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        結(jié)合抗炎指標優(yōu)化東北鐵線蓮揮發(fā)油提取工藝

        2018-11-29 02:03:26李長艷田淑霞張婧嫻韓永龍
        世界中醫(yī)藥 2018年11期
        關鍵詞:鐵線蓮工作液水蒸氣

        李長艷 田淑霞, 張婧嫻 肖 霄 郭 澄 杜 江 韓永龍,

        (1 上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院,上海,200233; 2 貴陽中醫(yī)學院,貴陽,550025; 3 上海中醫(yī)藥大學,上海,201203)

        東北鐵線蓮(ClematismanshuricaRupr.)是毛茛科鐵線蓮屬植物,其根及根莖可作為中藥威靈仙入藥,具有通絡止痛、祛風濕之功效,在臨床上主要用于風濕痹痛,肢體麻木,筋脈拘攣,屈伸不利等證候。目前,已有學者對東北鐵線蓮花、果中的揮發(fā)性成分進行了研究分析[1-2],還有學者研究證明東北鐵線蓮的醇提取物和少數(shù)單體可以通過抑制炎性反應遞質(zhì)的產(chǎn)生發(fā)揮抗炎作用、緩解關節(jié)炎癥狀[3-8],對東北鐵線蓮根莖中揮發(fā)油的相關研究報道較少。本實驗采用水蒸氣蒸餾法提取東北鐵線蓮中揮發(fā)油,結(jié)合抗炎指標通過正交試驗篩選揮發(fā)油的最佳提取工藝,為進一步開發(fā)利用東北鐵線蓮揮發(fā)油提供實驗依據(jù)。

        1 材料

        1.1 細胞 RAW264.7細胞購于中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

        1.2 藥品及試劑 東北鐵線蓮購于上海虹橋中藥飲片有限公司(批號160307),經(jīng)鑒定為毛莨科鐵線蓮屬東北鐵線蓮(ClematismanshuricaRupr)的干燥根莖;二甲基亞砜(DMSO,ACS,批號:520C039,國藥集團化學試劑有限公司);DMEM(Dulbecco minimum essential medium)培養(yǎng)基(維森特生物科技有限公司,批號:319006013);磷酸緩沖鹽溶液(PBS,biosharp公司,批號:171860);胎牛血清(FBS,杭州四季青生物工程材料有限公司,批號:20170710);脂多糖(LPS,Sigma公司,批號:017M4112V);MTT(Solarbio公司,批號:303H0528);NO檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所有限公司,批號:20170919)。

        1.3 儀器 0.22 μm有機相針式濾器(上海安普科學儀器有限公司);藥篩(言錦絲網(wǎng)加工廠);DFY-300型高速萬能粉碎機(上海新諾儀器設備有限公司);TC-15型套式恒溫器(海寧市新華醫(yī)療器械廠);圓底燒瓶,揮發(fā)油測定器,球形冷凝管(上海人貴儀器設備有效公司);CKX31SF型倒置顯微鏡(Olympus公司);SIMPLICITY型超純水系統(tǒng)(Millipore公司);微量加樣器(Eppendorf公司);TDL-80-2B型低速離心機(上海安亭科學儀器廠);ALLEGRAX-22R型高速離心機(Beckman公司);SW-CJ-2FD型潔凈工作臺(蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司);HWS24型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學儀器有限公司);Epoch型酶標儀(BioTek公司)。

        2 方法

        2.1 正交試驗設計 選取飲片過篩目數(shù)、藥液比、回流時間為考察因素,每個因素取3個水平,按L9(34)正交表進行試驗。以揮發(fā)油提取率、NO抑制率為指標,分別占加權評分70%、30%,以綜合評分值對實驗結(jié)果進行直觀分析和方差分析(因素水平見表1,試驗安排見表2)。

        NO抑制率=(1-(實驗組NO含量-對照組NO含量)/(模型組NO含量-對照組NO含量)×100%

        綜合評分=各組提取率/最高組提取率×70+各組NO抑制率/最高組NO抑制率×30

        表1 東北鐵線蓮揮發(fā)油的水蒸氣蒸餾工藝正交試驗因素水平

        2.2 水蒸氣蒸餾法提取東北鐵線蓮揮發(fā)油 東北鐵線蓮粉碎至相應目數(shù)后,準確稱取150 g置圓底燒瓶中,加入相應比例的蒸餾水,30 ℃浸泡12 h,依次連接冷凝裝置及接收裝置,電熱套加熱保持微沸,回流相應時間后收集揮發(fā)油并計算提取率。

        2.3 工作液的配制 9次試驗所得揮發(fā)油分別加DMSO配制濃度為105μg/mL母液,-20 ℃保存,實驗時用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基依次稀釋成100 μg/mL、10 μg/mL、1 μg/mL實驗工作液。LPS加PBS配制濃度為1.25 mg/mL母液,分裝于-20 ℃保存,實驗時用10% FBS培養(yǎng)基稀釋成100 μg/mL模型工作液。

