馮柯橋，蔣麗華

(溫江中學(xué)，四川 成都 610000)

人參Panax ginseng C.A.Meyer為五加科植物人參的根：按產(chǎn)地不同可分為吉林人參、遼寧人參、石柱人參、高麗人參等；按炮制方法可分為紅參、白糖參、生曬參等；按栽培方式和生長(zhǎng)環(huán)境分類，有野山參、移山參、林下參和園參等；按產(chǎn)地初加工可分為水參(新鮮人參)、生曬參、白干參、全須生曬參等。我國(guó)的野山參主要生長(zhǎng)在吉林省境內(nèi)的長(zhǎng)白山和黑龍江省境內(nèi)的大、小興安嶺地區(qū)，以長(zhǎng)白山林區(qū)最多且高度集中于撫松縣和集安市。該地區(qū)野山參以其補(bǔ)力宏厚、參味濃郁、質(zhì)量純正而著名，在國(guó)際上享有極高聲譽(yù)。

人參屬于中藥上品，性溫，味甘、微苦，歸心經(jīng)、肺經(jīng)、脾經(jīng)、腎經(jīng)，在我國(guó)己經(jīng)有兩千多年的藥用歷史，《神農(nóng)本草經(jīng)》對(duì)其有“安精神”、“開心益智”的功效描述。人參中主要含有皂苷、多糖、揮發(fā)油等化學(xué)成分[1]，其有效成分主要為人參皂苷，人參皂苷Re，人參皂苷Rg1，人參皂苷Rb1等[2-4]。迄今為止，結(jié)構(gòu)確定的皂苷成分有40余種。其中人參皂苷Rg1和Rb1的量最高，藥理研究最廣泛[5]。研究表明人參皂苷具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、改善心血管功能、抗炎、抗氧化、抗血小板聚集、神經(jīng)保護(hù)等生物活性的作用[6]。Zhu D等研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg1可以通過抗氧化作用和維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+的穩(wěn)態(tài)達(dá)到保護(hù)心肌細(xì)胞的作用[7]。重要的是現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，人參皂苷具有顯著的抗癌效果[8]。如抗癌新藥參一膠囊(人參皂苷Rg3)已由國(guó)家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)上市，成為我國(guó)首個(gè)一類中藥單體抗癌藥物。根據(jù)《中國(guó)藥典》第四部以人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1為含量測(cè)定指標(biāo)性，對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量測(cè)評(píng)，含人參皂苷Rg1和人參皂苷Re的總量不得少于0.27%，人參皂苷Rb1不得少于0.18%[9]。本文根據(jù)2015年《中國(guó)藥典》第四部，分別對(duì)15年、18年和22年的石柱山參進(jìn)行質(zhì)量測(cè)評(píng)[10]，并比較三種人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1的含量，對(duì)比不同年限對(duì)三種人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1的含量是否存才影響。

1 材料與儀器

1.1 藥材與試劑

15年、18年和22年石柱山參(清華大學(xué)研究院中藥實(shí)驗(yàn)室,經(jīng)南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院馬驥教授鑒定鑒定為人參Panax ginseng)；人參皂苷Rg1對(duì)照品，批號(hào)：MUST-16110407(成都曼斯特科技有限公司)；人參皂苷Re對(duì)照品，批號(hào)：MUST-14091710(成都曼斯特科技有限公司)；人參皂苷Rb1對(duì)照品，批號(hào)：MUST-17060106(成都曼斯特科技有限公司)；甲醇(AR，深圳市中盛科儀科技有限公司)；正丁醇(AR，深圳市中盛科儀科技有限公司)；乙腈(GR，深圳市凌達(dá)生物科技有限公司)。

1.2 儀器

Ultimate 3000型高效液相色譜系統(tǒng)(包括LPG-3400 SDN 型四元低壓梯度泵、WPS-3000 SL 型自動(dòng)進(jìn)樣器、CC-3000 RS 型柱溫箱、VWD-3100 型可變波長(zhǎng)檢測(cè)器，Thermo Fisher 公司)；電子天平B10002(上海良平儀器儀表有限公司)；DK-S24電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；Smart-R015純水制備器(上海和泰儀器有限公司)；DHG-9070A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；BJ-400多功能粉碎機(jī)(德清拜潔電器)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

