劉 瑋，王京雅，陳海霞*

（天津大學(xué)藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，天津 300072）

百合科蔥屬植物（Allium sativum L.）大蒜作為一種香料和藥用植物被廣泛使用已經(jīng)有4 000 年的歷史，其被加工成各種各樣的蒜類(lèi)產(chǎn)品，比如大蒜粉、大蒜油、大蒜果汁、黑蒜和臘八蒜等，形態(tài)味道各異[1-6]。大蒜具有抗氧化、抗菌、抗癌活性及心血管保護(hù)作用等[7-9]。1956年，Joslyn等[10]發(fā)現(xiàn)將大蒜打成破碎的蒜泥后，加入乙酸能使其變綠。在我國(guó)北方，臘八蒜及發(fā)綠的醋浸大蒜就是一種綠變大蒜，它作為一種傳統(tǒng)的風(fēng)味小食，深受人們喜愛(ài)[11-12]。根據(jù)洋蔥紅變機(jī)理[13]，推測(cè)大蒜綠變過(guò)程也經(jīng)歷了類(lèi)似的反應(yīng)。當(dāng)大蒜組織破碎，細(xì)胞液泡中的蒜氨酸酶與基質(zhì)中的蒜氨酸以及其他含硫化合物發(fā)生一系列酶促反應(yīng)和非酶反應(yīng)，最終形成兩種色素，即黃色素（yellow pigments，YP）和藍(lán)色素（blue pigments，BP），它們分別在440 nm和590 nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰，而B(niǎo)P由于其不穩(wěn)定性，會(huì)部分分解成YP，兩者混合形成綠色素[14-15]。大蒜綠變形成的色素完全溶解于體積分?jǐn)?shù)70%～80%的丙酮溶液、微溶于正己烷和石油醚，且綠變大蒜丙酮提取的色素在400～450 nm波長(zhǎng)處有強(qiáng)吸收[16]。趙曉丹[17]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明醋漬綠變大蒜的色素分子Molish反應(yīng)的結(jié)果均為陽(yáng)性，這說(shuō)明分子中可能有糖類(lèi)的存在，同時(shí)色素可以被酸性水溶液較好地浸提出來(lái)，結(jié)合氫譜推測(cè)其結(jié)構(gòu)中含有－NH2基團(tuán)。陳聰[18]通過(guò)分離色素推測(cè)其相對(duì)分子質(zhì)量為527，分子結(jié)構(gòu)中含有C＝C、C＝S，可能為含N的吡咯衍生物。大蒜中的水溶性和脂溶性含硫化合物都具有較好的抗癌活性，比如二烯丙基硫化物能抑制結(jié)腸癌、食管癌和肝癌[19]。醋浸綠變大蒜提取物具有一定的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除活性，對(duì)HL-60人白血病細(xì)胞、BGG-823胃癌細(xì)胞具有一定的抑制增殖作用[17]。但是目前對(duì)綠變大蒜色素的抗肝癌活性研究比較缺乏，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)大孔樹(shù)脂及制備液相色譜分離BP和YP，并進(jìn)一步分離出了BP-1和YP-3兩種化合物，建立H22荷瘤小鼠模型，觀(guān)察BP和YP對(duì)H22荷瘤小鼠的抑瘤作用及免疫調(diào)節(jié)作用，考察BP-1和YP-3對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制增殖作用，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)綠變大蒜功能食品提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

雄性昆明小鼠，清潔級(jí)，體質(zhì)量（20.0±2.0）g，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證編號(hào)：SCXK（京）2014-0004。鼠源性H22肝癌細(xì)胞，人源性HepG2肝癌細(xì)胞均購(gòu)自上海細(xì)胞庫(kù)。

大蒜購(gòu)自天津市南開(kāi)區(qū)市場(chǎng)。

DMEM（Dulbecco’s modified Eagle medium）培養(yǎng)基、10%胎牛血清、磷酸鹽緩沖液、噻唑藍(lán)（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT） 天津百倍生物科技有限公司；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）、白細(xì)胞介素（interleukin-2，IL-2）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）試劑盒 南京建成生物科技有限公司；環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）（批號(hào)15101225） 江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司；0.9%氯化鈉注射液（生理鹽水） 河北天成藥業(yè)股份有限公司；高效切片石蠟 上海華靈康復(fù)器械廠(chǎng)；蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，H&E）染液 天津百倍生物科技有限公司；二硫二硝基苯甲酸 美國(guó)Sigma公司；乙醇、正己烷、半胱氨酸（均為分析純） 天津康科德試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

