劉 欣 趙京霞 王 燕 李 萍

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院/北京市中醫(yī)研究所，北京，100010)

銀屑病中醫(yī)稱之為“白疕”，是一種臨床常見的難治性疾病，該病屬于具有一定遺傳背景的自身免疫性疾病，異常活化的T淋巴細(xì)胞及其釋放的細(xì)胞因子是銀屑病發(fā)病的核心環(huán)節(jié)。中醫(yī)認(rèn)為，“血分蘊(yùn)毒、熱毒入血傷絡(luò)”是銀屑病發(fā)病的主要病機(jī)[1]，治療上多以涼血解毒為法，涼血活血膠囊就是在該思想指導(dǎo)下由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院創(chuàng)制的治療銀屑病血熱證的院內(nèi)制劑。前期工作證明，涼血活血膠囊不僅能夠顯著改善患者的紅斑、浸潤及瘙癢等癥狀、降低外周血炎性反應(yīng)遞質(zhì)水平，其全方及拆方組分還可顯著抑制體外T淋巴細(xì)胞的過度增殖、活化，體現(xiàn)出明顯的免疫抑制及抗炎作用。紫草為涼血活血膠囊中的君藥，具有涼血活血解毒的多重作用。為進(jìn)一步研究涼血解毒類藥物對銀屑病的治療作用機(jī)制，本研究選擇紫草的主要活性成分紫草素作為研究對象，試圖觀察其對活化T淋巴細(xì)胞增殖、活化、釋放細(xì)胞因子的影響，并利用中藥單體對相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路做初步研究。

1 材料

1.1 細(xì)胞 Jurkat E6-1 T淋巴細(xì)胞株:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院協(xié)和細(xì)胞資源中心，37 ℃、5%CO2常規(guī)培養(yǎng)條件下用含10%的胎牛血清(Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS)的PRIM 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)3 d進(jìn)行傳代。

1.2 試劑 紫草素(shikonin)標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品鑒定所)；佛波醇酯(phorbol 12，13-dibutyrate，PDB)(美國Sigma公司，貨號P8139)；離子霉素(Ionomycin，IM)(美國Sigma公司，貨號I9657)；CCK-8檢測試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所，貨號JG659)；CD69抗體(美國BD公司，貨號341652)；白細(xì)胞介素-2(IL-2)、干擾素-γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)Instant ELISA檢測試劑盒(美國Bender公司，貨號分別為：BMS221HS，BMS228HS，BMS223HS)；BCA蛋白定量試劑盒(美國Thermo Fisher公司，貨號：23227)；山羊抗兔IgG(H+L)、山羊抗小鼠IgG(H+L)遠(yuǎn)紅外標(biāo)記二抗(美國KPL公司，貨號分別為：072-07-15-06，072-07-18-06)；p-c-Jun(Ser 63)、p-核因子-κB p65單克隆抗體(美國Cell Signaling Technology公司，貨號分別為：9261P，3033)。

1.3 PCR引物 引物均由上海生工合成。見表1。

1.4 儀器 超凈工作臺(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)，CO2培養(yǎng)箱(MCO-20AIC型SANYO日本)，流式細(xì)胞儀(FACSCalibur，美國BD公司)，熒光定量PCR儀(美國ABI7500應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)，電泳儀、電轉(zhuǎn)儀(美國Bio-Rad公司)，細(xì)胞破碎儀(HD3100型，德國Bandlin公司)，酶標(biāo)儀(美國Multiskanspeetrum Thermo公司)，Odyssey雙色紅外掃描儀(美國Gene Company Limited)。

2 方法

2.1 藥品制備 紫草素先用二甲基亞砜(Dimethylsulphoxide，DMSO)溶解，然后用乙醇進(jìn)行稀釋，臨用前以磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)將溶液中DMSO含量稀釋至1‰以下，乙醇含量稀釋至10%以下，如在稀釋過程中出現(xiàn)紫草素析出，采用超聲使其完全溶解。

