虞文妹 周寶玉

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬常州市武進(jìn)中醫(yī)醫(yī)院中藥房，南京，213161)

藥對(duì)又名對(duì)藥，是醫(yī)師在長(zhǎng)期的臨床疾病診療過(guò)程歸納和總結(jié)出來(lái)的寶貴用藥經(jīng)驗(yàn)，是臨床用藥復(fù)方的最小配伍單位[1]。藥對(duì)配伍一直是傳統(tǒng)中藥學(xué)的主要組成部分，歷代醫(yī)家對(duì)其十分重視，并一直在進(jìn)行研究和改進(jìn)；通過(guò)不同形式的配伍使用，藥對(duì)或可通過(guò)相須、相使的作用以增強(qiáng)療效、并對(duì)主藥提供相輔作用而增強(qiáng)療效，使方中諸藥直達(dá)病所；或可通過(guò)相畏相殺而對(duì)組方中的藥物進(jìn)行相互制約而降低藥物的不良反應(yīng)[2-4]。黃連和吳茱萸的配伍使用由來(lái)已久，歷朝歷代均多有記載，《丹溪心法》中將其配伍6∶1使用，用以治療肝火犯胃，這體現(xiàn)寒熱配伍使用的經(jīng)典藥對(duì)組合[5]。黃連是多年生草本植物，為毛莨科黃連屬，最早記載見(jiàn)于《神農(nóng)本草經(jīng)》，因其根莖呈連珠狀而色黃，故而謂之，具有清熱燥濕，瀉火解毒之功效。吳茱萸為蕓香科吳茱萸屬、具有散熱止痛、降逆止嘔之功效。通過(guò)相似度評(píng)價(jià)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析，分析指紋圖譜中的有效信息，建立相對(duì)應(yīng)的指紋圖譜，以期為黃連和吳茱萸藥的物質(zhì)基礎(chǔ)、配伍機(jī)制和臨床應(yīng)用提供相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 超高效液相色譜(UPLC)儀(型號(hào)：ACQUITY，美國(guó)Waters公司)，質(zhì)譜檢測(cè)器(型號(hào)：Xevo TQ，美國(guó)Waters公司)。

1.2 試劑 研究中購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院的對(duì)照品有鹽酸小檗堿(110713-201212)，鹽酸巴馬汀(110732-201309)，鹽酸藥根堿(110733-201108)，吳茱萸堿(110802-201409)，吳茱萸次堿(110801-201207)，吳茱萸內(nèi)酯(110800-201205)；購(gòu)于上海純優(yōu)生物科技有限責(zé)任公司的對(duì)照品有黃連堿(3486-66-6)，表小檗堿(6873-09-2)。乙腈色譜純、甲酸色譜純、純水均購(gòu)于上海睿鷹生物科技有限公司。

1.3 分析樣品 不同產(chǎn)地的黃連-吳茱萸配伍藥對(duì)，藥對(duì)配伍比例均按照《丹溪心法》中6∶1的比較，研究共選擇4種不同來(lái)源，樣品1(S1)重慶石柱黃連和江西樟樹(shù)吳茱萸，樣品2(S2)四川峨眉山黃連和貴州印江吳茱萸，樣品3(S3)湖北利川黃連和浙江磐安吳茱萸，樣品4(S4)貴州羊昌黃連和貴州金沙吳茱萸；各藥對(duì)樣品均研磨成粉代用。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 選用ACQUITY UPLC BEH C18作為本次研究的色譜柱(1.7 μm，100 mm×2.1 mm)，柱溫為40 ℃；加入2 μL 10 ℃的樣品后，以乙腈(流動(dòng)相A)-純水加0.05% 甲酸(流動(dòng)相B)，流速為0.4 mL/min進(jìn)行梯度洗脫，具體梯度洗脫程序。見(jiàn)表1。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取適量1.2中所有的對(duì)照品，用100%甲醇溶解并制成混合對(duì)照品溶液。

表1 梯度洗脫程序

2.3 供試品溶液的制備 以3號(hào)篩篩取并精密稱(chēng)量1.3樣品粉末0.2 g于錐形瓶中，用50 mL 100%甲醇進(jìn)行溶解，為加速溶解進(jìn)程，可先浸泡1 h后再采用超聲法30 min，超聲期間搖勻溶液，待冷卻后用0.22 μm的微孔濾膜濾過(guò)，制成供試品溶液。

