劉素穩(wěn)，吳瞻邑，由 璐，常學(xué)東*

（河北科技師范學(xué)院食品科技學(xué)院，河北 秦皇島 066604）

陽光中的紫外線輻射是造成皮膚損傷的主要原因[1]。由于平流層臭氧層的破壞增加了地球大氣中的紫外線輻射，過度暴露于紫外線輻射對人體健康有許多不利影響，如導(dǎo)致皮膚癌、免疫抑制、太陽紅斑和皮膚過早老化等。中波紫外線（ultraviolet B，UVB）（280～320 nm）是引起人永生化表皮角質(zhì)形成細(xì)胞（HaCaT）輻射損傷的最重要因素，且UVB輻射可增加皮膚組織中的活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平和自由基的生成量，引起一系列的氧化損傷。UVB也是造成皮膚光老化的主要原因之一，其可以穿透表皮到達真皮（主要由成纖維細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)組成）上部，激活人類皮膚中基質(zhì)金屬蛋白（matrix metalloproteinases，MMPs）調(diào)節(jié)的信號通路[2]，誘導(dǎo)皮膚光老化。皮膚光老化特征為產(chǎn)生皺紋、不規(guī)則色素沉著和缺乏彈性[3]。此外，腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α和白介素（interleukin，IL）-6是與UVB輻射有關(guān)的炎癥細(xì)胞因子，輻射后，這些因子大量分泌，造成角質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的炎癥反應(yīng)并加速細(xì)胞損傷[4]。

目前，保護人類皮膚免受太陽紫外線誘導(dǎo)的氧化損傷的主要方式是避免過度暴露在陽光下或使用防曬霜。植物化學(xué)物質(zhì)的補充也可以起到保護作用，最近的一些研究表明天然的化學(xué)組分也能起到一定的抗氧化保護作用，例如葡萄種子提取物、鹽膚木提取物、枸杞多糖、雪蓮多糖等[5-9]。山楂屬于薔薇科（Rosaceae）梨亞科（Pyrinae）山楂屬（Crataegus）植物，果膠含量豐富，約占果實質(zhì)量的2%～4%。果膠是一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜的酸性雜多糖，其主要成分為半乳糖醛酸，具有良好的乳化、增稠、穩(wěn)定和膠凝作用。研究表明，由果膠水解得到的果膠低聚半乳糖醛酸具有降血脂、降血糖、防齲齒、抑菌等多種生物活性[10-12]。

目前還鮮有關(guān)于山楂半乳糖醛酸提取物對UVB輻射HaCaT細(xì)胞氧化損傷及光老化保護作用的研究。本實驗以山楂為原料提取山楂果膠，采用酶法降解，對酶解物半乳糖醛酸進行分離制備，研究山楂果膠低聚半乳糖醛酸的基質(zhì)金屬蛋白酶-1（matrix metalloproteinase 1，MMP-1）抑制活性，并對UVB輻射造成的氧化損傷的保護作用進行研究，對山楂功能食品和山楂皮膚保護產(chǎn)品的進一步開發(fā)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

果膠酶（食品級） 法國Lallemand公司；Dowex50W×8-200陽離子交換樹脂、DMEM培養(yǎng)基美國Gibco公司；胎牛血清 美國Hyclone公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS） 武漢雙螺旋生物科技有限公司；Dowex1×4-400陰離子交換樹脂、胰酶、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、噻唑藍（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide tetrazolium，MTT）、二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO） 美國Sigma公司；BCA蛋白質(zhì)量濃度測定試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、ROS試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismulase，SOD）試劑盒沈陽萬類生物科技有限公司；谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、羥脯氨酸（hydroxyproline，Hyp）試劑盒南京建成生物工程研究所；M M P-1試劑盒中國博士德生物公司；HaCaT細(xì)胞 南京華奧生物有限公司；TNF-α、IL-6細(xì)胞因子酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 美國R&D公司；RNA測定試劑盒 北京百泰克生物技術(shù)公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FDU-1200冷凍干燥機 日本Eyela東京理化株式會社；DHA-A電腦恒流泵 上海嘉鵬科技有限公司；100-LCD電腦自動部分收集器 上海琪特分析儀器有限公司；NW10LVF型超純水系統(tǒng) 香港Heal Force公司；H-2050R型超速冷凍離心機 湖南湘儀有限公司；HF-90型CO2培養(yǎng)箱 上海力申有限公司；AE31倒置相差顯微鏡 麥克奧迪實業(yè)集團有限公司；SW-CJ-2FD型超凈工作臺 蘇州凈化儀器設(shè)備公司；ELX-800型酶標(biāo)儀 美國Biotek公司；UV2910紫外-可見分光光度計日本日立公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市杰瑞爾有限公司；DH36001B電熱恒溫培養(yǎng)箱 天津泰斯特公司；SUV-100日光紫外線模擬器、UVB輻射度監(jiān)示器上海西格瑪高技術(shù)有限公司；實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time polymerase chain reaction，qPCR）儀BIONEER（上海）公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