2.2 紫草素濃度篩選 CCK-8法檢測。將細(xì)胞濃度調(diào)至1×105/mL接種于96孔板中，每孔100 μL；以終濃度分別為2×10-7mol/L的PDB和5×10-7mol/L的IM刺激活化細(xì)胞，同時(shí)加入終濃度分別為0.25 μg/mL、0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL和4 μg/mL的紫草素置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中48 h；檢測前4 h，每孔加入10 μLCCK-8，酶標(biāo)儀450 nm波長處檢測吸光度值。選擇對正常細(xì)胞無毒性且具有一定藥效學(xué)作用的濃度范圍作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的應(yīng)用劑量。

2.3 紫草素對活化的T淋巴細(xì)胞活性的影響 CCK-8法檢測。將細(xì)胞濃度調(diào)至1×105/mL接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL；加入終濃度分別為2×10-7mol/L的PDB和5×10-7mol/L的IM刺激活化細(xì)胞，同時(shí)加入由2.2確定劑量的紫草素。37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h，檢測前4 h，每孔加入10 μLCCK-8，酶標(biāo)儀450 nm波長處檢測吸光度值。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 紫草素對活化的T淋巴細(xì)胞表達(dá)CD69的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測。將細(xì)胞濃度調(diào)至2×105/mL接種于12孔板中，每孔1.5 mL；加入終濃度分別為2×10-7mol/L的PDB和5×10-7mol/L的IM，同時(shí)加入由2.2確定劑量的紫草素，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞并每組加入10 μL anti-CD69-PE，4 ℃冰箱避光孵育30～40 min。流式細(xì)胞儀檢測CD69陽性細(xì)胞表達(dá)率。每組設(shè)2個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5 紫草素對活化的T淋巴細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素-2(IL-2)、γ-干擾素(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的影響 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測。將細(xì)胞濃度調(diào)至1×106/mL加入12孔板中，每孔1 mL；加入終濃度分別為2×10-7mol/L的PDB和5×10-7mol/L的IM，同時(shí)加入由2.2確定劑量的紫草素，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)至48 h；離心收集細(xì)胞上清液，嚴(yán)格按ELISA試劑盒說明書步驟操作。每組設(shè)2個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 引物序列及產(chǎn)物大小

2.6 紫草素對活化的T淋巴細(xì)胞內(nèi)游離[Ca2+]i的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測。將細(xì)胞濃度調(diào)至5×105個(gè)/mL接種于6孔板中，每孔1.5 mL；加入終濃度分別為2×10-7mol/L PDB和5×10-7mol/L的IM，同時(shí)加入由2.2確定劑量的紫草素，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)16 h；收集細(xì)胞并加入濃度為5 μmol/L的Fluo-3AM 100 μL，37 ℃避光孵育30 min；洗去未結(jié)合染料，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+的熒光強(qiáng)度。每組設(shè)2個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.7 紫草素對活化的T淋巴細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶C(PKC)磷酸化蛋白水平的影響 ELISA檢測。將細(xì)胞濃度調(diào)至1×106/mL接種于6孔板中，每孔3 mL；加入終濃度分別為2×10-7mol/L的PDB和5×10-7mol/L的IM刺激活化細(xì)胞，同時(shí)加入由2.2確定劑量的紫草素，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，裂解細(xì)胞提取蛋白。ELISA操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。每組設(shè)2個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.8 紫草素對核轉(zhuǎn)錄因子NF-AT和AP-1組分c-Jun mRNA表達(dá)的影響 q-PCR法檢測。將細(xì)胞濃度調(diào)至1×106個(gè)/mL接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔3 mL；加入終濃度分別為2×10-7mol/L的PDB和5×10-7mol/L的IM及確定劑量的紫草素，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。收獲細(xì)胞，提取細(xì)胞總mRNA并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行。采用SYBR Green標(biāo)記，ABI 7500型熒光定量PCR儀檢測40個(gè)循環(huán)，采用2-△△CT法進(jìn)行目的基因的相對定量分析。每組設(shè)2個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.9 紫草素對核轉(zhuǎn)錄因子AP-1組分c-Jun及核因子-κB蛋白表達(dá)的影響 Western blotting法檢測。將細(xì)胞濃度調(diào)至1×106/mL接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，每瓶7 mL；加入終濃度分別為2×10-7mol/L的PDB和5×10-7mol/L的IM，及由2.2確定劑量的紫草素，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。離心收集細(xì)胞，裂解、提取總蛋白，BCA法蛋白定量。將聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，分別與p-c-Jun(1∶500)/p-核因子-κB-p65(1∶2000)/β-actin(1∶2000)一抗4 ℃孵育過夜。再與羊抗兔或羊抗鼠遠(yuǎn)紅外標(biāo)記的二抗(1∶10000稀釋)室溫孵育1.5 h。Odyssey雙色紅外掃描儀進(jìn)行條帶掃描。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3 結(jié)果

