何 嬙，呂 倩，吳 躍*，林親錄，賈紅玲，寧亞麗

（中南林業(yè)科技大學食品科學與工程學院，稻谷及副產(chǎn)品深加工國家工程實驗室，湖南 長沙 410004）

大米作為世界范圍內(nèi)的主要糧食，我國2/3人口的主食，由于水體和土壤污染的加劇使其較其他糧食作物更易受到重金屬污染。就重金屬鎘（Cd）污染而言，19世紀80年代日本因食用Cd污染稻米引發(fā)的骨痛病事件曾引起全世界的廣泛關注，直到現(xiàn)在日本仍然存在嚴重的大米Cd污染問題[1-2]。而目前在我國大米重金屬Cd污染的形勢較為嚴峻[3]。Cd是迄今已知的最易在體內(nèi)蓄積的重金屬之一，其在人腎臟、肝臟等組織中的半衰期可達10～30 年[1]。人體的Cd暴露途徑主要是通過膳食，消化后Cd通過與人體消化道腸上皮細胞的特異性金屬轉運蛋白如DMT-1和MTP1結合，運輸?shù)窖?，然后與各組織器官中的金屬硫蛋白結合，開始長時間的蓄積[4]。Cd的腸吸收量被認為與其在膳食中污染濃度成正比，然而膳食中其他因素也會影響Cd的生物有效性[5]。除Fe、Zn、Ca等金屬元素對Cd的生物有效性有較大影響外[6-8]，茶多酚可促進機體內(nèi)Cd排除、降低Cd毒性[9-10]。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（(-)-epigallocatechin-3-gallate，EGCG）是茶多酚中生物活性顯著的兒茶素類單體，含量占兒茶素的80%[11]，其結構如圖1[12]所示。EGCG的C環(huán)上的沒食子基使其成為過渡金屬元素（如鐵和銅）螯合劑[13]。

圖1 EGCG的化學結構式Fig.1 Structure of EGCG

人體消化吸收過程復雜，體內(nèi)實驗模型較難建立。因此，可基于體內(nèi)消化環(huán)境模擬建立體外消化模型。RIVM（Rijksinstituut voor volksgezondheid en milieu）法是由Oomen等[14-15]創(chuàng)建的口腔-胃-小腸三步模擬法，可用于對有機污染物和土壤中金屬離子生物可給性的研究。機體對物質的吸收一般在小腸中進行Caco-2細胞來源于人結腸癌細胞系，其多種特性與小腸細胞類似，在食品科學領域中活性物質吸收代謝方面有廣泛的應用[16]。但Caco-2作為模型的重要不足是Caco-2細胞間緊密聯(lián)接程度比正常小腸細胞高，且缺乏分泌小腸黏液的能力[17]。因此，為了更好地模擬機體腸吸收功能，細胞共培養(yǎng)技術越來越受到關注。研究發(fā)現(xiàn)，HT-29細胞是可產(chǎn)生黏液的杯狀細胞，能補充Caco-2細胞缺乏的分泌黏液的能力，形成與小腸上皮細胞類似的黏液層[18]，其與Caco-2細胞共培養(yǎng)可更加精確地模擬人體小腸上皮細胞吸收過程。Stuknyt?等[19]首次在體外模擬胃腸消化實驗中證實了面包和面食樣品中釋放了小麥面筋蛋白外啡肽A5和C5，并且采用Caco-2/HT-29細胞共培養(yǎng)腸吸收模型驗證了A5和C5通過人腸黏膜轉運的可能性，表明食物經(jīng)體外胃腸消化后與Caco-2/HT-29細胞共培養(yǎng)腸吸收模型聯(lián)用，可模擬食物的消化和吸收的全過程。

因此，本研究結合體外口腔-胃腸消化，采用已建立并驗證的Caco-2/HT-29細胞共培養(yǎng)模型，分析主食米飯中Cd在胃腸消化階段的生物可給性，以及EGCG對Cd腸吸收階段的吸收轉運率影響，初步探究其影響機理，為利用EGCG降低大米主食中Cd的吸收轉運提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Cd污染大米（Cd含量為（0.720±0.006）mg/kg）產(chǎn)自湖南某礦區(qū)；Caco-2和HT-29細胞株 武漢大學細胞保藏中心（中國典型培養(yǎng)物保藏中心）；6 孔Transwell細胞轉運小室 美國Corning公司；TC20細胞計數(shù)儀美國Bio-Rad公司。

