李長(zhǎng)艷 田淑霞, 張婧嫻 肖 霄 郭 澄 杜 江 韓永龍,

(1 上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院，上海，200233； 2 貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院，貴陽(yáng)，550025； 3 上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海，201203)

東北鐵線蓮(ClematismanshuricaRupr.)是毛茛科鐵線蓮屬植物，其根及根莖可作為中藥威靈仙入藥，具有通絡(luò)止痛、祛風(fēng)濕之功效，在臨床上主要用于風(fēng)濕痹痛，肢體麻木，筋脈拘攣，屈伸不利等證候。目前，已有學(xué)者對(duì)東北鐵線蓮花、果中的揮發(fā)性成分進(jìn)行了研究分析[1-2]，還有學(xué)者研究證明東北鐵線蓮的醇提取物和少數(shù)單體可以通過抑制炎性反應(yīng)遞質(zhì)的產(chǎn)生發(fā)揮抗炎作用、緩解關(guān)節(jié)炎癥狀[3-8]，對(duì)東北鐵線蓮根莖中揮發(fā)油的相關(guān)研究報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)采用水蒸氣蒸餾法提取東北鐵線蓮中揮發(fā)油，結(jié)合抗炎指標(biāo)通過正交試驗(yàn)篩選揮發(fā)油的最佳提取工藝，為進(jìn)一步開發(fā)利用東北鐵線蓮揮發(fā)油提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞 RAW264.7細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.2 藥品及試劑 東北鐵線蓮購(gòu)于上海虹橋中藥飲片有限公司(批號(hào)160307)，經(jīng)鑒定為毛莨科鐵線蓮屬東北鐵線蓮(ClematismanshuricaRupr)的干燥根莖；二甲基亞砜(DMSO，ACS，批號(hào)：520C039，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；DMEM(Dulbecco minimum essential medium)培養(yǎng)基(維森特生物科技有限公司，批號(hào)：319006013)；磷酸緩沖鹽溶液(PBS，biosharp公司，批號(hào)：171860)；胎牛血清(FBS，杭州四季青生物工程材料有限公司，批號(hào)：20170710)；脂多糖(LPS，Sigma公司，批號(hào)：017M4112V)；MTT(Solarbio公司，批號(hào)：303H0528)；NO檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所有限公司，批號(hào)：20170919)。

1.3 儀器 0.22 μm有機(jī)相針式濾器(上海安普科學(xué)儀器有限公司)；藥篩(言錦絲網(wǎng)加工廠)；DFY-300型高速萬能粉碎機(jī)(上海新諾儀器設(shè)備有限公司)；TC-15型套式恒溫器(海寧市新華醫(yī)療器械廠)；圓底燒瓶，揮發(fā)油測(cè)定器，球形冷凝管(上海人貴儀器設(shè)備有效公司)；CKX31SF型倒置顯微鏡(Olympus公司)；SIMPLICITY型超純水系統(tǒng)(Millipore公司)；微量加樣器(Eppendorf公司)；TDL-80-2B型低速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；ALLEGRAX-22R型高速離心機(jī)(Beckman公司)；SW-CJ-2FD型潔凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；HWS24型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；Epoch型酶標(biāo)儀(BioTek公司)。

2 方法

2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選取飲片過篩目數(shù)、藥液比、回流時(shí)間為考察因素，每個(gè)因素取3個(gè)水平，按L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)。以揮發(fā)油提取率、NO抑制率為指標(biāo)，分別占加權(quán)評(píng)分70%、30%，以綜合評(píng)分值對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行直觀分析和方差分析(因素水平見表1，試驗(yàn)安排見表2)。

NO抑制率=(1-(實(shí)驗(yàn)組NO含量-對(duì)照組NO含量)/(模型組NO含量-對(duì)照組NO含量)×100%

綜合評(píng)分=各組提取率/最高組提取率×70+各組NO抑制率/最高組NO抑制率×30

表1 東北鐵線蓮揮發(fā)油的水蒸氣蒸餾工藝正交試驗(yàn)因素水平

2.2 水蒸氣蒸餾法提取東北鐵線蓮揮發(fā)油 東北鐵線蓮粉碎至相應(yīng)目數(shù)后，準(zhǔn)確稱取150 g置圓底燒瓶中，加入相應(yīng)比例的蒸餾水，30 ℃浸泡12 h，依次連接冷凝裝置及接收裝置，電熱套加熱保持微沸，回流相應(yīng)時(shí)間后收集揮發(fā)油并計(jì)算提取率。

2.3 工作液的配制 9次試驗(yàn)所得揮發(fā)油分別加DMSO配制濃度為105μg/mL母液，-20 ℃保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基依次稀釋成100 μg/mL、10 μg/mL、1 μg/mL實(shí)驗(yàn)工作液。LPS加PBS配制濃度為1.25 mg/mL母液，分裝于-20 ℃保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)用10% FBS培養(yǎng)基稀釋成100 μg/mL模型工作液。

2.4 細(xì)胞培養(yǎng)與給藥

2.4.1 RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng) RAW264.7細(xì)胞在37 ℃，5%CO2條件下，用含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)。