1.3.1.1 果膠提取

將山楂清洗、去皮、去核、打漿，用0.81 mol/mL鹽酸溶液以料液比1∶20在80 ℃條件下提取90 min。提取液經(jīng)離心棄去殘渣，4 倍體積乙醇沉淀，經(jīng)冷凍干燥制得果膠[13]。

1.3.1.2 果膠酸制備

稱取3 g山楂果膠溶于300 mL含40 g/L NaOH的體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液中，冰浴攪拌反應(yīng)5 h，于冰箱中冷藏10 h，過濾，棄上清液。沉淀加入體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液100 mL，用3 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至1.5±0.1。室溫下攪拌30 min，抽濾，沉淀中加入50%酸化（體積分?jǐn)?shù)1%鹽酸溶液）乙醇溶液，攪拌30 min，過濾，用體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液洗滌3 次，冷凍干燥得果膠酸。1 g果膠酸溶于100 mL pH 4.5醋酸鈉緩沖液（0.9 g醋酸鈉與0.5 mL冰醋酸定容至50 mL，溶劑為蒸餾水）制成果膠酸樣品，備用。

1.3.1.3 果膠酸酶解

用0.1 mol/L PBS（pH 4.5）配制質(zhì)量濃度為10 mg/mL的果膠酸待解液，用質(zhì)量濃度為0.000、0.005、0.010、0.015、0.020 mg/mL酶解液對其進行酶解[14]。分別于30、45、60、75、90 min時取樣2 mL，沸水浴5～10 min滅活后進行1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）抗氧化能力測定，篩選抗氧化能力強的酶解物，確定果膠酸最佳酶解條件，并將酶解液冷凍干燥。

1.3.1.4 山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物的分離

準(zhǔn)確稱取果膠酸500 mg溶于PBS（pH 4.5）中，質(zhì)量濃度為10 mg/mL，酶解后沸水浴5～10 min滅活，4 000 r/min離心10 min，取上清液冷藏備用。用“堿-酸-堿”方式處理Dowex1×4-400陰離子交換樹脂，用“酸-堿-酸”方式處理Dowex50W×8-200陽離子交換樹脂，使其活化。選用40 cm×1.5 cm玻璃柱，用1 mol/L甲酸溶液沖洗樹脂，使pH值至1.5左右，樹脂轉(zhuǎn)化為HCOO－型，水洗至中性備用。取山楂果膠低聚半乳糖醛酸混合物，調(diào)節(jié)pH值至6.0，用0.6 mol/L甲酸銨溶液梯度洗脫，以1 mL/min流速分部收集，每管7 mL[15]。將DPPH自由基清除能力最強的樣品冷凍干燥，－20 ℃保存。

1.3.2 DPPH自由基清除能力測定

稱取DPPH 0.078 8 g，用體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶液定容至1 L，得到0.2 mmol/L DPPH試劑，避光保存，備用。取樹脂分離后的各管待測樣品2 mL，加入0.2 mmol/L DPPH-乙醇溶液2.0 mL，混勻，靜置30 min，于517 nm波長處測定吸光度A1。以待測樣品與體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶液的混合液為對照，測定吸光度A2；以DPPH溶液與體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶液的混合液為空白，測定吸光度。DPPH自由基清除率按式（1）計算。