EGCG標準品（純度≥95%）、淀粉酶、尿酸、胰酶美國Sigma-Aldrich公司；Cd、Ca、Fe、Zn、Cu、Mg、Mn元素標準液 國家標準物質中心；高糖細胞培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM）、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清、青鏈霉素 美國Gibco公司；Hank’s平衡鹽溶液（Hank’s balanced salt solution，HBSS）、不含Ca、Mg的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、非必需氨基酸、L-谷氨酰胺美國Hyclone公司；黏蛋白、牛膽粉、脂肪酶 上海源葉生物科技有限公司；D-葡萄糖醛酸、牛血清白蛋白長沙市邁科為生物科技有限公司；胃蛋白酶 北京索萊寶科技有限公司；正丁酸、鹽酸（含量36%～38%）、氯化鉀、硫氰酸鉀、一水合磷酸二氫鈉、無水硫酸鈉、氯化鈉、碳酸氫鈉、尿素、無水氯化鈣、氯化銨、無水葡萄糖、磷酸二氫鉀、六水合氯化鎂、氫氧化鈉、鹽酸葡萄糖胺 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

ME204/02電子天平 梅特勒托利多儀器上海有限公司；四兩裝萬能粉碎機 浙江屹立工貿(mào)有限公司；DSI2-300A水浴恒溫振蕩器 太倉市實驗設備廠；HHD-2型電熱恒溫水浴鍋 上海比朗儀器有限公司；WK2102T電磁爐 美的集團；0.22 μm濾膜 美國Life Sciences公司；SORVALL LYNX6000高速冷凍離心機、3111系列二氧化碳培養(yǎng)箱 德國Thermo Scientific公司；SW-CJ超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；XDS-10倒置生物顯微鏡 上海團結儀器制造有限公司；DK-98電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；5418R低溫臺式離心機 德國Eppendorf公司；Mars5型微波消解儀 美國CEM公司；7700x型電感耦合等離子體質譜（inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICP-MS）儀 美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

將大米樣品挑揀去除雜質，稱取100 g放入粉碎機進行粉碎，然后過80 目篩，裝袋密封，即為生大米粉樣品，用于大米原料中Cd及其他金屬元素含量測定。

準確稱取10.00 g未淘洗去雜大米樣品（隨機平行挑選9 組），將其置于干凈且質量恒定的鋁盒（直徑7 cm）中，于分析天平上準確加入15.00 g超純水，蓋上鋁盒蓋子于電磁爐上蒸20 min，取出，待冷卻至室溫，即為米飯樣品。準確稱量9 組平行樣的質量（精確到小數(shù)點后4 位），計算1 g大米蒸煮后所得米飯質量。

1.3.2 體外模擬口腔-胃腸消化

參照Oomen等[15]的方法建立體外模擬胃腸消化模型，模擬消化液的配制見表1。

表1 模擬消化液的配制Table1 Preparation of simulated digestive juices

口腔消化：將制備好的米飯樣品全部取出，用研缽均勻搗碎，準確稱量到150 mL具塞三角瓶中，加入10 mL唾液，在37 ℃下，以55 r/min的轉速振蕩孵育5 min。

胃消化：向上述口腔消化食糜中加入20 mL胃液，添加體積分數(shù)10% HCl溶液或1 mmol/L NaOH溶液調整pH值到2.5±0.5，在37 ℃下，以55 r/min的轉速振蕩孵育2 h，取出3 個平行樣品放入－20 ℃冰箱中保存1 h后轉移至0 ℃，作為胃消化階段待測樣品，備用。其余樣品進行后續(xù)實驗。

腸消化：向上述胃消化食糜中加入30 mL十二指腸液、10 mL膽汁，添加體積分數(shù)10% HCl溶液或1 mmol/L NaOH溶液調整pH（6.5±0.5），在37 ℃下，以55 r/min的轉速振蕩孵育3 h和5 h，各取出3 個平行樣放入－20 ℃保存后1 h轉移至0 ℃，作為腸消化階段不同消化時間的待測樣品，備用。

