吳 濤，肖良俊，陳少瑜，陳海云，寧德魯*

(1.云南省林業(yè)科學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南省木本油料工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650201；3.云南省森林植物培育與開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家林業(yè)局云南珍稀瀕特森林植物保護(hù)和繁育實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201)

【研究意義】云南省是深紋核桃(Juglanssigillata)的主要起源分布中心和栽培區(qū)域，截止2015年底已種植282萬(wàn)hm2，產(chǎn)量達(dá)到85萬(wàn)t，產(chǎn)值為266億元，面積、產(chǎn)量和產(chǎn)值均居全國(guó)之首。漾濞泡核桃是云南傳統(tǒng)主栽的深紋核桃品種，但存在結(jié)實(shí)晚(約10 a左右)、受益慢等問(wèn)題。據(jù)此，云南省林業(yè)科學(xué)院通過(guò)種間雜交途徑，用漾濞泡核桃與早實(shí)核桃(J.regia)進(jìn)行雜交，培育出云新高原等早實(shí)雜交新品種核桃，并于2004年通過(guò)云南省林木品種審定委員會(huì)審定[1]。云新高原核桃的母本漾濞泡核桃樹(shù)體高大、樹(shù)勢(shì)旺，小葉9～13片、多13片，結(jié)果枝多為中長(zhǎng)果枝，種子刻紋深。云新高原核桃的父本為早實(shí)核桃優(yōu)良單株‘云林A7’樹(shù)體中等、樹(shù)勢(shì)較弱，小葉7～9片、多7片，結(jié)果枝以中短果枝為主，種子表面光滑。云新高原樹(shù)勢(shì)中等，樹(shù)姿開(kāi)張，小葉9～11片、多9片，結(jié)果枝多為中果枝，種子刻紋淺、表面較光滑。綜合來(lái)看，云新高原的樹(shù)高、干徑、冠幅與父本相近，在早結(jié)實(shí)(1～3年開(kāi)花結(jié)果)、頂芽形狀、腋芽形狀、有無(wú)芽距(主副芽是否分開(kāi))等習(xí)性上偏向于父本，復(fù)葉長(zhǎng)、小葉數(shù)、小葉形狀等性狀介于雙親之間，呈趨中變異。在調(diào)查云南省核桃資源中，發(fā)現(xiàn)一些兼具深紋核桃和核桃特點(diǎn)的資源。鑒于云南曾于40年代進(jìn)行過(guò)核桃的大面積引種栽培，推測(cè)這些資源可能是二者的天然雜交種。為此，希望能通過(guò)研究掌握人工雜交種云新高原的葉綠體基因組的遺傳規(guī)律，來(lái)對(duì)這些“疑似雜交種”的身份進(jìn)行確認(rèn)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】葉綠體DNA(cpDNA)屬于細(xì)胞質(zhì)基因，為綠色植物所特有，其遺傳方式有別于核基因的遺傳方式，屬于細(xì)胞質(zhì)遺傳，在被子植物中存在雙親質(zhì)體遺傳和單親質(zhì)體遺傳兩種類型，通常以單親母系遺傳方式為主，而父系質(zhì)體遺傳在裸子植物中較為普遍[2-4]。葉綠體基因組很小，進(jìn)化較慢，不存在基因重組和結(jié)構(gòu)變異，更加便于遺傳進(jìn)化研究[5]。近年來(lái)，以特定片段測(cè)序?yàn)榇淼牡谌鶧NA分子標(biāo)記技術(shù)，因具特異性強(qiáng)、通量高和高效快捷的優(yōu)點(diǎn)而受到廣泛的關(guān)注和應(yīng)用[6]。研究者利用小片段葉綠體DNA測(cè)序的方法進(jìn)行遺傳多樣性的研究，取得了較好的結(jié)果[7-10]。目前，DNA分子標(biāo)記已經(jīng)廣泛應(yīng)用于核桃遺傳多樣性研究[11]，但關(guān)于cpDNA標(biāo)記在核桃遺傳多樣性研究中的應(yīng)用較少?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】基于核桃葉綠體基因組DNA序列信息，設(shè)計(jì)核桃cpDNA分子標(biāo)記引物，并對(duì)云新核桃及其親本的葉綠體DNA進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的序列檢測(cè)、分析和比較。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】一是檢測(cè)核桃葉綠體基因的遺傳特性，二是開(kāi)發(fā)出可應(yīng)用于核桃起源及遺傳多樣性研究的分子標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

