沈俊逸 方邦江 趙智明 劉春麗 壯雨雯 徐文俊 蔡 輝△

（1.南京軍區(qū)南京總醫(yī)院，江蘇 南京 210002；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海200032）

糖尿病引起代謝紊亂并導(dǎo)致毛細(xì)血管、大血管的病變，是引發(fā)腦梗死的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素［1-2］。與非糖尿病腦梗死患者相比，糖尿病急性腦梗死患者的腦部血管狹窄病變支數(shù)更多、程度更嚴(yán)重［3-4］。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病影響側(cè)支循環(huán)的建立，當(dāng)糖尿病患者血糖水平升高時(shí)，體內(nèi)單核細(xì)胞參與的毛細(xì)血管或者大血管的形成以及血管重塑的能力顯著減弱［5-9］。微小RNAs（microRNAs）在糖尿病及其血管等并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展過程中具有非常重要的作用［10-12］。microRNA-503是microRNA的一個(gè)亞型，其調(diào)控生物機(jī)體內(nèi)的各種血管，包括動(dòng)脈、靜脈血管以及毛細(xì)血管的內(nèi)壁內(nèi)皮細(xì)胞的生理功能，microRNA-503表達(dá)過度時(shí)，會(huì)導(dǎo)致血管的壞死，抑制血管的新生。而通過上調(diào)細(xì)胞周期蛋白E1（CCNE1）和 cell division cycle 25 A（CDC25A），在一定程度上能夠抑制microRNA-503的表達(dá)，從而改善各種血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能，避免了其損傷的發(fā)生，并且能夠幫助微血管網(wǎng)絡(luò)形成，促進(jìn)血管新生。因此，micro RNA-503核酸的表達(dá)水平對(duì)糖尿病相關(guān)的血管并發(fā)癥的治療具有非常重要的參考價(jià)值以及臨床意義［13-17］。本研究應(yīng)用中藥復(fù)方復(fù)元醒腦湯干預(yù)糖尿病腦梗死大鼠，觀察其對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠缺血腦組織的血管新生及腦部微循環(huán)的影響，以期從microRNA-503調(diào)控途徑闡釋復(fù)元醒腦湯起效的具體機(jī)制和作用靶點(diǎn)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

150只健康雄性 SD 大鼠，體質(zhì)量（250±25）g，購(gòu)自上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物合格證：SCXK（滬）2011-009。

1.2 試藥與儀器

復(fù)元醒腦湯：人參（另煎）10 g，三七10 g，石菖蒲12 g，水蛭 10 g，益母草 30 g，生南星 15 g，制大黃（后下）9 g。復(fù)元醒腦湯生藥質(zhì)量濃度388 g/L，來自南京軍區(qū)南京總醫(yī)院藥劑科。二甲雙胍（西安海欣制藥有限公司，規(guī)格 1.25 mg/250 mg，國(guó)藥準(zhǔn)字 H20041400），尼莫地平（江蘇康緣弘道醫(yī)藥有限公司，規(guī)格60 mg，批號(hào)H20066423）。鏈脲佐菌素（STZ，美國(guó)Sigma公司）；TTC染色液（2%）購(gòu)于上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司；蛋白濃度BCA法測(cè)定試劑盒購(gòu)于美國(guó)Thermo公司；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購(gòu)于上海市碧云天生物技術(shù)有限公司；Actin抗體購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；CDC25A抗體購(gòu)于香港Abcam公司；CCNE1抗體購(gòu)于美國(guó)Millipore公司，引物購(gòu)于生物工程（上海）股份有限公司。RNA抽提試劑，cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和Syber Green定量PCR試劑盒購(gòu)于日本Takara公司。RIPA裂解液，BCA蛋白定量試劑盒和ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物公司。高脂飼料（蛋白質(zhì)21%、碳水化合物20%、脂肪59%）和正常飼料（碳水化合物64%、蛋白質(zhì)23%、脂肪13%）由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司生產(chǎn)。