消化過程結束時，將0 ℃保存的樣品，在95 ℃恒溫水浴鍋中滅酶10 min，全部轉移到高速離心管中，于高速冷凍離心機10 000 r/min離心30 min，取上清液過0.22 μm濾膜后，濾液放置4 ℃冰箱冷藏保存，用于后續(xù)的ICP-MS測定及吸收實驗。

1.3.3 體外模擬腸吸收

1.3.3.1 建立Caco-2/HT-29細胞共培養(yǎng)腸吸收模型

將Caco-2和HT-29細胞按照7∶3的比例，接種到6 孔Transwell小室AP側的聚酯薄膜上，并且調整最終總細胞濃度約為5×104個/mL，AP側加入完全培養(yǎng)基1.5 mL，BL側加入完全培養(yǎng)基2.5 mL，放置于5%的CO2細胞培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)，待細胞貼壁且?guī)缀蹰L滿時（2～3 d），更換添加1 mol/L丁酸的完全培養(yǎng)基，每2 d更換培養(yǎng)基，培養(yǎng)11 d，每組3 個平行。以上Caco-2/HT-29細胞共培養(yǎng)模型經(jīng)前期實驗驗證，可應用于后續(xù)的吸收實驗。

1.3.3.2 模擬腸吸收轉運實驗

圖2 腸吸收轉運Caco-2/HT-29細胞共培養(yǎng)模型示意圖Fig.2 Schematic diagram for the co-culture of Caco-2/HT-29 cells in small intestine

腸吸收轉運實驗在建立好的Caco-2/HT-29細胞共培養(yǎng)腸吸收模型中進行（圖2）。將模型從細胞培養(yǎng)箱中取出，小心吸取Transwell小室AP側和BL側的培養(yǎng)基，用37 ℃預熱的PBS（無Ca、Mg）輕輕洗2 次。分別將37 ℃預熱的米飯胃、腸消化液濾液1.5 mL加入到AP側，BL側加入2.5 mL HBSS（無Ca、Mg），將Transwell小室放置細胞培養(yǎng)箱中，2 h后轉運實驗結束，收集AP側溶液約1.5 mL，用于ICP-MS測定。

1.3.4 EGCG對吸收轉運率的影響

將50 mg EGCG標準品溶于50 mL的棕色容量瓶中，配制成2 182 μmol/L的標準儲備液。用大米樣品消化液濾液將EGCG標準儲備液稀釋成21.82 μmol/L和43.64 μmol/L的工作液，37 ℃預熱。將建立好的Caco-2/HT-29（細胞濃度比7∶3）細胞共培養(yǎng)腸吸收模型從細胞培養(yǎng)箱中取出，小心吸取Transwell小室AP側和BL側的培養(yǎng)基，用預熱的PBS（無Ca、Mg）清洗2 次。分別將1.5 mL消化液和含兩種濃度EGCG的消化液濾液加入到AP側，BL側加入2.5 mL HBSS（無Ca、Mg），將Transwell小室放置細胞培養(yǎng)箱中，2 h后轉運實驗結束，收集AP側溶液約1.5 mL，用于ICP-MS測定。

1.3.5 ICP-MS測定元素含量

分別測定大米、米飯、米飯消化液、EGCG添加前后米飯消化液經(jīng)腸吸收轉運后Cd及其他主要金屬元素的含量。

分別準確稱取0.5 g制備好的生大米粉及米飯樣品，1.0 g消化液濾液以及吸收過程Transwell小室AP側收集得到的溶液。將上述樣品置于聚四氟乙烯微波消解罐中，加HNO35～7 mL且加蓋密封，浸泡過夜。將消解罐對稱放入微波消解儀中，120 ℃消解3 min，180 ℃消解10 min，爬升時間分別為5 min和10 min。消解結束后，取出消解罐冷卻，將樣液轉移到25 mL燒杯，180 ℃加熱趕酸。消解液剩余約1 mL后取下燒杯，冷卻后轉移到25 mL容量瓶中，用少量超純水多次洗滌消化罐，合并洗滌液，用超純水定容后混勻，同時做試劑空白。采用ICP-MS測定元素的含量，每組樣品平行測定3 次[20]。