1.3.3 山楂果膠低聚半乳糖醛酸含量的測定

將分離所得低聚半乳糖醛酸混合物經(jīng)陽離子交換樹脂除鹽后進行質(zhì)譜分析。樣品通過2 μL定量環(huán)進樣，噴霧電壓4 kV；鞘氣3 MPa；輔助氣0.5 MPa；離子源溫度為275 ℃；電壓150 V[15,17]。山楂果膠酸性半乳糖醛酸含量的測定采用間羥基聯(lián)苯法[18]。

1.3.4 細(xì)胞培養(yǎng)

HaCaT細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至90%融合后，按分組進行UVB照射及山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物處理。

1.3.5 實驗分組及UVB輻射

按照參考文獻[19]的方法，并略有改動，采用SUV-100日光紫外線模擬器及UVB輻射度監(jiān)示器進行實驗。實驗分為對照組：HaCaT細(xì)胞不照射UVB，不給予山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物處理。UVB組：HaCaT細(xì)胞進行30 mJ/cm2UVB輻射處理40 s，距離15 cm，后更換新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。低、高劑量山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物處理+UVB照射實驗組：每2 mL培養(yǎng)基中加入質(zhì)量濃度為5 μg/mL（低劑量）或10 μg/mL（高劑量）山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物處理1 h后，進行30 mJ/cm2UVB輻射處理，之后更換含5 μg/mL或10 μg/mL山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。收集各組細(xì)胞進行相關(guān)指標(biāo)檢測。

1.3.6 MTT法測定細(xì)胞存活率

1.3.6.1 山楂半乳糖醛酸對細(xì)胞增殖的影響

培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞至細(xì)胞密度為90%左右，用PBS清洗1 次，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰酶消化細(xì)胞，并加入完全培養(yǎng)基終止反應(yīng)。88×g離心3 min。將不同組別的細(xì)胞接種于96 孔板中，每孔4×103個，每組設(shè)置5 個復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁后進行加藥處理。樣品組每200 μL培養(yǎng)基中分別加入質(zhì)量濃度0、5、10、20、40、80、150、200 μg/mL山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物，將96 孔板置于37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)48 h后采用MTT法檢測。96 孔板內(nèi)每孔加入100 μL DMEM完全培養(yǎng)基與10 μL 5 mg/mL MTT混合液，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h。4 h后小心吸去上清液，加入150 μL DMSO，避光靜置10 min后在酶標(biāo)儀上測定其在570 nm波長處OD值，OD值越大表明存活率越高。

1.3.6.2 UVB輻射后山楂半乳糖醛酸提取物對細(xì)胞增殖的影響

將分組后的細(xì)胞按1.3.6.1節(jié)方法進行實驗，分別用UVB和山楂半乳糖醛酸提取物處理細(xì)胞24 h后，用MTT法測定細(xì)胞存活率（式（2））。

式中：OD樣品組、OD對照組分別為樣品組、對照組在570 nm波長處OD值。

1.3.7 細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化物（MDA）含量和Hyp質(zhì)量濃度的測定

將分組的細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，用新鮮裂解緩沖液重懸至密度為107個/mL。按照試劑盒說明書進行操作，測定MDA含量和Hyp質(zhì)量濃度。

1.3.8 細(xì)胞內(nèi)ROS水平測定

細(xì)胞內(nèi)的ROS水平測定按照Silván等[19]的方法，加入10 μmol/L 2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽于各組培養(yǎng)基，分組方法參見1.3.5節(jié)。37 ℃孵育細(xì)胞30 min。收集細(xì)胞，1 000×g離心10 min，去上清液，用200 μL PBS重懸細(xì)胞。使用熒光酶標(biāo)儀檢測，激發(fā)光波長為485 nm，發(fā)射光波長為530 nm。測定結(jié)果以相對熒光強度表示。

