吳 婕，徐 高，吳學(xué)慧

(1.遵義師范學(xué)院 赤水河流域環(huán)境保護(hù)與山地農(nóng)業(yè)發(fā)展協(xié)同創(chuàng)新中心，貴州 遵義 563006；2.貴州師范學(xué)院 化學(xué)與材料學(xué)院，貴州 貴陽 550018)

頭花蓼(Polygonum Capitatum)，又名四季紅[1]，屬于多年生匍匐草本。它的主要化學(xué)成分有揮發(fā)油、酚酸類化合物、酯溶性化合物和黃酮類化合物等等[2-3]，其中黃酮類化合物不僅具有解毒、抗炎、降血糖等生理的功效，而且有抗癌、抗氧化、抗腫瘤的作用[4-5]。因此它具有很廣的醫(yī)藥、保健品和化妝品市場(chǎng)。

目前，植物黃酮類化合物的提取的方法較多，主要有微波輔助浸提、超聲輔助浸提、超臨界流體萃取等等[6-9]。超聲輔助浸提法具有效率高、操作簡(jiǎn)單、生產(chǎn)成本低等特點(diǎn)。本研究采用超聲輔助浸提技術(shù)，探討單因素：乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、液固比和提取溫度對(duì)頭花蓼總黃酮得率的影響；并且首次借助實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件Design-Expert 8.0.5優(yōu)化出最佳的提取工藝參數(shù)，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，此優(yōu)化的工藝參數(shù)具有簡(jiǎn)單性和可靠性，它為頭花寥總黃酮的工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

頭花蓼(施秉三元威門公司),蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(貴州迪大科技有限責(zé)任公司),無水乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

L5s分光光度計(jì)(上海儀電分析儀器有限公司),KQ5200DB型超聲波清洗器(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)，RE201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海況勝實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司),FZ102型微型植物粉碎機(jī)(天津泰斯特儀器有限公司)，KL04A型離心機(jī)(上海京工實(shí)業(yè)有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 總黃酮的提取工藝

精選頭花寥→烘干40 ℃→研碎→過60目篩→稱取2.0 g頭花寥粉末→按照1.3.3的方法超聲浸提總黃酮(超聲波功率200W，超聲頻率40kHz)→抽濾→離心(2000 r/min)→合并濾液→濃縮→備用。

1.3.2 總黃酮的測(cè)定

按照“NaNO2-Al(NO3)3”顯色法[5]，準(zhǔn)確配制質(zhì)量濃度為0.202 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別吸取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0和6.0 mL放置于25 mL的容量瓶中；先加入1.0 mL 5% NaNO2，搖勻靜置6min后，再加入1.0 mL10% Al(NO3)3，搖勻靜置6min后，最后加入10.0 mL 4% NaOH，用去離子水定容，搖勻靜置20min。在波長(zhǎng)510 nm處，測(cè)定吸光度，將吸光度(Y)與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的濃度(X)進(jìn)行線性數(shù)學(xué)回歸。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=10.372X-0.0091 (R2=0.9997)，可以計(jì)算出頭花蓼總黃酮的質(zhì)量濃度。

1.3.3 頭花蓼總黃酮的單因素實(shí)驗(yàn)

超聲輔助提取頭花蓼總黃酮的單因素實(shí)驗(yàn)，分別稱取2.0 g頭花蓼粉末，固定提取條件：液固比20 mL/g，提取時(shí)間20min和提取溫度60 ℃，考察不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶劑(35%、40%、45%、50%和55%)對(duì)頭花蓼總黃酮得率的影響；固定提取條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)45%，提取時(shí)間20min和提取溫度60 ℃，考察不同的液固比(15、20、25、30和35 mL/g)對(duì)頭花蓼總黃酮得率的影響；固定提取條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)45%，液固比25 mL/g和提取時(shí)間20min，考察不同的提取溫度(40、45、50、55和60℃)對(duì)頭花蓼總黃酮得率的影響。固定提取條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)45%，液固比25 mL/g和提取溫度50 ℃，考察不同的提取時(shí)間(15、20、25、30和35min)對(duì)頭花蓼總黃酮得率的影響。按上述1.3.2方法，測(cè)定吸光度，得到頭花蓼總黃酮得率公式如下：

頭花蓼總黃酮得率P/%=C×V×100/M

式子：P/%-頭花蓼總黃酮得率；C/(mg/mL)-頭花蓼總黃酮質(zhì)量濃度；V/(mL)-頭花蓼總黃酮體積；M/mg-用于提取總黃酮的頭花蓼質(zhì)量。

