zhì)突觸素的表達，增強神經(jīng)可塑性。林曉敏等［18］通過免疫組化發(fā)現(xiàn)電針MCAO模型鼠的百會、神庭穴會導致其海馬區(qū)的SYN表達明顯增高（P＜0.01），證明電針百會、神庭穴可以起到調(diào)控SYN表達的效果。本研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠海馬CA1區(qū)SYN的表達較假手術(shù)組明顯減少；電針組SYN表達較模型組顯著增加，鏡下觀察到散在熒光著色細胞且分布較密集，表明電針能夠促進MCAO大鼠海馬CA1區(qū)SYN的表達，增強突觸可塑性，從而改善學習記憶功能。

綜上所述，電針神庭、百會穴對MCAO大鼠的認知功能障礙療效顯著，其可能的作用機制與促進海馬CA1區(qū)突觸素SYN的表達，進而改善突觸可塑性有關(guān)。但電針通過何種通路調(diào)控SYN的表達仍需進一步深入研究。