QuikSep LC-10高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 北京慧德易公司；電子天平 北京賽多利斯儀器有限公司；BDS-200倒置顯微鏡 重慶奧特光學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 BP和YP的分離純化

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期的研究方法[20]，在室溫下將普通白大蒜用組織破碎器處理成蒜泥，放置30 min。然后用體積分?jǐn)?shù)5%的醋酸充分浸潤(rùn)，放置于50 ℃烘箱，孵育60 min，升溫至80 ℃后再孵育30 min，蒜泥呈碧綠色時(shí)取出。得到的綠變大蒜用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液冷浸提取3 次，每次24 h，提取液過(guò)濾后，55 ℃真空濃縮得到綠變大蒜乙醇提取物。取預(yù)處理好的AB-8大孔樹(shù)脂裝柱，將綠變大蒜乙醇提取物溶解在去離子水中上樣，然后用去離子水和體積分?jǐn)?shù)30%、50%乙醇溶液依次洗脫，分別收集在590 nm和440 nm波長(zhǎng)處有最大吸收的組分，得到BP和YP。含硫化合物含量測(cè)定方法根據(jù)改良的Lawson法[21]，BP和YP經(jīng)過(guò)制備HPLC進(jìn)一步分離純化得到BP-1（純度約為90.2%）和YP-3（純度約為88.6%）。BP和YP中含硫化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為（79.21±0.88）%和（73.42±1.59）%。

1.3.2 BP-1和YP-3對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用

參考文獻(xiàn)[14]的MTT法，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HepG2細(xì)胞24 h后分別加入BP-1、YP-3（30、60、90、150 μg/mL），用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)為490 nm。細(xì)胞抑制率根據(jù)公式（1）計(jì)算。

1.3.3 BP和YP對(duì)荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)狀況、免疫器官指數(shù)及水食效率的影響

在無(wú)菌條件下取傳代6～7 d的H22肝癌小鼠腹水，用生理鹽水稀釋成含量為1×107個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，于每只小鼠右側(cè)腋窩皮下接種0.2 mL。當(dāng)腫瘤生長(zhǎng)到80～100 mm3時(shí)視為造模成功并進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。

1.3.3.1 動(dòng)物分組和給藥

將荷瘤小鼠隨機(jī)分成8 組，每組10 只，包括模型組（灌胃給予質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9%的生理鹽水）、陽(yáng)性對(duì)照組（腹腔注射CTX：20 mg/kg）、BP低、中、高劑量組（分別為L(zhǎng)-BP：75 mg/kg、M-BP：150 mg/kg、H-BP：300 mg/kg），YP低、中、高劑量組（分別為L(zhǎng)-YP：75 mg/kg、M-YP：150 mg/kg、H-YP：300 mg/kg），YP和BP用生理鹽水混懸，灌胃給藥，每天給藥1 次，連續(xù)給藥14 d。

1.3.3.2 小鼠水食效率（攝食效率、攝水效率）及腫瘤體積的計(jì)算

給藥期間每日測(cè)定小鼠的體質(zhì)量、攝食量及攝水量，分別根據(jù)公式（2）、（3）計(jì)算小鼠的攝食效率和攝水效率。

每隔2～3 d用游標(biāo)卡尺測(cè)量并記錄腫瘤長(zhǎng)和寬，根據(jù)式（4）計(jì)算腫瘤體積（V）。

式中：L、W分別為腫瘤的長(zhǎng)和寬/mm。

觀(guān)察不同劑量的BP和YP對(duì)荷瘤小鼠的水食效率的影響和給藥期間腫瘤生長(zhǎng)體積的變化趨勢(shì)，并與模型組和陽(yáng)性對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比。