1.3 造模與分組

150只實(shí)驗(yàn)大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法均分為5組：空白對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組、西藥治療組、中藥治療組，每組30只?？瞻讓?duì)照組喂食正常大鼠飼料；假手術(shù)組、模型組、西藥治療組和中藥治療組的大鼠先腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ，美國(guó) Sigma 公司）50 mg/kg，隨后采用高脂肪食物飼養(yǎng)2周，連續(xù)測(cè)量1周血糖大于16.6 mmol/L為造模成功。將3/0單股尼龍線，放到肝素鈉中浸泡，用10%水合氯醛（0.35 mL/100 g）麻醉糖尿病模型大鼠，在頸部正中偏右側(cè)進(jìn)行豎直切口，剝離出右側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA）、頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA）和頸外動(dòng)脈（ECA）。結(jié)扎ECA起始端和CCA近心端，用眼科剪在CCA遠(yuǎn)心端和近心端之間剪一個(gè)小口距離頸總動(dòng)脈分叉5 mm，經(jīng)CCA插入3/0尼龍線至大腦中動(dòng)脈起始段，深度為（18.5±0.5） mm；維持體溫（37.0±0.5） ℃。用乙醚再次麻醉大鼠于術(shù)后2 h把尼龍線輕輕拔退1 cm，作為再灌注0 h?？瞻讓?duì)照組不做任何處理。假手術(shù)組插線深度為10 mm，余同實(shí)驗(yàn)組。本實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物處理方法符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 給藥方法

完成造模后，中藥治療組灌胃復(fù)元醒腦湯10.4g/（kg·d），每日 2次。西藥治療組灌胃二甲雙胍 27 mg/（kg·d），每日 2 次；尼莫地平 2.16 mg/（kg·d），每日 2 次。 空白對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組均灌胃等量的0.9%氯化鈉注射液。各組連續(xù)灌胃14 d后處死取材。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè)

10%水合氯醛深度麻醉后，快速對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行斷頭，迅速剝離顱骨，小心取出腦組織［18］，10%中性固定液固定腦組織48h，然后進(jìn)行腦組織脫水、石蠟包埋，最后將組織切成5 μm厚的切片。使用免疫熒光染色（VEGF）觀察腦部微血管，細(xì)胞核用DAPI染色。使用正立微循環(huán)觀察系統(tǒng)動(dòng)態(tài)觀察大鼠鼠腦細(xì)靜脈中紅細(xì)胞流速、血管管徑、白細(xì)胞滾動(dòng)和黏附、白蛋白漏出等腦部血管微循環(huán)的改變。

1.5.1 腦組織 CDC25A、CCNE1、microRNA-503基因表達(dá)水平檢測(cè) 采用Real-Time PCR技術(shù)，檢測(cè)腦組織CDC25A、CCNE1、microRNA-503基因表達(dá)水平。具體引物序列如下。microRNA-503 F：TAGCAGCGGGA ACAGTTC。microRNA-503 microRNA-503 R：GTGCA GGGTCCGAGGT。CDC25A F：GGGAATGAGCAGCCTC TTCTTCDC25AR。ATCTCTACAAACCAGACCAGGG；C CNE1F：ACAGCTAGCGCGGTGTAGCCNE1R：GGACTT GGAACTCAGACCCGGAPDHF：ACTTTGGCATCGTGG AAGGGGAPDHF：TGCAGGGATGATGTTCTGGG。用RNA抽提試劑盒抽提腦組織中的RNA，根據(jù)Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)Syber Green定量PCR試劑盒說明書將反轉(zhuǎn)錄后的cDNA進(jìn)行定量PCR。PCR條件采用兩步法：98℃ 10 s，58℃20 s，40 次循環(huán)。

1.5.2 腦組織中的CDC25A、CCNE1蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 采用常規(guī)的Western blotting實(shí)驗(yàn)方法［19］檢測(cè)腦組織中的CDC25A、CCNE1蛋白表達(dá)量。用RIPA裂解液進(jìn)行組織勻漿，離心后用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量，上樣30 μg蛋白/孔，進(jìn)行SDS-PGAE電泳，PVDF轉(zhuǎn)膜，孵育CDC25A和CCNE1抗體，孵育二抗，最后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒在Biorad化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 復(fù)元醒腦湯對(duì)各組實(shí)驗(yàn)大鼠腦部微循環(huán)功能的影響