云新高原核桃(Juglanssigillata×J.reigacv. ‘Yunxingaoyuan’)、母本漾濞泡核桃(J.sigillatacv. ‘Yangpao’)、父本早實(shí)核桃(J.reigacv. ‘Yunlin A7’)的樹(shù)齡分別為10年、20年、25年，均種植在云南省林業(yè)科學(xué)院核桃資源圃內(nèi)。2017年5月采集健康新鮮葉片，即時(shí)移入實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行DNA提取。

1.2 研究方法

1.2.1 總DNA提取 總DNA用CTAB法提取。獲得的總DNA經(jīng)0.8 %的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，用超微量紫外分光光度計(jì)ND2000測(cè)定濃度和純度，然后稀釋為40 ng/μl，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì) Hu等[12]獲得了核桃屬5個(gè)種的葉綠體基因組全長(zhǎng)。本試驗(yàn)以其中的深紋核桃和核桃的cpDNA全長(zhǎng)序列為基礎(chǔ)(NCBI登錄號(hào)分別為KX424843和KT963008)，首先使用DNAMAN對(duì)二者的全長(zhǎng)序列進(jìn)行差異分析，然后使用Primer 5.0軟件針對(duì)差異位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)引物序列(表1)，引物均由昆明碩擎生物科技有限公司合成。

1.2.3 PCR擴(kuò)增與測(cè)序 PCR反應(yīng)體系總體積20 μl，其中PCR Mixer 10 μl，引物(濃度10 μmol/L)各0.5 μl， DNA模板1 μl，ddH2O 8 μl。PCR擴(kuò)增反應(yīng)在擴(kuò)增儀(Biometra TGradient，Germany)中進(jìn)行，反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物用1 %瓊脂糖膠電泳檢測(cè)，在凝膠成像儀上觀察并切取目的條帶，使用凝膠回收試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)回收，回收產(chǎn)物送昆明碩擎生物科技有限公司采用ABI 3730XL自動(dòng)測(cè)序儀(Applied Biosystems，USA)進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理與分析 測(cè)序結(jié)果使用ContigExpress軟件觀察峰圖并進(jìn)行序列拼接及人工校對(duì)，手動(dòng)刪除序列兩端50～60 bp不可靠的位點(diǎn)，拼接好的序列用 DNAMAN 9.0進(jìn)行比對(duì)和差異位點(diǎn)的分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 深紋核桃與核桃的葉綠體基因組序列差異分析

深紋核桃和核桃的葉綠體基因組全序列于2017年成功測(cè)序[12]，全序列長(zhǎng)度分別為160 350和160 367 bp。經(jīng)序列對(duì)比分析，其序列變異信息見(jiàn)

表1 核桃葉綠體DNA擴(kuò)增引物序列信息

表2。深紋核桃和核桃的葉綠體基因組間僅有14個(gè)差異位點(diǎn)，總變異序列長(zhǎng)度為30 bp，變異率為0.019 %。其中，單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)(SNP數(shù))有7個(gè)，2個(gè)為堿基轉(zhuǎn)換，5個(gè)為堿基顛換；插入/缺失位點(diǎn)數(shù)(InDel數(shù))有7個(gè)，6個(gè)為單堿基的InDel，1個(gè)為17堿基的InDel。分析結(jié)果表明，深紋核桃與核桃葉綠體基因組存在明顯的差異，但二者不存在大范圍的結(jié)構(gòu)變異。