1.3.3.3 抑瘤率、免疫器官指數(shù)的計(jì)算

給藥第14天，摘除眼球取血，離心收集血清。頸椎脫臼處死小鼠，剝離胸腺、脾、肝臟、腫瘤并稱(chēng)質(zhì)量。分別根據(jù)公式（5）～（7）計(jì)算抑瘤率、胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。

1.3.4 BP和YP對(duì)荷瘤小鼠中細(xì)胞因子水平的影響

取1.3.3.3節(jié)中收集的血清，按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定各組荷瘤小鼠血清中TNF-α、IL-2和VEGF的含量。分析BP和YP對(duì)荷瘤小鼠血清中細(xì)胞因子水平的影響，考察荷瘤小鼠在給藥后免疫水平的變化情況。

1.3.5 BP和YP對(duì)荷瘤小鼠中抗氧化酶和轉(zhuǎn)氨酶的影響

取1.3.3.3節(jié)中剝離的肝臟，制備體積分?jǐn)?shù)10%肝勻漿液，按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定各組荷瘤小鼠肝臟中SOD、GSH-Px、CAT、ALT、AST的活力以及MDA含量。

1.3.6 腫瘤組織病理學(xué)檢驗(yàn)

取1.3.3.3節(jié)中剝離的腫瘤，用體積分?jǐn)?shù)10%福爾馬林溶液固定，經(jīng)石蠟包埋、切片、常規(guī)H&E染色，在光學(xué)顯微鏡放大400 倍下觀(guān)察并拍照，分析給藥前后腫瘤組織的病理學(xué)變化。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各項(xiàng)指標(biāo)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 BP和YP分離純化

圖1 BP和YP的洗脫曲線(xiàn)Fig.1 Elution curves of BP and YP

綠變大蒜的色素通過(guò)AB-8大孔樹(shù)脂分離，體積分?jǐn)?shù)30%乙醇溶液洗脫得到了YP，體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液洗脫得到了BP，多次收集在440 nm和590 nm波長(zhǎng)處有最大吸收的組分，分別得到BP和YP（圖1）。

圖2 BP-1和YP-3的HPLC-質(zhì)譜圖Fig.2 HPLC-MS profiles of BP-1 and YP-3

制備HPLC繼續(xù)分離得到BP-1和YP-3，經(jīng)過(guò)質(zhì)譜測(cè)定其相對(duì)分子質(zhì)量分別為359和365（圖2），推測(cè)其分子式分別為C19H17N4O2S和C16H11N2O6S。Kubec等[22]推測(cè)綠色素可能是硫代硫酸酯反應(yīng)的產(chǎn)物。色素提取物可能是多種物質(zhì)的混合物，包括碳?xì)浠衔?、醇?lèi)、醛類(lèi)、酸類(lèi)、多酚及色素，用大孔樹(shù)脂XAD-16或葡聚糖LH-20對(duì)色素提取物進(jìn)行純化。通過(guò)C譜和質(zhì)譜分析并推測(cè)其分子式可能為C25H17NO3S、C25H21N3OS、C25H33N3OS、C25H49NOS、C26H21NO2S、C26H37NOS等[14,23]。

2.2 BP-1和YP-3對(duì)HepG2的增殖抑制作用

圖3 BP-1和YP-3對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用Fig.3 Anti-proliferative effects of BP-1 and YP-3 on HepG2 cells

如圖3所示，BP-1和YP-3對(duì)HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)均具有一定的抑制作用，且BP-1的抑制率最高為75.32%（半數(shù)抑制濃度為58.31 μg/mL），抑制作用大于YP-3（P＜0.05）。

2.3 BP和YP對(duì)荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)狀況、免疫器官指數(shù)及水食效率的影響

表1 BP和YP對(duì)H22荷瘤小鼠的抑瘤作用及臟器指數(shù)的影響Table1 Effects of BP and YP on tumor and organ indexes of H22 tumor-bearing mice