1.3.4 響應(yīng)面法優(yōu)化法提取頭花蓼總黃酮的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以乙醇體積分?jǐn)?shù)M(%)，提取時(shí)間U(min)，液固比T(mL/g)和提取溫度S(℃)為考察因素，頭花蓼總黃酮得率Q(%)為響應(yīng)值，應(yīng)用Design-Expert 8.0.5軟件設(shè)計(jì)四因素三水平的Box-Behnken試驗(yàn)，確定超聲輔助浸提頭花蓼總黃酮的最優(yōu)化條件。結(jié)果如表1～3所示。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析

按照1.3.3單因素實(shí)驗(yàn)方法，選取不同體積分?jǐn)?shù)的溶劑乙醇、料固比、提取時(shí)間和提取溫度，超聲輔助浸提頭花蓼總黃酮，分別進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，取平均值，以確定各考察因素的合適取值范圍。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

圖1 提取頭花蓼總黃酮的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.1 The result of single factor experiment on extracting total flavonoids from polygonum capitatum

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)頭花蓼總黃酮得率的影響

如圖1-a圖可知，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為35%～45%范圍內(nèi)，頭花蓼總黃酮得率隨著溶劑乙醇的體積分?jǐn)?shù)增加而升高；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為45%，得到最大的頭花蓼總黃酮得率3.9%；繼續(xù)增加溶劑的體積分?jǐn)?shù)，頭花蓼總黃酮得率卻呈現(xiàn)緩慢的下降趨勢(shì)。這是因?yàn)轭^花寥中黃酮類化合物易溶于乙醇溶劑，在一定的范圍內(nèi)，頭花蓼總黃酮得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而增加；但是當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)過高時(shí)，會(huì)使有些醇溶性的色素和其它親脂性強(qiáng)的成分溶出量繼續(xù)增加，這些雜質(zhì)會(huì)與頭花蓼黃酮類化合物形成競(jìng)爭(zhēng)，使頭花蓼黃酮類化合物與乙醇-水分子結(jié)合的可能性下降，導(dǎo)致頭花蓼總黃酮得率呈現(xiàn)出降低的趨勢(shì)。在星點(diǎn)設(shè)計(jì)中，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%～50%作為考察范圍。

2.1.2 液固比對(duì)頭花蓼總黃酮得率的影響

如圖1-b圖可知，當(dāng)頭花蓼與溶劑乙醇的液固比在15～25 mL/g范圍內(nèi)，頭花蓼總黃酮得率隨著液固比的增加而快速升高；當(dāng)液固比為25 mL/g時(shí)，頭花蓼總黃酮得率達(dá)到極大值4.15%；而后繼續(xù)增加液固比，頭花蓼總黃酮得率變化不大。因?yàn)樵黾右汗瘫葘?shí)質(zhì)是增加單位質(zhì)量的頭花寥中乙醇溶劑量，增加的液固比勢(shì)必增加物料內(nèi)外溶液的總黃酮質(zhì)量濃度差，促使頭花寥溶出更多的總黃酮，但是液固比為25 mL/g時(shí)，單位質(zhì)量的頭花寥總黃酮已經(jīng)基本溶出，故頭花寥總黃酮得率變化不明顯。在星點(diǎn)設(shè)計(jì)中，選擇液固比為20 mL/g～30 mL/g作為考察范圍。

2.1.3 提取溫度對(duì)頭花蓼總黃酮得率的影響

如圖1-c圖可知，溫度增加可以增大溶解度和擴(kuò)散系數(shù)，在40～50 ℃之間，頭花寥黃酮化合物隨著溫度的升高而快速地溶出，頭花寥總黃酮得率也隨之增加；但是繼續(xù)增加溫度，黃酮類化合物的熱不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)在高溫下容易被破壞，不利于提高頭花寥總黃酮得率。在星點(diǎn)設(shè)計(jì)中，選擇溫度為45～55 ℃作為考察范圍。

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)頭花蓼總黃酮得率的影響

如圖1-d圖可知，超聲波的“空化作用”作用，可以加速頭花寥植物組織和細(xì)胞的破裂,使得黃酮化合物更加容易溶出。在20min時(shí)，頭花寥的總黃酮基本溶出，其得率達(dá)到最大值4.24%；如果繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間，反而使更多的黃酮類化合物被氧化，導(dǎo)致頭花寥總黃酮得率下降。在星點(diǎn)設(shè)計(jì)中，選擇提取時(shí)間15～25min作為考察范圍。