1.3.6 生物可給性的測定

生物可給性是指污染物在胃腸環(huán)境中可以溶出的比例，表示基質中污染物可被人體吸收的相對量[21]。

米飯中Cd及其他主要金屬元素的生物可給性由式（1）計算。

式中：ρIV為消化液中可溶性元素質量濃度/（mg/L）；VIV為消化反應液的體積/L；TC為米飯樣品中該金屬元素含量/（mg/kg）；mC為模擬消化中加入米飯質量/kg。

1.3.7 吸收轉運率的測定

采用Caco-2/HT-29細胞共培養(yǎng)模型來模擬機體小腸上皮細胞吸收轉運的過程，米飯消化液中Cd及其他主要金屬元素的轉運吸收率由式（2）計算。

式中：ρ為Transwell小室AP側元素的質量濃度/（mg/L）；V為AP側溶液的體積/mL；ρD為AP側加入胃腸消化液中元素的質量濃度/（mg/L）；VD為AP側加入胃腸消化液的體積/mL。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結果與分析

2.1 大米原料及蒸煮米飯中Cd及其他金屬元素含量

表2 生大米及其蒸煮米飯中Cd及其他金屬元素含量Table2 Contents of cadmium and other metal elements in raw and cooked ricemg/kg md

由表2可知，大米經(jīng)蒸煮后Cd的含量無顯著性差異。除Cu含量無顯著性差異和Zn有略微升高外，F(xiàn)e、Ca、Mg、Mn這4 種元素含量均存在不同程度的降低，推測其降低的原因可能與蒸煮過程中有小部分金屬元素溶解有關，該部分金屬元素通常會與蛋白質結合，熱處理促使蛋白質降解，從而使部分金屬元素作為自由態(tài)鹽離子或者與可溶態(tài)的氨基酸、蛋白質結合，溶解于蒸煮米水中，隨水分被揮發(fā)并殘留在鋁盒蓋子上凝結的水中。

2.2 米飯中Cd及其他金屬元素體外消化的生物可給性

表3 Cd污染米飯胃腸消化階段Cd及其他金屬元素生物可給性Table3 Bioavailability of cadmium and other metal elements in rice samples after gastric and gastrointestinal digestion%

生物可給性可描述攝入的食物中污染物經(jīng)消化釋放進入消化液中物質的相對百分率。如表3所示，米飯樣品分別在胃和小腸消化階段的Cd及其他主要金屬元素的生物可給性。其中Cd經(jīng)胃消化2 h的生物可給性為（73.58±1.92）%，腸消化7 h的生物可給性為（36.29±1.25）%。該研究結果與Zhuang Ping等[22]得出的蒸煮大米在胃消化階段的生物可給性為70%～74%，在腸消化階段為41%～46%的結果相近。Cd胃消化階段的生物可給性大于腸消化階段，這可能是因為大米胚乳中的Cd集中于蛋白質中[23]，而胃消化階段的主要消化酶是胃蛋白酶，大米經(jīng)蒸煮后淀粉熟化、蛋白質變性，胃液中酸性條件下（pH 2.5左右）大米中絕大多數(shù)蛋白質失活變性、肽鍵斷裂[24]，原本被淀粉包裹的蛋白質暴露出來，被胃蛋白酶水解，與蛋白質結合的Cd大量釋放進入消化液。胃消化后已經(jīng)沒有完整的米飯粒存在，進入小腸后，從強酸性升到pH 6.5左右，重金屬與蛋白質分解產(chǎn)生的Met、Cys等含硫氨基酸以及谷胱甘肽等結合，這些絡合物高度疏水，在弱酸的環(huán)境中形成不溶性沉淀，并且吸附在食糜上，隨著消化過程的繼續(xù)，消化液中已釋放的Cd又被重新吸附[25]。研究發(fā)現(xiàn)，pH值是影響金屬離子在溶液中生物吸附的重要因素，直接影響金屬離子在溶液中的溶解度，也影響著金屬離子對吸附劑吸附位點的競爭[26]。除了Cd以外，從表3還可看出，Ca、Mg、Zn和Mn等元素的生物可給性在小腸消化階段均顯著小于胃消化階段，而Fe和Cu元素相反，分析可能的原因是Fe和Cu在整個消化階段的吸附和釋放過程中，釋放的量要大于吸附量。

2.3 EGCG對消化液中Cd及其他主要金屬元素吸收轉運的影響

圖3 EGCG對消化液中Cd及其他主要金屬元素吸收轉運率的影響Fig.3 Effect of EGCG on absorption and transport rates of cadmium and other major metal elements in digestive fluid