3.1 紫草素對活化的T淋巴細(xì)胞活性的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，4 μg/mL的紫草素將T淋巴細(xì)胞的活性降低至正常水平以下，與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表現(xiàn)出對細(xì)胞具有殺傷毒性；2～0.5 μg/mL的紫草素均可顯著抑制經(jīng)PDB+IM刺激活化的T淋巴細(xì)胞的活性，降低細(xì)胞增殖率，抑制率分別達(dá)到31.51%、26.45%和26.45%，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；而濃度為0.25 μg/mL的紫草素對活化的T淋巴細(xì)胞未表現(xiàn)出抑制作用，與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，顯示不出藥效。見表2。

因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇2～0.5 μg/mL作為紫草素的應(yīng)用濃度。

表2 紫草素對活化T淋巴細(xì)胞活性的影響

注:與模型組比較,*P<0.05；與對照組比較，△P<0.05

表3 紫草素對T細(xì)胞活化標(biāo)志CD69表達(dá)的影響

注:與模型組比較,*P<0.05；與對照組比較，△P<0.05

3.2 紫草素對T細(xì)胞活化CD69表達(dá)的影響 本實(shí)驗(yàn)用0.5～2 μg/mL的紫草素作用于經(jīng)PDB和IM活化的T淋巴細(xì)胞，結(jié)果顯示各濃度紫草素均可顯著降低T淋巴細(xì)胞表面CD69的表達(dá)率，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其抑制率分別為38.44%、61.18%和65.7%，平均降幅達(dá)55%。其中，以2 μg/mL的抑制作用最為明顯，其次為1 μg/mL，0.5 μg/mL的紫草素抑制率最低，呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。見圖1、表3。

圖1 紫草素對T細(xì)胞活化標(biāo)志CD69表達(dá)的影響

圖2 紫草素對活化的淋巴細(xì)胞中[Ca2+]i的影響

3.3 紫草素對活化T細(xì)胞分泌INF-γ的影響 以0.5～2 μg/mL的紫草素作用于活化的T淋巴細(xì)胞，均可顯著降低其INF-γ的分泌，分別為41.88%、61.51%、68.63%，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表現(xiàn)出一定的量效關(guān)系；其中以2 μg/mL紫草素的下調(diào)作用最為顯著，但其水平仍高于未活化細(xì)胞，與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

3.4 紫草素對活化T細(xì)胞分泌IL-2的影響 本實(shí)驗(yàn)中，0.5 μg/mL、1 μg/mL和2 μg/mL的紫草素均可顯著降低活化T淋巴細(xì)胞分泌IL-2的能力，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；以2 μg/mL的下調(diào)作用最為明顯，其抑制率可達(dá)74.74%，有效地抑制了細(xì)胞因子的過度釋放；0.5 μg/mL和1 μg/mL的紫草素對IL-2的抑制率分別為40.82%和50.83%，均不及2 μg/mL的作用，可見藥物濃度越高抑制作用越強(qiáng)。見表4。

