李長艷 田淑霞, 張婧嫻 肖 霄 郭 澄 杜 江 韓永龍,

(1 上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院，上海，200233； 2 貴陽中醫(yī)學院，貴陽，550025； 3 上海中醫(yī)藥大學，上海，201203)

東北鐵線蓮(ClematismanshuricaRupr.)是毛茛科鐵線蓮屬植物，其根及根莖可作為中藥威靈仙入藥，具有通絡止痛、祛風濕之功效，在臨床上主要用于風濕痹痛，肢體麻木，筋脈拘攣，屈伸不利等證候。目前，已有學者對東北鐵線蓮花、果中的揮發(fā)性成分進行了研究分析[1-2]，還有學者研究證明東北鐵線蓮的醇提取物和少數(shù)單體可以通過抑制炎性反應遞質(zhì)的產(chǎn)生發(fā)揮抗炎作用、緩解關節(jié)炎癥狀[3-8]，對東北鐵線蓮根莖中揮發(fā)油的相關研究報道較少。本實驗采用水蒸氣蒸餾法提取東北鐵線蓮中揮發(fā)油，結(jié)合抗炎指標通過正交試驗篩選揮發(fā)油的最佳提取工藝，為進一步開發(fā)利用東北鐵線蓮揮發(fā)油提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 細胞 RAW264.7細胞購于中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

1.2 藥品及試劑 東北鐵線蓮購于上海虹橋中藥飲片有限公司(批號160307)，經(jīng)鑒定為毛莨科鐵線蓮屬東北鐵線蓮(ClematismanshuricaRupr)的干燥根莖；二甲基亞砜(DMSO，ACS，批號：520C039，國藥集團化學試劑有限公司)；DMEM(Dulbecco minimum essential medium)培養(yǎng)基(維森特生物科技有限公司，批號：319006013)；磷酸緩沖鹽溶液(PBS，biosharp公司，批號：171860)；胎牛血清(FBS，杭州四季青生物工程材料有限公司，批號：20170710)；脂多糖(LPS，Sigma公司，批號：017M4112V)；MTT(Solarbio公司，批號：303H0528)；NO檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所有限公司，批號：20170919)。

1.3 儀器 0.22 μm有機相針式濾器(上海安普科學儀器有限公司)；藥篩(言錦絲網(wǎng)加工廠)；DFY-300型高速萬能粉碎機(上海新諾儀器設備有限公司)；TC-15型套式恒溫器(海寧市新華醫(yī)療器械廠)；圓底燒瓶，揮發(fā)油測定器，球形冷凝管(上海人貴儀器設備有效公司)；CKX31SF型倒置顯微鏡(Olympus公司)；SIMPLICITY型超純水系統(tǒng)(Millipore公司)；微量加樣器(Eppendorf公司)；TDL-80-2B型低速離心機(上海安亭科學儀器廠)；ALLEGRAX-22R型高速離心機(Beckman公司)；SW-CJ-2FD型潔凈工作臺(蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司)；HWS24型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學儀器有限公司)；Epoch型酶標儀(BioTek公司)。

2 方法

2.1 正交試驗設計 選取飲片過篩目數(shù)、藥液比、回流時間為考察因素，每個因素取3個水平，按L9(34)正交表進行試驗。以揮發(fā)油提取率、NO抑制率為指標，分別占加權評分70%、30%，以綜合評分值對實驗結(jié)果進行直觀分析和方差分析(因素水平見表1，試驗安排見表2)。

NO抑制率=(1-(實驗組NO含量-對照組NO含量)/(模型組NO含量-對照組NO含量)×100%

綜合評分=各組提取率/最高組提取率×70+各組NO抑制率/最高組NO抑制率×30

表1 東北鐵線蓮揮發(fā)油的水蒸氣蒸餾工藝正交試驗因素水平

2.2 水蒸氣蒸餾法提取東北鐵線蓮揮發(fā)油 東北鐵線蓮粉碎至相應目數(shù)后，準確稱取150 g置圓底燒瓶中，加入相應比例的蒸餾水，30 ℃浸泡12 h，依次連接冷凝裝置及接收裝置，電熱套加熱保持微沸，回流相應時間后收集揮發(fā)油并計算提取率。

2.3 工作液的配制 9次試驗所得揮發(fā)油分別加DMSO配制濃度為105μg/mL母液，-20 ℃保存，實驗時用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基依次稀釋成100 μg/mL、10 μg/mL、1 μg/mL實驗工作液。LPS加PBS配制濃度為1.25 mg/mL母液，分裝于-20 ℃保存，實驗時用10% FBS培養(yǎng)基稀釋成100 μg/mL模型工作液。