2.2 云新高原核桃與其親本的葉綠體基因組擴(kuò)增片段多態(tài)性分析

根據(jù)深紋核桃與核桃的葉綠體基因組間存在的14個(gè)變異位點(diǎn)，分別對(duì)云新高原及其父本(云林A7)、母本(漾濞泡核桃)的14個(gè)葉綠體基因片段進(jìn)行測(cè)序及分析。結(jié)果表明，云新高原與母本在14個(gè)變異穩(wěn)點(diǎn)上，堿基完全一致，但二者均與深紋核桃葉綠體模式基因組序列(KX424843)在115 907位點(diǎn)存在1個(gè)SNP(G/A堿基轉(zhuǎn)換)，變異之后與核桃葉綠體模式基因組序列(KT963008)保持一致；云新高原的父本與核桃葉綠體模式基因組序列(KT963008)存在2個(gè)SNP(132 545位點(diǎn)存在1個(gè)A/T堿基顛換，134 335位點(diǎn)存在1個(gè)T/C堿基轉(zhuǎn)換)，而云新高原與其父本在所檢測(cè)的14個(gè)位點(diǎn)中，僅有11個(gè)位點(diǎn)存在差異。綜合表2可以看出，14個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)中，云新高原與母本完全一致，而與父本存在11個(gè)位點(diǎn)的差異(占79 %)，且差異位點(diǎn)僅有1個(gè)發(fā)生于基因編碼區(qū)(占9 %)，其余10個(gè)位點(diǎn)均位于非編碼的基因間隔區(qū)(占91 %)。

另外，對(duì)9034(psbK-psbI基因間隔區(qū))和118 575(ndhF-rpl32基因間隔區(qū))變異位點(diǎn)檢測(cè)的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，這2個(gè)擴(kuò)增片段還分別含有8和14個(gè)變異位點(diǎn)，具體信息見(jiàn)圖1。由圖1可以看出，在這22個(gè)變異位點(diǎn)中，云新高原與其母本在其中10個(gè)位點(diǎn)上具有相同的SNP或InDel，余下的12個(gè)位點(diǎn)與其父本的相同。

2.3 云新高原核桃與其親本的葉綠體基因單倍型差異分析

對(duì)云新高原核桃和其親本的11個(gè)基因或基因間隔區(qū)片段進(jìn)行單倍型分析，共發(fā)現(xiàn)有11種單倍型(表3)，其中10個(gè)單倍型均表現(xiàn)為母系遺傳，而剩余的ndhF-rpl32片段的單倍型較為復(fù)雜，存在7種亞單倍型，其中4種表現(xiàn)為母系遺傳，3種表現(xiàn)為父系遺傳，即云新高原核桃的ndhF-rpl32片段的單倍型表現(xiàn)為雙親遺傳。

表2深紋核桃、核桃、種間雜交種云新高原及其親本的葉綠體基因序列差異比較

Table 2 Comparisons of chloroplast DNA difference and polymorphism amongJ.sigillatacv. ‘Yangpao’,J.regia‘Yunlin A7’ and interspecific hybrid ‘Yunxingaoyuan’

變異類型Type變異位置Position深紋核桃J. sigillata核桃J. regia云新高原‘Yunxingaoyuan’漾濞泡核桃J. sigillata cv. ‘Yangpao’云林核桃J. regia ‘Yunlin A7’所在區(qū)域Region基因片段DNA nameSNP51 023TGTTGLSCrps4-trnTSNP56 262ATAATLSCndhC-trnVSNP115 907GAAAAIRaycf1SNP121 269ATAATSSCccsA-ndhDSNP130 197ACAACSSCycf1SNP132 545TATTTSSCycf1SNP134 335CTCCCIRbycf1InDel9 034-T--TLSCpsbK-psbIInDel35 041A-AA-LSCtrnE-trnTInDel35 914A-AA-LSCtrnM-psbDInDel64 845-T--TLSCpsaI-ycf4InDel118 412A-AA-SSCndhF-rpl32InDel118 575-A--ASSCndhF-rpl32InDel121 229～121 245-#1--#1SSCccsA-ndhD