2.4 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 取同一供試品溶液根據(jù)2.3制備的供試品溶液各5 μL，采用薄層層析方法(TLC)對(duì)黃連、吳茱萸配伍藥對(duì)進(jìn)行專(zhuān)屬性試驗(yàn)，分別點(diǎn)與同一片硅膠G薄層色譜板，經(jīng)過(guò)展開(kāi)后，晾干硅膠G薄層色譜板，噴上含有2%對(duì)二甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液，加熱100 ℃，5 min后將色譜板放置于365 nm的紫外光燈下觀察，專(zhuān)屬性試驗(yàn)結(jié)果顯示黃連、吳茱萸配伍藥對(duì)的專(zhuān)屬性良好。

2.5 線(xiàn)性關(guān)系考察 精密量取混合對(duì)照品溶液20 μL，進(jìn)行UPLC反應(yīng)并以混合對(duì)照品進(jìn)樣量(μ g)為橫坐標(biāo)(X)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，結(jié)果表明，黃連回歸方程為Y=3310.8X+83.44，相關(guān)系數(shù)為0.9995，線(xiàn)性范圍為0.086～2.775；吳茱萸回歸方程為Y=13736X+2.18，相關(guān)系數(shù)為0.9997，線(xiàn)性范圍為0.0041～0.1326。

2.6 中間精密度試驗(yàn) 精密吸取10 μL同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，結(jié)果顯示平均RSD(相對(duì)標(biāo)注偏差)是1.8%，儀器精密度良好。

2.7 供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取10 μL同一供試品溶液，配置后分別放置0、2、4、8、12 h后進(jìn)樣檢測(cè)，結(jié)果顯示平均RSD是1.8%，試驗(yàn)條件穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 精密吸取10 μL同一供試品溶液，在相同UPLC儀器和色譜條件上檢測(cè)5次，結(jié)果顯示平均RSD為1.9%，重復(fù)性良好。

2.9 回收率試驗(yàn) 采用加樣回收法，精密稱(chēng)取6份已知含量的同一批號(hào)樣品各約0.5 g，分別精密加入20 mL混合對(duì)照品溶液，進(jìn)行回收率試驗(yàn)測(cè)定，計(jì)算結(jié)果顯示平均回收率為99.6%，RSD為1.4%。

2.10 樣品測(cè)定結(jié)果

2.10.1 指紋圖譜 在黃連、吳茱萸配伍藥對(duì)的對(duì)照指紋圖譜和樣品指紋圖譜的比較中，研究根據(jù)相對(duì)保留時(shí)間標(biāo)定16個(gè)較有特征的共有峰；這16個(gè)共有峰分別與單味黃連藥物及單味吳茱萸的指紋圖譜特征峰比較，發(fā)現(xiàn)9、15和16號(hào)共有峰是黃連、吳茱萸都存在的特征峰，而1、2、13、14號(hào)共有峰僅吳茱萸方有的特征峰，余下共有峰為黃連藥物的特征峰。見(jiàn)圖1和圖2。

圖1 黃連、吳茱萸配伍藥對(duì)的對(duì)照指紋圖譜

圖2 黃連、吳茱萸配伍藥對(duì)的樣品指紋圖譜

2.10.2 黃連、吳茱萸配伍藥對(duì)有效成分鑒定 研究采用UPLC和質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)合分析黃連、吳茱萸配伍藥對(duì)的有效成分進(jìn)行定性分析，結(jié)果顯示如表2，其中9、15和16號(hào)黃連、吳茱萸配伍藥對(duì)共有的特征峰，在結(jié)合質(zhì)譜分析和化合物質(zhì)裂解規(guī)律，推測(cè)出木蘭花堿、格陵蘭黃連堿和1-甲基-2壬基-4(1H)-奎若酮等3中化合物。