2.4 細胞培養(yǎng)與給藥

2.4.1 RAW264.7細胞培養(yǎng) RAW264.7細胞在37 ℃，5%CO2條件下，用含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)。

2.4.2 RAW264.7細胞活力檢測 RAW264.7細胞按3×104/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后吸去原培養(yǎng)基，更換2%胎牛血清(FBS)培養(yǎng)基饑餓12 h。饑餓后，實驗組每孔分別加入不同濃度的實驗工作液100 μL；陰性對照組和模型組均加入10%FBS培養(yǎng)基100 μL(均設6個復孔)。培養(yǎng)1 h后，模型組和實驗組每孔加入1 μL脂多糖(LPS)工作液(此時LPS濃度為1 μg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)36 h。36 h后觀察細胞狀態(tài)，吸取上層培養(yǎng)液至離心管，每孔加入新鮮培養(yǎng)液100 μL，再加入新配制的5 mg/mL MTT液10 μL，37 ℃避光孵育4 h，終止培養(yǎng)。吸去上清液，每孔加入DMSO150 μL，置搖床上低速振蕩10 min后，用酶標儀于490 nm處測量各孔的吸光度值(A490 nm)。

細胞活力=(藥物孔A值-調(diào)零孔A值)/(陰性對照孔A值-調(diào)零孔A值)×100%

2.4.3 NO含量測定 收集至離心管的上層培養(yǎng)液，4 000 r/min離心5 min，取上清。采用NO檢測試劑盒測定上清中NO含量，具體操作按試劑盒說明書進行。

2.5 數(shù)據(jù)處理 正交試驗結(jié)果采用正交設計助手Ⅱ軟件和SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行直觀分析和方差分析。采用GraphPad5.02作圖，組間比較采用test檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

圖1 加藥刺激36 h后細胞活力

注：與對照組比較，*P<0.05

圖2 加藥刺激36 h后NO含量

注：與control組比較，*P<0.05；與LPS組比較，△P<0.05

3 結(jié)果

3.1 NO的抑制率 1、7、8、9#揮發(fā)油均有效，其中7#對NO抑制作用最強(圖2)；1～9#揮發(fā)油對NO的抑制率即揮發(fā)油濃度為100 μg/mL時對NO的抑制率。由直觀分析可知，各因素對提取工藝的影響順序為A>B>C，即過篩目數(shù)對提取效果的影響最大，其次為藥液比。見表2。[我院威靈仙注射液含生藥1 g/mL，而100 μg/mL揮發(fā)油最多含生藥0.5 g/mL]

方差分析表明，因素A、B、C對揮發(fā)油得率的影響均無統(tǒng)計學意義。見表3。確定最佳提取條件為A3B1C3，即過篩目數(shù)3#，藥液比1∶10，回流時間12 h。

表2 正交試驗設計和實驗結(jié)果

表3 方差分析

3.2 驗證試驗 稱取東北鐵線蓮粉末(過3#篩)3份，每份150 g，按優(yōu)選的提取工藝進行3次驗證試驗。結(jié)果揮發(fā)油提取率分別為0.078%、0.079%和0.079%，NO抑制率分別為143.615%、135.881%和129.251%，綜合評分分別為99.118、97.855和96.999，說明優(yōu)化的水蒸氣蒸餾法提取工藝穩(wěn)定可靠。

4 討論

威靈仙和東北鐵線蓮揮發(fā)油的提取一般采用有機溶劑提取法[2]、水蒸氣蒸餾法[1,9-10]和超臨界CO2萃取技術[11]，傅瑤等[11]利用正交試驗優(yōu)化威靈仙揮發(fā)油的超臨界萃取工藝，揮發(fā)油得率為0.44%。本工藝研究表明，水蒸氣蒸餾法提取東北鐵線蓮揮發(fā)油的收率較低，但利用LPS刺激RAW264.7細胞炎性反應模型證明了東北鐵線蓮揮發(fā)油的抗炎活性。小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞來源于小鼠腹腔，是一類能夠進行穩(wěn)定傳代培養(yǎng)的免疫細胞，在機體炎性反應中發(fā)揮重要作用[12-13]。以LPS誘導RAW264.7細胞可以模擬機體的炎性反應，是目前常用的體外炎性反應細胞模型[14-15]。LPS刺激與炎性反應有關的一氧化氮合酶的表達，促使NO水平升高[16]，NO是由一氧化氮合酶催化合成的氣體分子，具有介導炎性反應的作用[17]，因此抑制機體NO的產(chǎn)生是治療炎性反應的重要手段。結(jié)果表明水蒸氣蒸餾法提取的東北鐵線蓮揮發(fā)油具有顯著的抗炎作用，且優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定、可靠，為東北鐵線蓮揮發(fā)油中有效成分及其藥理作用的研究提供了重要參考依據(jù)。