2.4.2 RAW264.7細(xì)胞活力檢測(cè) RAW264.7細(xì)胞按3×104/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后吸去原培養(yǎng)基，更換2%胎牛血清(FBS)培養(yǎng)基饑餓12 h。饑餓后，實(shí)驗(yàn)組每孔分別加入不同濃度的實(shí)驗(yàn)工作液100 μL；陰性對(duì)照組和模型組均加入10%FBS培養(yǎng)基100 μL(均設(shè)6個(gè)復(fù)孔)。培養(yǎng)1 h后，模型組和實(shí)驗(yàn)組每孔加入1 μL脂多糖(LPS)工作液(此時(shí)LPS濃度為1 μg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)36 h。36 h后觀察細(xì)胞狀態(tài)，吸取上層培養(yǎng)液至離心管，每孔加入新鮮培養(yǎng)液100 μL，再加入新配制的5 mg/mL MTT液10 μL，37 ℃避光孵育4 h，終止培養(yǎng)。吸去上清液，每孔加入DMSO150 μL，置搖床上低速振蕩10 min后，用酶標(biāo)儀于490 nm處測(cè)量各孔的吸光度值(A490 nm)。

細(xì)胞活力=(藥物孔A值-調(diào)零孔A值)/(陰性對(duì)照孔A值-調(diào)零孔A值)×100%

2.4.3 NO含量測(cè)定 收集至離心管的上層培養(yǎng)液，4 000 r/min離心5 min，取上清。采用NO檢測(cè)試劑盒測(cè)定上清中NO含量，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

2.5 數(shù)據(jù)處理 正交試驗(yàn)結(jié)果采用正交設(shè)計(jì)助手Ⅱ軟件和SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行直觀分析和方差分析。采用GraphPad5.02作圖，組間比較采用test檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 加藥刺激36 h后細(xì)胞活力

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

圖2 加藥刺激36 h后NO含量

注：與control組比較，*P<0.05；與LPS組比較，△P<0.05

3 結(jié)果

3.1 NO的抑制率 1、7、8、9#揮發(fā)油均有效，其中7#對(duì)NO抑制作用最強(qiáng)(圖2)；1～9#揮發(fā)油對(duì)NO的抑制率即揮發(fā)油濃度為100 μg/mL時(shí)對(duì)NO的抑制率。由直觀分析可知，各因素對(duì)提取工藝的影響順序?yàn)锳>B>C，即過篩目數(shù)對(duì)提取效果的影響最大，其次為藥液比。見表2。[我院威靈仙注射液含生藥1 g/mL，而100 μg/mL揮發(fā)油最多含生藥0.5 g/mL]

方差分析表明，因素A、B、C對(duì)揮發(fā)油得率的影響均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。確定最佳提取條件為A3B1C3，即過篩目數(shù)3#，藥液比1∶10，回流時(shí)間12 h。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析

3.2 驗(yàn)證試驗(yàn) 稱取東北鐵線蓮粉末(過3#篩)3份，每份150 g，按優(yōu)選的提取工藝進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果揮發(fā)油提取率分別為0.078%、0.079%和0.079%，NO抑制率分別為143.615%、135.881%和129.251%，綜合評(píng)分分別為99.118、97.855和96.999，說明優(yōu)化的水蒸氣蒸餾法提取工藝穩(wěn)定可靠。

4 討論

威靈仙和東北鐵線蓮揮發(fā)油的提取一般采用有機(jī)溶劑提取法[2]、水蒸氣蒸餾法[1,9-10]和超臨界CO2萃取技術(shù)[11]，傅瑤等[11]利用正交試驗(yàn)優(yōu)化威靈仙揮發(fā)油的超臨界萃取工藝，揮發(fā)油得率為0.44%。本工藝研究表明，水蒸氣蒸餾法提取東北鐵線蓮揮發(fā)油的收率較低，但利用LPS刺激RAW264.7細(xì)胞炎性反應(yīng)模型證明了東北鐵線蓮揮發(fā)油的抗炎活性。小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞來源于小鼠腹腔，是一類能夠進(jìn)行穩(wěn)定傳代培養(yǎng)的免疫細(xì)胞，在機(jī)體炎性反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[12-13]。以LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞可以模擬機(jī)體的炎性反應(yīng)，是目前常用的體外炎性反應(yīng)細(xì)胞模型[14-15]。LPS刺激與炎性反應(yīng)有關(guān)的一氧化氮合酶的表達(dá)，促使NO水平升高[16]，NO是由一氧化氮合酶催化合成的氣體分子，具有介導(dǎo)炎性反應(yīng)的作用[17]，因此抑制機(jī)體NO的產(chǎn)生是治療炎性反應(yīng)的重要手段。結(jié)果表明水蒸氣蒸餾法提取的東北鐵線蓮揮發(fā)油具有顯著的抗炎作用，且優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定、可靠，為東北鐵線蓮揮發(fā)油中有效成分及其藥理作用的研究提供了重要參考依據(jù)。