由表1可知，BP、YP連續(xù)灌胃14 d后，荷瘤小鼠的腫瘤質(zhì)量高度顯著低于模型組（P＜0.001），L-BP、M-BP、H-BP的抑瘤率分別為43.47%、46.67%和59.85%；L-YP、M-YP、H-YP 3 組劑量對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑瘤率分別為29.31%、34.85%、42.36%，呈劑量依賴(lài)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明當(dāng)BP劑量為300 mg/kg時(shí)，具有較好的抑瘤效果，且BP相對(duì)YP，對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)抑制作用更明顯。與模型組相比，BP和YP低、中、高3 組劑量均能高度顯著升高其脾臟指數(shù)（P＜0.001）；M-BP、H-BP能顯著升高胸腺指數(shù)（P＜0.01，P＜0.001），表明BP和YP均能一定程度增強(qiáng)機(jī)體免疫功能。與陽(yáng)性對(duì)照組相比，H-BP給藥后脾臟指數(shù)極顯著升高（P＜0.01）。

圖4 給予BP和YP 14 d內(nèi)荷瘤小鼠的腫瘤體積（A）及水食效率（B）Fig.4 Tumor volume (A) and food and water efficiency (B) in response to BP and YP

由荷瘤小鼠的腫瘤體積變化（圖4A）可知，陽(yáng)性對(duì)照組增長(zhǎng)速率最慢，M-BP較M-YP變緩。另外，用水食效率來(lái)評(píng)價(jià)荷瘤小鼠生存質(zhì)量，與BP和YP相比，經(jīng)CTX治療后的荷瘤小鼠的水食效率高度顯著降低（P＜0.001）（圖4B），說(shuō)明CTX雖然能夠抑制腫瘤生長(zhǎng)，但是會(huì)嚴(yán)重?fù)p害小鼠的健康狀況。而綠變大蒜色素BP、YP可以不同程度地抑制H22荷瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng)，并且相對(duì)CTX具有較低的毒性，能改善荷瘤小鼠的自身免疫功能和提高生存質(zhì)量。

2.4 BP和YP對(duì)荷瘤小鼠血清中細(xì)胞因子水平的影響

細(xì)胞因子通過(guò)細(xì)胞毒的效應(yīng)細(xì)胞直接刺激腫瘤部位的免疫效應(yīng)細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別能力。迄今為止，眾多的動(dòng)物腫瘤模型研究表明，細(xì)胞因子具有廣泛的抗腫瘤活性[24-25]。VEGF能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，增加細(xì)胞外基質(zhì)合成，使腫瘤血管通透性增加，有利于原位癌向周?chē)M織蔓延和侵犯促進(jìn)血管形成，是腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程中的重要因子[26]。由表2可知，與模型組相比，3 個(gè)劑量濃度的BP和YP都能夠高度顯著降低VEGF的表達(dá)（P＜0.001）。在VEGF的表達(dá)上，TNF-α是一種常見(jiàn)的免疫因子，當(dāng)TNF-α和IL-2表達(dá)水平上調(diào)時(shí)，反映腫瘤生長(zhǎng)受到抑制[27]。文獻(xiàn)報(bào)道人肝癌細(xì)胞BEL7402經(jīng)大蒜素處理后，對(duì)照組人肝癌細(xì)胞VEGF與HPRT的比值為（30.16±8.39）%，VEGF的表達(dá)明顯降低[28]。與模型組相比，BP 3 個(gè)劑量組的IL-2和TNF-α質(zhì)量濃度顯著升高（P＜0.05），H-BP對(duì)這2種細(xì)胞因子的表達(dá)水平的提高效果最為顯著（P＜0.001）；結(jié)果表明，BP和YP可以促進(jìn)TNF-α和IL-2的分泌，抑制VEGF的表達(dá)，提高機(jī)體免疫水平。

表2 BP and YP對(duì)H22荷瘤小鼠血清中VEGF、IL-2和TNF-α質(zhì)量濃度的影響Table2 Effects of BP and YP on VEGF, IL-2 and TNF-α levels in serum of H22 tumor-bearing mice pg/mL

2.5 BP和YP對(duì)荷瘤小鼠肝臟中SOD﹑CAT﹑GSH-Px、MDA和轉(zhuǎn)氨酶的影響

表 3 BP和YP對(duì)H22荷瘤小鼠肝臟中CAT、GSH-Px、SOD、ALT、AST活力和MDA含量的影響Table3 Effects of BP and YP on CAT, GSH-Px, SOD, ALT and AST activities and MDA contents in liver of H22 tumor-bearing mice