注：“-”表示堿基缺失(InDel)；“#1”表示序列TATTTTTAACTTAAGTT；“LSC”表示大單拷貝區(qū)域；“SSC”表示小單拷貝區(qū)域；“IR”表示反向重復(fù)序列。

Note：‘-’: Base deletion (indels); ‘#1’: TATTTTTAACTTAAGTT; ‘LSC’: Large single-copy; ‘SSC’: Small single-copy; ‘IR’: Inverted repeat.

*：堿基缺失*: single nucleotide deletion圖1 云新高原核桃及其親本與深紋核桃葉綠體模式基因組序列的2個(gè)片段的多態(tài)性比較Fig.1 Comparisons of two chloroplast DNA fragments polymorphism among ‘Yunxingaoyuan’, its parents and Juglans sigillata model sequence

編號(hào)No.基因片段DNA name變異位置Position單倍型 Haplotype漾濞泡核桃J. sigillata cv. ‘Yangpao’云林A7核桃J. regia ‘Yunlin A7’云新高原‘Yunxingaoyuan’1psbK-psbI9034A1A2A12psbI-trnS9256,9258,9279,9285,9312B1B2B13trnS9325,9329,9340C1C2C14trnE-trnT35 041D1D2D15trnM-psbD35 914E1E2E16rps4-trnT51 023F1F2F17ndhC-trnV56 262G1G2G18psaI-ycf464 845H1H2H19ndhF-rpl32118 412I1I2I1118 471I3I4I3118 473, 118 475, 118 481, 118 494, 118 503, 118 521, 118 533, 118 537I5I6I6118 575I7I8I7118 576, 118 594, 118 598I9I10I10118 600I11I12I11118 604I13I14I1410ccsA-ndhD121 229～121 245, 121 269J1J2J111ycf1130 197K1K2K1

注：粗體顯示云新高原葉綠體DNA的單倍型與其父本相同。

Note: Bold characters showed that the chloroplast haplotype of ‘Yunxingaoyuan’ was identical to that of its farther parent.

3 討 論

本項(xiàng)研究基于網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)中已公布的序列，從葉綠體全基因組層面分析，發(fā)現(xiàn)深紋核桃與核桃的葉綠體基因組存在14個(gè)變異位點(diǎn)、30個(gè)堿基的差異。總體上，93 %的差異類型(13/14)為單堿基多態(tài)性變異，其中7個(gè)為SNP，6個(gè)為單堿基InDel；7 %的差異類型(1/14)為17個(gè)堿基的短片段InDel，不存在大范圍的結(jié)構(gòu)變異，這與水稻[13]、大麻[14]和其它植物[15]關(guān)于葉綠體基因組結(jié)構(gòu)的研究相同。