使用正立微循環(huán)儀觀察復(fù)元醒腦湯對(duì)腦梗死腦部微循環(huán)的作用?？瞻讓?duì)照組：紅細(xì)胞流速較快、血管管徑比較粗、白細(xì)胞滾動(dòng)正常且沒有黏附，沒有白蛋白漏出。假手術(shù)組：紅細(xì)胞流速較慢、血管管徑較細(xì)、白細(xì)胞滾動(dòng)慢且有白細(xì)胞黏附現(xiàn)象，有白蛋白漏出現(xiàn)象。模型組：紅細(xì)胞流速較慢、血管管徑較細(xì)、白細(xì)胞滾動(dòng)慢有白細(xì)胞黏附現(xiàn)象，有白蛋白漏出現(xiàn)象。西藥治療組：紅細(xì)胞流速正常、血管管徑較粗、白細(xì)胞滾動(dòng)正常，少見白細(xì)胞黏附現(xiàn)象，白蛋白漏出現(xiàn)象不明顯。中藥治療組：紅細(xì)胞流速正常、血管管徑較粗、白細(xì)胞滾動(dòng)正常，少見白細(xì)胞黏附現(xiàn)象，白蛋白漏出現(xiàn)象不明顯（圖1）。

圖1 各組腦血管微循環(huán)觀察

2.2 復(fù)元醒腦湯對(duì)腦梗死后缺血腦組織部位血管新生的影響

血管的新生需要多種生長(zhǎng)因子，其中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）是非常重要的一種，這種生長(zhǎng)因子能夠有效地促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，在血管新生和血管生成的各個(gè)階段發(fā)揮著重要作用，VEGF是血管新生的一個(gè)重要指標(biāo)，是血管新生的關(guān)鍵因子。通過對(duì)不同組別大鼠腦組織VEGF的免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：空白對(duì)照組血管數(shù)量豐富，管壁比較厚，官腔飽滿；假手術(shù)組的管壁較薄，管腔比較粗；模型組血管數(shù)量少，管腔破損嚴(yán)重；西藥治療組的管壁增厚；中藥治療組的管壁增厚，有一定的血管新生現(xiàn)象，管腔增大。以上數(shù)據(jù)提示中藥治療組和西藥治療組均對(duì)糖尿病腦梗死組織的血管新生有促進(jìn)要作用，且中藥治療組優(yōu)于西藥治療組（圖2）。對(duì)照組血管數(shù)量豐富管壁比較厚，官腔飽滿；假手術(shù)病組管壁較薄，模型組血管數(shù)量少官腔破損；西藥治療組的管壁增厚，管腔??；中藥治療組的管壁增厚，管腔增大提示中藥治療組對(duì)腦血管的功能恢復(fù)有重要作用。

圖2 各組腦血管免疫熒光

2.3 復(fù)元醒腦湯調(diào)控microRNA-503、CCNE1、CDC25A mRNA水平的表達(dá)

各組實(shí)驗(yàn)大鼠缺血部位腦組織中抽提RNA，做熒光定量檢測(cè)microRNA-503基因的表達(dá)量以及CCNE1、CDC25A基因的表達(dá)水平，結(jié)果顯示：模型組缺血腦組織中microRNA-503表達(dá)明顯上調(diào)；與模型組相比，西藥和中藥治療組大鼠缺血腦組織中microRNA-503的基因表達(dá)明顯降低（P＜0.01），中藥治療組和西藥治療組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；相對(duì)于模型組，空白對(duì)照組和假手術(shù)組的microRNA-503表達(dá)量都比較低，空白對(duì)照組和假手術(shù)組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與模型組比較，中藥治療組和西藥治療組的大鼠缺血腦組織中CCNE1、CDC25A的mRNA表達(dá)上調(diào)（P＜0.01），從而反向抑制了microRNA-503的基因表達(dá)（表 1）。

表1 不同處理組microRNA-503、CDC25A和CCNE1的相對(duì)基因表達(dá)量（n=30，±s）

表1 不同處理組microRNA-503、CDC25A和CCNE1的相對(duì)基因表達(dá)量（n=30，±s）

與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.01。 下同

基因 空白對(duì)照組假手術(shù)組 模型組 西藥治療組中藥治療組m i c r o R N A-5 0 3 1.0 0±0.0 6 C D C 2 5 A 1.0 1±0.1 4 1.2 2±0.0 4 6.7 8±0.8 2*2.1 6±0.2 9△ 1.5 9±0.4 2△1.0 0±0.0 1 0.1 4±0.0 2*0.6 4±0.0 5△ 0.7 5±0.0 4△C C N E 1 1.0 1±0.2 4 1.0 4±0.1 1 0.3 1±0.0 5*0.9 9±0.0 6△ 0.9 9±0.1 2△