表1 流動(dòng)相梯度洗脫表

色譜柱：采用Agilent eclipse XDB C18色譜柱(250×4.6mm,5μm)；流動(dòng)相：以乙腈為流動(dòng)相A，以水為流動(dòng)相B，按表1中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；流速：為1.0mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)：203nm，柱溫為室溫。理論板數(shù)按人參皂苷Rg1峰計(jì)算應(yīng)不低于6000。

2.2 人參皂苷對(duì)照品溶液的配置

精密稱取人參皂苷Rg1對(duì)照品2.18 mg、人參皂苷Re對(duì)照品2.00 mg及人參皂苷Rb1對(duì)照品2.02 mg，用甲醇溶解后轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度線處，搖勻，制得對(duì)照品混合溶液，過0.45 μm有機(jī)相濾膜，待用。

2.3 人參藥材處理與制備

分別取15年、18年和22年人參藥材適量，再烘箱中干燥處理一日，取出后用粉碎機(jī)打粉，過四號(hào)篩，收集人參粉末，棄去殘?jiān)?。精密稱取人參藥材粉末約1 g，各平行兩組，用濾紙包裹后，放置于索氏提取器中，加入100 mL三氯甲烷，加熱回流3 h，加熱至三氯甲烷回流至無(wú)色，棄去三氯甲烷，索氏提取器中的藥渣揮桿溶劑后，連同濾紙一并轉(zhuǎn)移至100 mL錐形瓶中，使用50 mL移液管精密加入50 mL水飽和正丁醇溶液，密塞后，放置過夜，超聲處理30min，過濾并棄初濾液，收集續(xù)濾液，用25 mL移液管精密移取25 mL續(xù)濾液至蒸發(fā)皿中，在水浴鍋中蒸干溶劑，殘?jiān)舆m量甲醇溶解，并轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度線處，搖勻，過0.45 μm有機(jī)濾膜，待用。

2.4 人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品線性關(guān)系考察

精密吸取3.2項(xiàng)目中的人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，分別以10、15、20、25和30 μL進(jìn)樣，色譜條件按照2.1項(xiàng)目中的要求，測(cè)定完成后，分別以人參皂苷的含量(mg)為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。人參皂苷Rg1對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=1.62x+6.9，R2=0.992(n=5)，表明0.218 mg/mL的人參皂苷Rg1對(duì)照品含量在2.18 μg至6.54 μg之間線性關(guān)系良好；人參皂苷Re對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.24x+8.7，R2=0.998,(n=5)，表明0.20 mg/mL的人參皂苷Re對(duì)照品含量在2.00 μg至6.00 μg之間線性關(guān)系良好；人參皂苷Rb1對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=3.65x+1.15，R2=0.997(n=5)，表明0.202 mg/mL人參皂苷Rb1對(duì)照品含量在2.02 μg至6.06 μg之間線性關(guān)系良好。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表2、3和4所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1、2和3所示。

圖1 人參皂苷Rg1對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 人參皂苷Rg1對(duì)照品線性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

圖2 人參皂苷Re對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線

表3 人參皂苷Re對(duì)照品線性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

圖3 人參皂苷Rb1對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線

表4 人參皂苷Rb1對(duì)照品線性數(shù)據(jù)

2.5 儀器精密度實(shí)驗(yàn)

取2.2中制備的對(duì)照品溶液，都按照2.1中的色譜條件，精密進(jìn)樣10 μL，并且重復(fù)進(jìn)樣五次，計(jì)算人參皂苷Rb1的峰面積，并得出人參皂苷Rb1的RSD值為1.39%，結(jié)果表明儀器的精密度良好，精密度實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表5所示。