表2 黃連、吳茱萸配伍藥質(zhì)譜數(shù)據(jù)及有效成分鑒定

3 討論

3.1 提取的優(yōu)化分析 分別通過(guò)以下條件的比較分析，包括:1)提取溶劑[6-9]：提取溶劑需要根據(jù)中藥各成分在溶劑中的溶解性而選擇，溶解劑必須最大限度溶劑研究所需的有效成分而對(duì)不需要的成分僅有最小溶解度，溶解劑選擇中一般以強(qiáng)極性溶解劑水為首要考慮，其次根據(jù)所提取成分的親水性和親脂性而選擇不同的溶劑，在本研究中嘗試以親水性大于親脂性的甲醇和乙醇，不同比例甲醇(25%、50%、75%、100%)、乙醇、水進(jìn)行前期研究，尋找最佳提取濃度和比例，結(jié)果顯示100%甲醇的提取率和提取純度最高；2)提取方法主要有冷提和熱提2組方法[10-13]，其中超聲、微波、加熱回流、煎煮等屬于熱提法，最終發(fā)現(xiàn)超聲法提取過(guò)程中無(wú)需中途過(guò)濾，且使用的溶劑量最少，最大限度節(jié)約研究時(shí)間和研究成本；因此在超高效液相色譜(UPLC)檢測(cè)研究中，對(duì)色譜峰數(shù)、峰形、峰面積、分離度、基線(xiàn)指標(biāo)進(jìn)行分析后，最后將甲醇作為最后的提取溶劑，并用超聲波加速整個(gè)提取進(jìn)程。

3.2 色譜和質(zhì)譜的指紋圖譜條件優(yōu)化分析 梯度洗脫的不但調(diào)整流動(dòng)相的濃度配比條件優(yōu)化，能夠最大限度的縮短分析周期，并改善峰型減少其拖尾現(xiàn)象，提高藥物成分的分離程度及增加其靈敏度[14-16]。本實(shí)驗(yàn)嘗試了水-乙腈、不同濃度甲酸水如0.05%甲酸水、0.10%甲酸水、0.20%甲酸水、0.50%甲酸水、1.00%甲酸水與乙腈的流動(dòng)相濃度配比，水-甲醇、0.10%甲酸水分別與0.10%甲酸乙腈、甲醇、0.10%甲酸甲醇等流動(dòng)相配比，結(jié)果以0.05%甲酸水-乙腈這一流動(dòng)相系統(tǒng)為最優(yōu)的色譜和質(zhì)譜的指紋圖譜分析條件，得到較好且穩(wěn)定的色譜峰峰形;而在梯度洗脫程序中必須有穩(wěn)定的流速來(lái)保證其進(jìn)程的有序進(jìn)行，研究中采用恒流泵來(lái)保證流速的穩(wěn)定性，本研究最終選擇0.40 mL/min獲得色譜峰較好峰形且具有較好分離度。

3.3 超高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)定性分析 本研究中采用UPLC較普通的高效液相色譜法(HPLC)，具有更高的分離度，更高的速度以及更強(qiáng)的靈敏度[17]，同時(shí)本研究結(jié)合液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，利用質(zhì)譜對(duì)化合物鑒定的專(zhuān)門(mén)技術(shù)建立黃連、吳茱萸配伍藥對(duì)指紋圖譜，豐富黃連、吳茱萸配伍藥對(duì)指紋圖譜色譜峰的信息量、出峰數(shù)目、分離度，更加全面的反映了黃連、吳茱萸配伍藥對(duì)有效化學(xué)成分[18-20]。黃連-吳茱萸藥對(duì)配伍歷代醫(yī)家向來(lái)對(duì)其十分重視，歷代醫(yī)家及現(xiàn)代醫(yī)學(xué)均不斷的在研究黃連-吳茱萸藥對(duì)是通過(guò)相須、相使的作用以增強(qiáng)療效；亦或是通過(guò)相畏相殺而起到相互制約而降低藥物的不良反應(yīng)。本質(zhì)譜研究中質(zhì)荷比選擇了100～1000和200～800 2個(gè)條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示100～1000范圍內(nèi)的質(zhì)荷比能獲得相對(duì)較多色譜峰數(shù)，以S1黃連、吳茱萸配伍藥對(duì)為樣品采用UPLC-MS技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，鑒定16個(gè)特征色譜峰中主要成分和化合物，通過(guò)分析UPLC-MS與MS系統(tǒng)分析，同時(shí)結(jié)合色譜峰參考文獻(xiàn)[21-25]，結(jié)果顯示除了9、15和16號(hào)特征色譜峰外，來(lái)源于黃連的成分和化合物有分別歸屬其來(lái)源，其中鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸藥根堿、黃連堿和表小檗堿;來(lái)源于吳茱萸的成分和化合物有吳茱萸內(nèi)酯、吳茱萸堿和吳茱萸次堿；結(jié)合化合物質(zhì)譜裂解規(guī)律，推測(cè)出3種化合物，分別為木蘭花堿、格陵蘭黃連堿和1-甲基-2-壬基-4(1H)-喹諾酮。