1.3.9 細(xì)胞內(nèi)酶活力的測定

細(xì)胞內(nèi)SOD、GSH-Px、CAT和LDH活力采用試劑盒檢測，細(xì)胞培養(yǎng)及樣品處理方法見1.3.5節(jié)，按照試劑盒操作說明對4 種酶活力進行檢測。

1.3.10 ELISA法檢測MMP-1含量、TNF-α及IL-6質(zhì)量濃度

蛋白質(zhì)提取和定量測定按照試劑盒說明書方法操作。細(xì)胞培養(yǎng)及樣品處理方法見1.3.5節(jié)，依照ELISA試劑盒說明書測定各實驗組MMP-1含量、TNF-α及IL-6質(zhì)量濃度。

1.3.11 qPCR檢測

將HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)于含10% PBS的DMEM培養(yǎng)基中，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中。將分組后的細(xì)胞接種于96 孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)為4×103個，每組設(shè)置5 個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后測定相關(guān)基因（MMP-1、T N F-α和I L-6）的表達量。采用試劑盒提取總RNA。將20 μL反轉(zhuǎn)錄RNA獲得的相應(yīng)cDNA置于－20 ℃，采用PCR儀測定。mRNA核苷酸序列內(nèi)參采用β-actin，引物由上海生工生物工程（上海）有限公司合成。引物序列為：MMP-1上游引物：5’-CGACTCTAGAAACACAAGAGCAAGA-3’，下游引物：5’-A A G G T T A G C T T A C T G T C A C A C G C T T-3’； T N F-α上 游 引 物 ：5’-CCAGACCCTCACACTCAGAT-3’，下游引物：5’-AACACCCATTCCCTTCACAG-3’；IL-6上游引物：5’-GCTATGAAGTTCCTCTCTGC-3’，下游引物：5’-CTAGGTTTGCCGAGTAGATC-3’。結(jié)果以2－ΔΔCt方法計算。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 山楂果膠酶解液及低聚半乳糖醛酸提取物對DPPH自由基清除能力的影響

圖1 酶解液質(zhì)量濃度（A）、酶解時間（B）及山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物（C）對DPPH自由基清除率的影響Fig.1 Effect of enzyme concentration (A), hydrolysis time (B) and hawthorn pectin oligogalacturonides (C) on DPPH radical scavenging rate of hydrolysates

由圖1可知，在相同酶解液質(zhì)量濃度下，隨著酶解時間的延長，酶解物的DPPH自由基清除率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，在60 min、酶解液質(zhì)量濃度0.05 mg/mL時，DPPH自由基清除率最高。這可能是因為酶解時間較短時果膠多糖降解不充分，酶解液中多為大分子聚半乳糖醛酸，其抗氧化能力弱；而隨著酶解時間延長，果膠多糖過度降解為單糖，使得酶解液抗氧化能力逐漸降低。相同酶解時間下，隨著酶解液質(zhì)量濃度的增加，酶解液DPPH自由基清除率逐漸降低，這是因為酶解液質(zhì)量濃度越大，相同酶解時間內(nèi)果膠多糖酶解越徹底，半乳糖醛酸聚合度降低，故其抗氧化能力逐漸降低。

隔管測定陰離子交換樹脂分離液，自第9號提取物濃度管開始收集，山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物的DPPH抗氧化能力呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，在第21號提取物濃度管獲得DPPH抗氧化能力最強樣品，其DPPH自由基清除率達80.6%。

2.2 山楂果膠低聚半乳糖醛酸含量分析

利用質(zhì)譜對分離后的山楂低聚半乳糖醛酸進行聚合度分析，得到5 種不同聚合度的醛酸。在正離子模式下，由于洗脫過程中NH4+離子的引入，圖譜中同時存在[M+Na]+、[M+NH4]+離子峰，其中m/z為745、921、1 273、1 525分別是半乳糖醛酸聚合度為4、5、7、9的[M+Na]+峰。m/z為1 109是聚合度為3的低聚半乳糖醛酸的[2M+NH4]+峰[20]。通過間羥基聯(lián)苯法對分離純化后山楂果膠酸酶解液中酸性半乳糖醛酸含量的測定結(jié)果為87%。