        2.4 細胞培養(yǎng)與給藥

        2.4.1 RAW264.7細胞培養(yǎng) RAW264.7細胞在37 ℃,5%CO2條件下,用含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)。

        2.4.2 RAW264.7細胞活力檢測 RAW264.7細胞按3×104/孔接種于96孔板中,培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后吸去原培養(yǎng)基,更換2%胎牛血清(FBS)培養(yǎng)基饑餓12 h。饑餓后,實驗組每孔分別加入不同濃度的實驗工作液100 μL;陰性對照組和模型組均加入10%FBS培養(yǎng)基100 μL(均設6個復孔)。培養(yǎng)1 h后,模型組和實驗組每孔加入1 μL脂多糖(LPS)工作液(此時LPS濃度為1 μg/mL),繼續(xù)培養(yǎng)36 h。36 h后觀察細胞狀態(tài),吸取上層培養(yǎng)液至離心管,每孔加入新鮮培養(yǎng)液100 μL,再加入新配制的5 mg/mL MTT液10 μL,37 ℃避光孵育4 h,終止培養(yǎng)。吸去上清液,每孔加入DMSO150 μL,置搖床上低速振蕩10 min后,用酶標儀于490 nm處測量各孔的吸光度值(A490 nm)。

        細胞活力=(藥物孔A值-調(diào)零孔A值)/(陰性對照孔A值-調(diào)零孔A值)×100%

        2.4.3 NO含量測定 收集至離心管的上層培養(yǎng)液,4 000 r/min離心5 min,取上清。采用NO檢測試劑盒測定上清中NO含量,具體操作按試劑盒說明書進行。

        2.5 數(shù)據(jù)處理 正交試驗結(jié)果采用正交設計助手Ⅱ軟件和SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行直觀分析和方差分析。采用GraphPad5.02作圖,組間比較采用test檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

        圖1 加藥刺激36 h后細胞活力

        注:與對照組比較,*P<0.05

        圖2 加藥刺激36 h后NO含量

        注:與control組比較,*P<0.05;與LPS組比較,△P<0.05

        3 結(jié)果

        3.1 NO的抑制率 1、7、8、9#揮發(fā)油均有效,其中7#對NO抑制作用最強(圖2);1~9#揮發(fā)油對NO的抑制率即揮發(fā)油濃度為100 μg/mL時對NO的抑制率。由直觀分析可知,各因素對提取工藝的影響順序為A>B>C,即過篩目數(shù)對提取效果的影響最大,其次為藥液比。見表2。[我院威靈仙注射液含生藥1 g/mL,而100 μg/mL揮發(fā)油最多含生藥0.5 g/mL]

        方差分析表明,因素A、B、C對揮發(fā)油得率的影響均無統(tǒng)計學意義。見表3。確定最佳提取條件為A3B1C3,即過篩目數(shù)3#,藥液比1∶10,回流時間12 h。

        表2 正交試驗設計和實驗結(jié)果

        表3 方差分析

        3.2 驗證試驗 稱取東北鐵線蓮粉末(過3#篩)3份,每份150 g,按優(yōu)選的提取工藝進行3次驗證試驗。結(jié)果揮發(fā)油提取率分別為0.078%、0.079%和0.079%,NO抑制率分別為143.615%、135.881%和129.251%,綜合評分分別為99.118、97.855和96.999,說明優(yōu)化的水蒸氣蒸餾法提取工藝穩(wěn)定可靠。

        4 討論

        威靈仙和東北鐵線蓮揮發(fā)油的提取一般采用有機溶劑提取法[2]、水蒸氣蒸餾法[1,9-10]和超臨界CO2萃取技術[11],傅瑤等[11]利用正交試驗優(yōu)化威靈仙揮發(fā)油的超臨界萃取工藝,揮發(fā)油得率為0.44%。本工藝研究表明,水蒸氣蒸餾法提取東北鐵線蓮揮發(fā)油的收率較低,但利用LPS刺激RAW264.7細胞炎性反應模型證明了東北鐵線蓮揮發(fā)油的抗炎活性。小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞來源于小鼠腹腔,是一類能夠進行穩(wěn)定傳代培養(yǎng)的免疫細胞,在機體炎性反應中發(fā)揮重要作用[12-13]。以LPS誘導RAW264.7細胞可以模擬機體的炎性反應,是目前常用的體外炎性反應細胞模型[14-15]。LPS刺激與炎性反應有關的一氧化氮合酶的表達,促使NO水平升高[16],NO是由一氧化氮合酶催化合成的氣體分子,具有介導炎性反應的作用[17],因此抑制機體NO的產(chǎn)生是治療炎性反應的重要手段。結(jié)果表明水蒸氣蒸餾法提取的東北鐵線蓮揮發(fā)油具有顯著的抗炎作用,且優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定、可靠,為東北鐵線蓮揮發(fā)油中有效成分及其藥理作用的研究提供了重要參考依據(jù)。

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