膳食中污染物Cd消化后主要是在機體內(nèi)的小腸部位吸收。本實驗采用細胞共培養(yǎng)模型模擬腸吸收過程，通過ICP-MS測定計算出Cd及其他主要金屬元素的吸收轉運率。由圖3可知，與對照樣組相比，添加EGCG可降低Cd的轉運吸收率，且隨著EGCG濃度的增加顯著降低，21.82 μmol/L和43.64 μmol/L EGCG使Cd的轉運吸收率較對照組分別降低了5.56%和13.89%；而除Mn外，43.64 μmol/L EGCG使其他5 種金屬元素Fe、Ca、Zn、Cu和Mg的吸收轉運率均顯著增大。

EGCG能降低米飯消化液中Cd的轉運吸收，可能是由于，一方面，EGCG的多—OH結構能夠將游離的金屬離子固定，消減金屬離子被機體的吸收，而且EGCG對金屬離子的螯合順序也可能存在差異，這就會產(chǎn)生EGCG和金屬離子間的螯合反應對機體內(nèi)金屬離子含量動態(tài)平衡的影響[27]。另一方面，Cd是機體的非必需元素，因此，機體內(nèi)沒有專門負責Cd吸收轉運的特定通路及載體，Cd只能通過競爭必需金屬離子的轉運載體進入機體細胞。研究發(fā)現(xiàn)，可轉運Cd的載體主要包括鐵轉運載體DMT1、Ca2+通道（電壓門控鈣通道）和鈣庫調控的鈣通道以及鋅鐵調控蛋白ZIP家族中的ZIP8和ZIP14等[28]。在小腸中DMT1僅表達于小腸絨毛的腸上皮細胞[29]，其表達受到許多因素影響，進而會影響機體對Cd的吸收，而機體Fe水平與DMT1的表達之間存在負調節(jié)關系[30]。由于Ca2+和Cd2+具有相似的離子半徑，Cd2+也能利用Ca2+通道，而Cd導致機體細胞損傷的主要原因就是破壞細胞內(nèi)的鈣穩(wěn)態(tài)平衡[31]。研究發(fā)現(xiàn)，TRPV5和TRPV6通道不僅對Ca2+表現(xiàn)出高度的選擇性，而且在Ca2+缺乏的小鼠小腸細胞內(nèi)，當其他Cd轉運載體表達減少的情況下，二者的mRNA仍高度表達，同時小腸的Cd吸收增加，說明TRPV5和TRPV6也存在轉運Ca2+的可能[32]。非特異性鋅轉運體ZIP，除吸收轉運鋅以外，其中ZIP8和ZIP14具有吸收轉運Cd的作用[33-34]。Girijashanker等[35]研究發(fā)現(xiàn)，ZIP14在大鼠十二指腸、肝臟、腦部和睪丸高度表達，尤其對Cd2+有較高的親和力，但易受到Zn2+、Cu2+和Mn2+的抑制。

從圖3中可知，隨著EGCG濃度的增大，F(xiàn)e、Ca、Zn、Cu和Mg元素的吸收轉運率均顯著提高，推測Cd轉運吸收率的降低也可能是由于EGCG直接或間接上調了這5 種金屬元素的吸收轉運，這些金屬離子吸收轉運率的增加競爭性抑制Cd2+的吸收載體和通道，從而降低細胞對Cd2+的吸收轉運。Yu Haining等[36]研究發(fā)現(xiàn)，EGCG能使PC-3細胞減少對Cd2+的吸收，而增加對Zn2+的吸收，這種影響取決于EGCG和Cd2+的濃度及添加順序，分析其原因可能是Cd2+影響了EGCG的構象。

3 結 論

本實驗利用已建立的體外口腔-胃-腸消化模型和Caco-2/HT-29細胞共培養(yǎng)腸吸收模型，揭示出EGCG能夠有效降低米飯消化液中污染物Cd的吸收轉運。EGCG具有多種對人體有益的功效，并且其具有食用安全、成本相對低以及生物利用率高等優(yōu)點，因此有望成為降低Cd暴露人群健康危害的一項膳食干預方法。在后續(xù)研究中，擬采用動物實驗，進一步研究EGCG對大米中污染物Cd吸收轉運的影響機理。