2.3 山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物對細(xì)胞增殖的影響

圖2 山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物對HaCaT細(xì)胞（A）及經(jīng)UVB輻射后HaCaT細(xì)胞（B）的增殖作用Fig.2 Cytotoxic effects of hawthorn pectin oligogalacturonide on HaCaT cells (A) and protective effect against UVB irradiation (B)

由圖2A可知，5、10 μg/mL的山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物對細(xì)胞沒有顯著影響（P＞0.05），當(dāng)質(zhì)量濃度在20～200 μg/mL時，細(xì)胞存活率隨質(zhì)量濃度增大呈減小趨勢，表明山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物對細(xì)胞的損傷有一定限度。經(jīng)UVB照射后，5、10 μg/mL的山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物對細(xì)胞有一定保護作用（圖2B）。5、10 μg/mL山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物使細(xì)胞相對存活率分別顯著提升37.7%和72.4%（P＜0.05），且兩劑量組間有顯著差異（P＜0.05）。

2.4 山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物降低細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化物（MDA）含量和ROS水平分析

圖3 山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物對HaCaT細(xì)胞UVB輻射后MDA含量（A）和ROS水平（B）的影響Fig.3 Effects of hawthorn pectin oligogalacturonide on MDA (A) and ROS levels (B) of HaCaT cells after UVB irradiation

如圖3所示，經(jīng)UVB輻射后，細(xì)胞產(chǎn)生大量MDA和ROS，與對照組相比有極顯著差異（P＜0.01）。山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物可有效降低細(xì)胞內(nèi)MDA含量和ROS水平，保護細(xì)胞，減輕氧化損傷。與UVB組比較，5、10 μg/mL山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物使MDA含量分別降低30.1%和39.8%（P＜0.01），使ROS水平分別降低12.0%和23.9%（P＜0.05，P＜0.01）。

2.5 山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物對細(xì)胞酶活力的影響

圖4 山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物對HaCaT細(xì)胞UVB輻射后抗氧化酶（A～C）和LDH活力（D）的影響Fig.4 Effects of hawthorn pectin oligogalacturonide on antioxidase (A-C)and LDH (D) levels of HaCaT cells after UVB irradiation

山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物有效提升經(jīng)UVB輻射后HaCaT細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活力（圖4A～C）。UVB輻射使細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活力極顯著降低（P＜0.01）。5 μg/mL山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物對細(xì)胞GSH-Px和CAT活力無顯著增加作用（P＞0.05），但可極顯著提升SOD活力（P＜0.01）。而10 μg/mL山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物對3 種抗氧化酶活力有顯著或極顯著提升作用（P＜0.05，P＜0.01），使3 種抗氧化酶活力分別增加54.5%、44.0%和119.3%。5、10 μg/mL山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物分別使LDH活力降低14.2%和29.9%（P＜0.05，P＜0.01）。

2.6 山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物對MMP-1含量和Hyp、TNF-α、IL-6質(zhì)量濃度的影響

山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物有效抑制經(jīng)UVB輻射后HaCaT細(xì)胞內(nèi)MMP-1含量增加和TNF-α、IL-6質(zhì)量濃度升高（圖5A～C）。經(jīng)UVB輻射后，MMP-1含量極顯著增加（P＜0.01），激活了MMPs信號通路，使細(xì)胞光老化加速。與UVB組相比，5、10 μg/mL山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物使細(xì)胞內(nèi)MMP-1含量降低了31.8%和40.7%（P＜0.05，P＜0.01），顯著或極顯著降低由UVB誘導(dǎo)的TNF-α、IL-6質(zhì)量濃度升高（P＜0.05，P＜0.01），并使Hyp質(zhì)量濃度分別顯著增加了38.3%和67.2%（圖5D）。

圖5 山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物對HaCaT細(xì)胞UVB輻射后TNF-α（A）、IL-6（B）、MMP-1（C）、Hyp（D）水平的影響Fig.5 Effects of hawthorn pectin oligogalacturonide on TNF-α (A),IL-6 (B), MMP-1 (C) and Hyp (D) levels in HaCaT cells after UVB irradiation