2.2 頭花蓼總黃酮得率的多元二次回歸模型的建立

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，以乙醇體積分?jǐn)?shù)M(%)、提取溫度S(℃)、液固比T(mL/g)和提取時(shí)間U(min)為考察因素，頭花蓼總黃酮得率Q(%)為響應(yīng)值，應(yīng)用Design-Expert 8.0.5軟件設(shè)計(jì)4因素3水平的Box-Behnken試驗(yàn)?！翱疾煲蛩丶皩?shí)際操作物理量”和“星點(diǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果”分別如表1和表2所示。

表1 考察因素及實(shí)際操作物理量Table 1 Code value and physical practice of independent variables levels

表2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The central composite design and its results

運(yùn)用Design-Expert 8.0.5軟件的Box-Behnken設(shè)計(jì)出29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)。將試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)帶入Box-Behnken中，得到數(shù)學(xué)回歸方程如下:

Q=-107.96542+1.57953×M+2.43617×S+0.77567×T+0.52903×U-0.005×M×S+0.0019×M×T-0.0008×M×U-0.016×S×T-0.0083×S×U-0.0003×T×U-0.014413×M2-0.016513×S2-0.00096333×T2-0.00186333×U2

對(duì)擬合的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行F檢驗(yàn)方差分析，結(jié)果如表3所示。

表3 二項(xiàng)式擬合回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance for binomial fitting quadratic regression model

表3(續(xù))

注：*表示差異顯著，P<0.05; **表示差異顯著，P<0.01。

從表3可以看出，模型的R2= 0.825，P = 0.0032<0.01，表示回歸數(shù)學(xué)模型具有極顯著水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；模型失擬項(xiàng)比 P= 0.2311>0.05，S/N(信噪比)=6.981>4，表明該模型的實(shí)際擬合中的非正常誤差所占的比例很小，失擬不明顯，有較高的可信度。在一次項(xiàng)的F檢驗(yàn)可以得到，各考察因素對(duì)頭花蓼總黃酮得率影響的主次順序?yàn)椋阂掖俭w積分?jǐn)?shù)(M)>液固比(T)>提取溫度(S)>提取時(shí)間(U)。該數(shù)學(xué)回歸模型預(yù)測(cè)的頭花蓼總黃酮最優(yōu)提取工藝參數(shù)(M,S,T,U)= (47.81%,45.41 ℃，29.98 mL/g，20.53min)，頭花蓼總黃酮得率預(yù)測(cè)值Q為5.023%。考慮實(shí)際生產(chǎn)，改進(jìn)的提取工藝為:乙醇體積分?jǐn)?shù)48%，提取時(shí)間21min，液固比30 mL/g和提取溫度46 ℃，經(jīng)過平行的3次驗(yàn)證性試驗(yàn)，結(jié)果取其平均值，得到頭花蓼總黃酮得率的驗(yàn)證值為5.00%，它與預(yù)測(cè)值相差0.023%，因此“星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法”選擇的最佳工藝參數(shù)有較高的可信度。

3 結(jié)論

本研究，在超聲提取頭花寥總黃酮化合物的單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用Design-Expert8.0.5選取乙醇體積分?jǐn)?shù)M(%)、提取溫度S(℃)、液固比T(mL/g)和提取時(shí)間U(min)為變量，用它們與頭花寥總黃酮得率Q(%)進(jìn)行了模型回歸分析，預(yù)測(cè)了提取頭花寥總黃酮化合物最優(yōu)工藝參數(shù)(M,S,T,U)= (47.81%，45.41 ℃，29.98 mL/g，20.53min)，頭花蓼總黃酮得率預(yù)測(cè)值Q為5.023%。為驗(yàn)證實(shí)際工業(yè)中的可靠性，改進(jìn)的提取工藝參數(shù)為:乙醇體積分?jǐn)?shù)48%，提取溫度46 ℃，液固比30 mL/g和提取時(shí)間21min，經(jīng)過3次驗(yàn)證性試驗(yàn)，取平均值，得到頭花蓼總黃酮得率的驗(yàn)證值為5.00%，它與預(yù)測(cè)值相差是0.023%，可以認(rèn)為該模型預(yù)測(cè)的最佳工藝條件合理可靠。