2.4 復(fù)元醒腦湯促進(jìn)CNNE1、CDC25A蛋白水平的表達(dá)

除了從RNA水平進(jìn)行相關(guān)機(jī)制的研究，我們也在蛋白表達(dá)水平上對(duì)細(xì)胞周期蛋白CCNE1和CDC25A蛋白進(jìn)行了WB檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)中藥治療組和西藥治療組大鼠缺血腦組織中CCNE1、CDC25A的蛋白表達(dá)水平均上調(diào)。以上結(jié)果表明，復(fù)元醒腦湯和西藥治療在對(duì)疾病的治療過程中可以通過促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白CCNE1和CDC25A蛋白的表達(dá)，而抑制microRNA-503的表達(dá)水平，從而影響了糖尿病腦梗死大鼠缺血腦組織中的血運(yùn)重建過程（圖3，表2）。

3 討 論

復(fù)元醒腦湯治療糖尿病腦梗死具有良好的臨床效果，我們對(duì)作用機(jī)制進(jìn)行了一些相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究，復(fù)元醒腦湯改善了糖尿病腦梗死患者神經(jīng)功能，降低血-腦屏障的通透性，減輕了腦水腫；減輕了胰島素抵抗；復(fù)元醒腦湯還能夠提升腦組織中CXCR4、SDF-1、VEGF的蛋白的表達(dá)水平，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的歸巢，促進(jìn)梗死區(qū)域的神經(jīng)和微血管新生，缺血腦組織血供的改善，有利于神經(jīng)功能的修復(fù)［20-22］。

圖3 各組腦組織CCNE1和CDC25A的蛋白含量表達(dá)

表2 各組CDC25A和CCNE1蛋白的灰度掃描值（n=30，±s）

表2 各組CDC25A和CCNE1蛋白的灰度掃描值（n=30，±s）

基因 空白對(duì)照組假手術(shù)組 模型組 西藥治療組 中藥治療組C D C 2 5 A 0.3 5±0.0 3 0.4 0±0.0 4 0* 0.0 8±0.0 1△ 0.1 1±0.0 1△C C N E 1 0.6 5±0.0 7 0.5 7±0.0 6 0.2 2±0.0 2*0.7 6±0.0 8△ 0.8 8±0.0 9△

糖尿病并發(fā)腦梗死屬于消渴并發(fā)“中風(fēng)”，消渴以燥熱為標(biāo)、陰虛為本，中風(fēng)主要表現(xiàn)為肝臟和腎臟的陰虛以及氣血阻滯。糖尿病并發(fā)腦梗死的治療應(yīng)以扶持元?dú)鉃楸荆o以化痰祛瘀、息風(fēng)泄熱、醒腦開竅。自擬復(fù)元醒腦湯（治療糖尿病腦梗死取得了良好臨床療效。方中人參大補(bǔ)元?dú)鉃榫簧炷闲?、石菖蒲豁痰瀉濁開竅，益母草、三七、水蛭活血逐瘀；大黃瀉熱涼血以息風(fēng)。