2.7 qPCR分析結(jié)果

圖6 山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物對HaCaT細(xì)胞UVB輻射后MMP-1（A）、TNF-α及IL-6（B）mRNA水平的影響Fig.6 Effects of hawthorn pectin oligogalacturonide on mRNA expression levels of MMP-1 (A), TNF-α and IL-6 (B) in HaCaT cells after UVB irradiation

山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物可有效抑制經(jīng)UVB輻射后HaCaT細(xì)胞內(nèi)MMP-1、TNF-α及IL-6 mRNA水平升高（圖6）。經(jīng)UVB輻射后，MMP-1 mRNA水平極顯著升高（P＜0.01）。5、10 μg/mL山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物顯著或極顯著降低細(xì)胞內(nèi)MMP-1、TNF-α及IL-6 mRNA相對表達量（P＜0.05，P＜0.01）。mRNA表達水平檢測結(jié)果與含量或質(zhì)量濃度檢測結(jié)果一致。

3 討 論

果膠低聚糖的抗氧化能力與果膠的來源、品種、濃度、制備方式以及聚合度密切相關(guān)。柑橘果膠聚合度與DPPH自由基清除能力關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn)，酸性寡糖聚合度在一定范圍內(nèi)與DPPH自由基清除率呈現(xiàn)正相關(guān)性；但高聚合度的糖分子結(jié)合緊密，分子間有較強的相互作用力，削弱了酸性寡糖分子中羧基、羥基等基團的活性，因此其活性的強弱與果膠低聚糖的分子大小即聚合度有關(guān)[21-22]。本實驗中，隨著分離的進行，收集到的低聚半乳糖醛酸樣品存在著聚合度和質(zhì)量濃度的差異，因此選用DPPH自由基清除率較優(yōu)的分離液進行后續(xù)實驗。

陽光中的紫外線在生命周期中累積，造成細(xì)胞損傷，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。由紫外線引起的氧化應(yīng)激在皮膚細(xì)胞中引起細(xì)胞內(nèi)ROS的生成，導(dǎo)致細(xì)胞損傷，最終使細(xì)胞凋亡。山楂果膠水解后的低聚半乳糖醛酸具有較高的抗氧化活性，能夠調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝[11-12]。但對UVB誘導(dǎo)的皮膚細(xì)胞損傷的保護作用還有待研究。因此，對山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物對UVB誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞產(chǎn)生的氧化損傷和光老化保護作用進行了研究。經(jīng)UVB輻射后，HaCaT細(xì)胞會產(chǎn)生大量ROS，使皮膚抗氧化酶活力降低[23]，產(chǎn)生大量的自由基并攻擊細(xì)胞，導(dǎo)致氧化產(chǎn)物MDA含量增加，導(dǎo)致細(xì)胞損傷。另外，UVB輻射會損傷細(xì)胞膜的脂層結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞膜通透性變大、細(xì)胞內(nèi)容物外流，并使LDH外泄[24]。因此，LDH漏出率可作為細(xì)胞膜損傷的重要指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物能夠有效降低經(jīng)UVB輻射后的HaCaT細(xì)胞內(nèi)的MDA含量和ROS水平，降低LDH活力，阻止細(xì)胞膜通透性變大，從而保護細(xì)胞膜，并顯著提升受損細(xì)胞的存活率。茶葉中表沒食子兒茶素沒食子酸酯能夠降低細(xì)胞內(nèi)的MDA含量并降低LDH活力[24]，與本研究結(jié)果一致。

皮膚衰老是一個復(fù)雜的生物機制，主要原因是由于產(chǎn)生過多的自由基和ROS。紫外線引起的皮膚老化稱為光老化。UVB輻射能夠產(chǎn)生更多的ROS，造成氧化損傷，加速皮膚的衰老。前人研究結(jié)果顯示，多酚清除自由基的途徑是依賴抑制紫外線誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激[25]。一些化合物能夠捕獲自由基，并具有抗氧化的作用，可以減輕光老化。葡萄多酚具有清除自由基的能力，從而使細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著降低[25]。這與本研究結(jié)果一致，山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物顯著減少HaCaT細(xì)胞內(nèi)ROS的生成，從而保護細(xì)胞，減少氧化損傷。在皮膚光老化過程中，MDA含量、ROS水平、Hpy質(zhì)量濃度和SOD、GSH-Px、CAT活力變化都對皮膚老化產(chǎn)生重要影響。