GSH-Px、CAT和SOD是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的關(guān)鍵抗氧化酶，酶活力的升高一定程度上反映了藥物對(duì)肝臟的保護(hù)作用。如表3所示，與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組及BP、YP各劑量組SOD、CAT、GSH-Px活力顯著升高（P＜0.01，P＜0.001），MDA含量高度顯著降低（P＜0.001）；與陽(yáng)性對(duì)照組相比，M-BP和H-BP的SOD、CAT﹑GSH-Px活力高度顯著升高（P＜0.001）。與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組ALT和AST的活力極顯著升高（P＜0.01），反映出化療藥CTX對(duì)小鼠肝腎的損害[29]。機(jī)體的SOD、GSH-Px、CAT等酶具有清除氧自由基的能力，對(duì)機(jī)體起保護(hù)作用，能減少氧化損傷[30-31]。結(jié)果表明BP和YP干預(yù)后，肝臟氧化應(yīng)激水平降低，表現(xiàn)出對(duì)肝臟的保護(hù)效果，而CTX雖然能夠顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)，但是對(duì)肝臟損害較大。

2.6 腫瘤組織病理學(xué)分析

圖5 腫瘤組織的病理切片（400×）Fig.5 Histopathological studies of tumor tissues (400 ×)

H&E染色的腫瘤組織病理分析結(jié)果（圖5）表明，給藥后大量細(xì)胞呈現(xiàn)出壞死狀態(tài)。與模型組相比，給藥組的腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出稀疏的粉紅色的細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞縮小或消失，細(xì)胞核染色變淺且排列疏松。腫瘤周邊可見(jiàn)血管、纖維組織增生，少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。

3 討 論

關(guān)于綠變大蒜的藥理活性研究還處于初級(jí)階段，本實(shí)驗(yàn)探究了綠變大蒜色素對(duì)腫瘤的抑制作用。大蒜綠變色素分離得到的BP和YP可以不同程度地抑制H22荷瘤小鼠的生長(zhǎng)，且BP對(duì)腫瘤的抑制作用較YP更強(qiáng)。BP和YP不僅改善了H22荷瘤小鼠的生存質(zhì)量，增加肝臟中GSH-Px、CAT和SOD的活力，降低MDA的含量，增強(qiáng)機(jī)體免疫力和抗氧化水平，且對(duì)肝臟的損害相較化療藥較低。同時(shí)通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子水平，推測(cè)其抗腫瘤作用可能是通過(guò)抑制VEGF的活性，影響腫瘤血管形成；也可能是提高了IL-2和TNF-ɑ的水平來(lái)抑制腫瘤生長(zhǎng)。BP和YP進(jìn)一步分離的化合物BP-1和YP-3對(duì)HepG2細(xì)胞的具有較強(qiáng)的增殖抑制作用，這也表明了綠變大蒜具有體外抗癌活性。研究發(fā)現(xiàn)，大蒜中富含有機(jī)硫化物，綠變大蒜色素更是大蒜中硫化物的互相轉(zhuǎn)換產(chǎn)物，大蒜綠變成綠蒜的過(guò)程中，有多種酶參與反應(yīng)包括γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶和蒜氨酸酶，產(chǎn)生醚溶性的有機(jī)硫化物，色素前體物質(zhì)如-1-丙烯基-L-半胱氨酸亞砜。同時(shí)，大蒜中的硫代亞磺酸酯也參與大蒜綠變反應(yīng)。這些含硫化合物是大蒜中主要的抗癌活性物質(zhì)，推測(cè)也可能是綠變大蒜色素的成分之一。研究發(fā)現(xiàn)飲食中含有的大蒜類(lèi)成分可以降低罹患各類(lèi)惡性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)。但是目前缺乏對(duì)色素結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確鑒定以及抗癌機(jī)制的深入探討，因此還需要進(jìn)行更多的相關(guān)實(shí)驗(yàn)，為開(kāi)發(fā)綠變大蒜色素及其作為功能食品提供參考。