復(fù)元醒腦湯作為一種復(fù)方，其作用機(jī)制是多靶點(diǎn)的，對(duì)復(fù)元醒腦湯多種作用機(jī)制的深入研究有利于更加明確其作用機(jī)制。本研究證實(shí)，復(fù)元醒腦湯上調(diào)了細(xì)胞周期蛋白CCNE1和CDC25A蛋白的表達(dá)，降低了實(shí)驗(yàn)糖尿病腦梗死大鼠microRNA-503的表達(dá)。糖尿病是一種代謝性疾病，表現(xiàn)為胰島素分泌不足和胰島素抵抗，同時(shí)血糖過高會(huì)造成的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。miRNA-503能在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控相關(guān)靶基因蛋白質(zhì)的表達(dá)的作用，參與體內(nèi)葡萄糖的動(dòng)態(tài)平衡的調(diào)節(jié)；miRNA-503可以調(diào)控胰島素的分泌、胰島的發(fā)育、胰島β細(xì)胞的增殖與凋亡，從而調(diào)節(jié)糖類代謝。microRNA-503可以調(diào)控體內(nèi)的各種血管生理功能，糖尿病腦梗死的病例狀態(tài)下，microRNA-503的上調(diào)會(huì)抑制血管的新生。microRNA-503的下調(diào)不但能降低血糖，還能而改善血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能，并且能夠幫助微血管網(wǎng)絡(luò)形成，促進(jìn)血管新生。二甲雙胍是治療2型糖尿病的臨床常用藥物，可促進(jìn)脂肪組織攝取葡萄糖，使肌肉組織無氧酵解增加，增加葡萄糖的利用，減輕胰島素抵抗，減少葡萄糖經(jīng)消化道吸收。尼莫地平對(duì)腦組織受體有高度選擇，容易透過血腦屏障。通過有效地阻止鈣離子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)、抑制平滑肌收縮，達(dá)到解除血管痙攣之目的，從而保護(hù)了腦神經(jīng)元，穩(wěn)定其功能及增進(jìn)腦血灌流，改善腦供血，提高對(duì)缺氧的耐受力。尼莫地平還能降低紅細(xì)胞脆性及血液黏稠度，抑制血小板聚集，抗血栓形成，在適宜劑量下選擇性擴(kuò)張腦血管，幾乎不影響外周血管。西藥治療組使用二甲雙胍和尼莫地平聯(lián)合用藥，提高了周期蛋白CCNE1和CDC25A蛋白的表達(dá)，顯著降低了microRNA-503的表達(dá)，通過微循環(huán)觀察儀檢測(cè)，西藥治療后腦缺血部位血管增粗，血流加快，蛋白滲漏減少。VEGF免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)腦梗死大鼠梗死區(qū)域的新生血管的數(shù)量增多，血管的管徑增粗。與西藥治療組相比，中藥治療組腦梗死組織的CCNE1和CDC25A蛋白表達(dá)也顯著提高，microRNA-503的表達(dá)降低，同時(shí)也顯著提高了梗死區(qū)域的腦部微循環(huán)，促進(jìn)了梗死區(qū)域微血管的再生。這說明中藥治療組和西藥治療組都能通過CCNE1和CDC25A蛋白和micro RNA-503信號(hào)通路發(fā)揮治療糖尿病腦梗死的作用。

腦梗死后微循環(huán)水平上的缺血，這種缺血的癥狀可同時(shí)啟動(dòng)多種損傷機(jī)制，導(dǎo)致缺血級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終造成神經(jīng)元損傷，從而加重相應(yīng)的臨床癥狀。缺血同時(shí)還會(huì)導(dǎo)致血管內(nèi)壁的內(nèi)皮細(xì)胞的功能失調(diào)和凋亡，引起血管壁的病變。糖尿病發(fā)生后，血糖高血管新生能力下降，腦梗死后局部血氧供應(yīng)降低更加顯著地降低了血管新生的能力。血管新生對(duì)于腦梗死后缺血腦組織有重要的意義，新生的血管能吸收部分炎癥因子和減輕腦水腫；同時(shí)還能為腦組織提供更多的營(yíng)養(yǎng)成分，促進(jìn)腦梗死組織的修復(fù)；腦梗死后充分而有效的側(cè)支循環(huán)能夠發(fā)揮很重要的作用，動(dòng)脈阻塞后局部組織血液供應(yīng)得到改善，也可以避免靜脈阻塞后局部組織發(fā)生淤血現(xiàn)象。

復(fù)元醒腦湯的作為復(fù)方其作用靶點(diǎn)是多方面的，作用機(jī)制也是復(fù)雜的，我們從microRNA-503和CCNE1和CDC25A這條信號(hào)通路分析復(fù)元醒腦湯的作用機(jī)制，這有助于我們加深對(duì)糖尿病腦梗死病理機(jī)制的認(rèn)識(shí)，同時(shí)為糖尿病腦梗死的治療提供了新的思路。