皮膚老化引起真皮纖維的變化主要包括膠原纖維厚度、彈性、褶皺的變化。影響ROS水平的主要抗氧化酶包括GSH-Px、SOD和CAT，這些酶能夠通過多種內(nèi)源性細(xì)胞防御系統(tǒng)消除ROS，并對細(xì)胞氧化損傷有一定的保護作用。UVB輻射加速細(xì)胞脂質(zhì)過氧化物的生成，使GSH-Px、SOD、CAT活力和Hyp質(zhì)量濃度降低[26]。Hyp主要存在于膠原蛋白中，與膠原蛋白的合成有直接關(guān)系，其含量的多少成為評價皮膚光老化程度的重要指標(biāo)[27]。在本研究中，山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物能夠顯著提升GSH-Px、SOD、CAT活力和Hyp質(zhì)量濃度，因此能夠有效減緩皮膚光老化，促進膠原蛋白的合成。有研究表明，蔓越莓果汁可使UVB照射的細(xì)胞中LDH活力降低，并使Hyp含量提高[28]，與本研究結(jié)果一致。

光老化的皮膚中可見一系列細(xì)胞因子如IL、MMPs、活化蛋白以及DNA損傷的增加。MMPs可降解絕大部分細(xì)胞外基質(zhì)，是皮膚光老化的直接誘因。MMP-1是MMPs的特異性內(nèi)源性抑制物，能夠抑制MMPs的活化與表達，從而阻止光老化的發(fā)生。UVB依賴誘導(dǎo)MMP-1和MMP-3調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化和羥自由基水平[29]。紫外線照射能夠上調(diào)MMPs路徑，這些路徑與皮膚損傷中的膠原蛋白降解密切相關(guān)[30]。本研究表明，細(xì)胞暴露在30 mJ/cm2UVB輻射下40 s，MMP-1 mRNA水平極顯著提升，山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物能夠極顯著降低MMP-1 mRNA水平，有效抑制MMP-1分泌。據(jù)報道，海洋膠原蛋白水解物通過抑制MMP-1的表達可以抑制膠原蛋白的降解[31]，在鱈魚皮明膠蛋白酶解物中也有同樣的發(fā)現(xiàn)[32]，與本研究結(jié)果一致。

另外，TNF-α和IL-6是與UVB輻射有關(guān)的炎癥細(xì)胞因子。據(jù)報道，紫外線照射可引起HaCaT細(xì)胞的TNF-α和IL-6大量分泌[4]。TNF-α可促進IL-1β、IL-6和IL-8等其他炎癥因子的分泌。IL-6在角質(zhì)形成細(xì)胞-成纖維細(xì)胞相互作用環(huán)路中也起著重要的作用，這些炎性因子過量分泌，進一步加劇皮膚細(xì)胞的損傷[33]。本實驗研究結(jié)果顯示，經(jīng)過山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物處理后，HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的TNF-α和IL-6質(zhì)量濃度明顯下降，提示山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物可以通過抑制TNF-α和IL-6的分泌，改善細(xì)胞環(huán)境，減輕UVB輻射所造成的細(xì)胞損傷。

綜上，山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物對UVB輻射HaCaT細(xì)胞的氧化損傷及光老化具有保護作用，其作用機制可能與增強細(xì)胞抗氧化酶活力、降低ROS水平、抑制MMP-1分泌以及促進膠原蛋白合成有關(guān)。本研究為山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物作為保健食品對抑制UVB輻射造成的光氧化損傷及光老化的保護作用提供了一定的理論依據(jù)，但其抑制光氧化損傷和光老化保護作用的分子機制以及動物體內(nèi)實驗還有待進一步研究。