表5 人參皂苷Rb1的精密度實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取2.2項(xiàng)目中制備的的供試品溶液，分別在放置2、4、6、8和10 h后進(jìn)樣10 μL，計(jì)算人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1峰面積，得出人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1的RSD值分別為0.85%、1.08%和0.87%，結(jié)果表明人參樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定，穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表6、7和8所示。

表6 人參皂苷Rg1供試品的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

表7 人參皂苷Re供試品的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

表8 人參皂苷Rb1供試品的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

2.7 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

精密稱取人參藥材約1 g，平行3組，分別加入人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1對(duì)照品各4 mg，按照2.3項(xiàng)目中人參藥材的制備方法完成實(shí)驗(yàn)，得到加標(biāo)回收溶液，過0.45 μm有機(jī)濾膜，精密吸取10 μL進(jìn)高效液相色譜儀，計(jì)算人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1的峰面積，計(jì)算人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1的平均回收率分別為98.8%、98.6%和99.6%，RSD值分別為2.03%、2.11%和1.91%，相應(yīng)數(shù)據(jù)如表9所示。

表9 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

2.8 人參藥材測(cè)量結(jié)果

取2.3項(xiàng)目中已過濾膜的樣品，精密吸取10 μL，進(jìn)高效液相色譜儀檢測(cè)，平行兩組，人參皂苷Rg1的出峰位置在(44.0±0.1)min，人參皂苷Re的出峰位置在(45.1±0.1)min，人參皂苷Rb1的出峰位置在(76.8±0.1)min，計(jì)算人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1的峰面積，并計(jì)算含量百分比，得到15年石柱山參的人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1的含量百分比分別為0.88%、0.54%和0.87%；18年石柱山參的人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1的含量百分比分別為0.89%、0.87%和1.23%；22年石柱山參的人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1的含量百分比分別為0.74%、1.16%和1.26%，樣品測(cè)量結(jié)果中含人參皂苷Rg1和人參皂苷Re的總量均大于0.30%，人參皂苷Rb1的量均大于0.20%，測(cè)量結(jié)果均滿足《中國(guó)藥典》第四部要求，高效液相色譜圖如圖4、5和6所示。

圖4 15年石柱山參高效液相色譜圖

圖5 18年石柱山參高效液相色譜

圖6 22年石柱山參高效液相色譜圖

2.9 三種年份的石柱山參結(jié)果分析

圖7 三種年份的石柱山參的三種人參皂苷含量對(duì)比

測(cè)量約1 g的人參藥材，對(duì)比15年、18年和22年的石柱山參中的人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1的含量得出：對(duì)于人參皂苷Rg1，對(duì)比15年和18年人參皂苷Rg1的含量有所升高，但是對(duì)比22年人參皂苷Rg1的含量有所降低；對(duì)于人參皂苷Re，對(duì)比15年、18年和22年人參皂苷Re的含量隨年份增加含量有所提高；對(duì)于人參皂苷Rb1，對(duì)比15年、18年和22年人參皂苷Rb1的含量隨年份增加含量有所提高，結(jié)果如圖7所示。

3 結(jié)論

人參作為名貴的中藥材，具有很獨(dú)特的藥理作用，人參中藥理作用的成分成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，本文采用高效液相色譜法分析了15年、18年和22年的石柱山參中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1的含量。同時(shí)，儀器的精密度良好，人參皂苷對(duì)照品的線性關(guān)系良好，樣品的穩(wěn)定性良好，加標(biāo)回收率高，樣品中三種人參皂苷含量均達(dá)到《中國(guó)藥典》第四部的要求。對(duì)于石柱山參的三種人參皂苷的含量分析，對(duì)于人參皂苷Rg1的含量15年到18年有所提高，但是相對(duì)22年有所降低，對(duì)于人參皂苷Re和人參皂苷Rb1的含量都是隨年份增加有不同程度的提高，是由于石柱山參為野生山參，其生長(zhǎng)收到各種因素影響，有光線因素、溫度因素、濕度因素、空氣因素和土壤因素等，本文只是對(duì)于這三種石柱山參的人參皂苷含量進(jìn)行分析，具體的因素影響還需要廣大研究者進(jìn)行更加深入的分析研究。