針對(duì)云新高原核桃及其父母本的這14個(gè)變異位點(diǎn)進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)僅11個(gè)位點(diǎn)在三者間存在多態(tài)性，另外3個(gè)位點(diǎn)的堿基之間則完全相同，不具有多態(tài)性。這11個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)中，云新高原與其母本完全一致，而與其父本完全不一致。并發(fā)現(xiàn)有1個(gè)位于基因編碼區(qū)，其余10個(gè)都位于非編碼的基因間隔區(qū)。在psbI-trnS和ndhF-rpl32兩個(gè)片段序列中，另發(fā)現(xiàn)存在22個(gè)變異位點(diǎn)，其中19個(gè)位點(diǎn)位于基因間隔區(qū)，云新高原與其母本在這22個(gè)位點(diǎn)中有10個(gè)保持一致，而與其父本在余下的12個(gè)位點(diǎn)保持一致。綜合而言，云新高原與其親本三者間共檢測(cè)發(fā)現(xiàn)33個(gè)變異位點(diǎn)，云新高原與其母本在其中21個(gè)位點(diǎn)上保持相同堿基，占全部變異位點(diǎn)數(shù)的64 %；云新高原與其父本在余下12個(gè)位點(diǎn)上保持相同堿基，占全部變異位點(diǎn)數(shù)的36 %。這33個(gè)變異位點(diǎn)分屬11個(gè)基因或基因間隔區(qū)片段，可以分為11種單倍型，云新高原的這11個(gè)單倍型中有10個(gè)與母本相同，1個(gè)為雙親的嵌合體。據(jù)此推斷，云新高原的葉綠體DNA為以母系遺傳為主的雙親遺傳。這與草本植物綠絨蒿(Meconopsis)相類似，其種間雜交種與其親本在trnL-trnF片段中存在25個(gè)變異位點(diǎn)，其中84 %的位點(diǎn)與母本一致，4 %的位點(diǎn)與父本一致，其余12 %的位點(diǎn)與親本均不相同[16]。另外，ndhF-rpl32DNA片段具有多個(gè)變異位點(diǎn)，是多態(tài)性高的葉綠體基因片段，有望廣泛應(yīng)用于核桃群體遺傳分析、譜系地理和種內(nèi)品種鑒定等研究。

大多數(shù)被子植物的葉綠體DNA通過(guò)雌配子以母系遺傳的方式傳遞[2-3]，父系遺傳僅見(jiàn)于紫花苜蓿(Medicagosativa)[17]、甘草(Glycyrrhizaspp.)[18]和牽?；?Pharbitisnil)[3]等少數(shù)種類中；裸子植物中父系遺傳較為普遍[3-4]；天竺葵屬(Pelargonium)和月見(jiàn)草屬(Oenothera)植物是雙親遺傳方式的代表[3]。此外，隨著研究手段和研究材料的更新和豐富，之前認(rèn)為獼猴桃(Actinidia)是嚴(yán)格的父系遺傳，但后來(lái)發(fā)現(xiàn)還具有母系及雙親遺傳的特性，與雜交親本的基因型有一定關(guān)系[19]?？傊?，植物葉綠體DNA的遺傳方式具有多樣性和復(fù)雜性。而胡桃科植物的葉綠體DNA遺傳方式的研究尚無(wú)相關(guān)報(bào)道，現(xiàn)有的相關(guān)葉綠體DNA研究都是針對(duì)系統(tǒng)進(jìn)化和植物分類開(kāi)展的。本項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，核桃葉綠體DNA的遺傳方式為以母系遺傳為主的雙親遺傳，這為今后核桃種間雜交和遺傳變異研究提供了新的資料。

4 結(jié) 論

深紋核桃與核桃的葉綠體基因組存在14個(gè)變異位點(diǎn)、30個(gè)堿基的差異，其中7個(gè)為核苷酸多態(tài)性變異(SNP)，7個(gè)為堿基插入/缺失變異(InDel)。對(duì)云新高原及其親本的這14個(gè)位點(diǎn)及其附近片段進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)三者存在33個(gè)變異位點(diǎn)，云新高原與其母本在其中21個(gè)位點(diǎn)上保持相同堿基，占全部變異位點(diǎn)數(shù)的64 %；云新高原與其父本在余下12個(gè)位點(diǎn)上保持相同堿基，占全部變異位點(diǎn)數(shù)的36 %。這33個(gè)變異位點(diǎn)分屬11個(gè)基因或基因間隔區(qū)片段，可以分為11種單倍型，云新高原的這11個(gè)單倍型中有10個(gè)與母本相同，1個(gè)為雙親的嵌合體。根據(jù)質(zhì)體遺傳的特性，推斷核桃葉綠體DNA的遺傳方式為以母系遺傳為主的雙親遺傳。另外，核桃ndhF-rpl32DNA片段存在多個(gè)變異位點(diǎn)，多態(tài)性高，該葉綠體基因片段可廣泛應(yīng)用于核桃系統(tǒng)發(fā)育、群體遺傳和種內(nèi)品種鑒定等研究。