3.5 紫草素對活化T細(xì)胞分泌TNF-α的影響 本實(shí)驗(yàn)所用0.5 μg/mL、1 μg/mL和2 μg/mL的紫草素均可顯著抑制活化的T淋巴細(xì)胞分泌TNF-α，其抑制率分別為19.63%、23.55%、49.34%,與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，藥物濃度越高則抑制率越高。其中2 μg/mL紫草素的抑制作用最為明顯，該組TNF-α的水平與對照組水平相當(dāng),與對照組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明該濃度藥物具有很好地抑制TNF-α分泌的功效，可將細(xì)胞調(diào)節(jié)至活化前水平；0.5 μg/mL和1 μg/mL的紫草素雖也可有效降低T淋巴細(xì)胞分泌TNF-α的水平，但與對照組比較其水平仍過高,與對照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 紫草素對活化T細(xì)胞分泌TNF-α和IL-2、INF-γ的影響

注:與模型組比較,*P<0.05；與對照組比較，△P<0.05

3.6 紫草素對活化T淋巴細(xì)胞內(nèi)游離[Ca2+]i變化的影響 結(jié)果顯示，活化后的T淋巴細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度明顯升高，Ca2+峰明顯右移，活化后胞內(nèi)游離Ca2+濃度較靜息狀態(tài)提高近300%，與對照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。0.5 μg/mL、1 μg/mL和2 μg/mL紫草素組細(xì)胞的Ca2+濃度較模型組均有所降低，其抑制率分別為18.18%、31.11%和64.84%，與模型組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，降幅與藥物濃度正相關(guān)。見圖2、表5。

3.7 紫草素對胞質(zhì)PKC磷酸化蛋白水平的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)活化后T淋巴細(xì)胞內(nèi)的PKC磷酸化蛋白水平明顯上升，比對照組提高62.28%，與對照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。1 μg/mL和2 μg/mL的紫草素作用于細(xì)胞后，均可明顯降低其PKC磷酸化蛋白的水平，降幅分別為16.82%和21.4%，與模型組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而0.5 μg/mL紫草素組的磷酸化蛋白的水平僅比模型組降低9.65%，與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2、表5。

表5 草素對活化T淋巴細(xì)胞中[Ca2+]i及PKC磷酸化蛋白水平的影響

注：與模型組比較,*P<0.05；與對照組比較，△P<0.05

3.8 紫草素對T淋巴細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子NF-AT mRNA表達(dá)的影響 本實(shí)驗(yàn)中模型組核轉(zhuǎn)錄因子NF-AT的mRNA大量表達(dá)，比對照組表達(dá)量提高2倍多(P<0.05)。經(jīng)不同濃度紫草素作用后的細(xì)胞，mRNA表達(dá)量均顯著下降，其降幅分別為31.71%、32.40%和47.74%，與模型組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中0.5 μg/mL和1 μg/mL劑量組的作用相近；2 μg/mL組的抑制作用最為明顯，表現(xiàn)出高濃度藥物作用明顯的趨勢。見表6。

3.9 紫草素對T淋巴細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子c-Jun mRNA表達(dá)的影響 實(shí)驗(yàn)表明，模型組細(xì)胞c-Jun mRNA表達(dá)量明顯高于對照組，比對照組提高52.05%(P<0.05)。經(jīng)0.5～2 μg/mL紫草素處理后的細(xì)胞c-Jun mRNA表達(dá)均有所下降，降幅分別為12.28%、18.13%、25.73%，與模型組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且與藥物濃度相關(guān)。見表6。

表6 草素對活化T淋巴細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子NF-AT和c-Jun mRNA表達(dá)的影響

注:與模型組比較,*P<0.05；與對照組比較，△P<0.05

3.10 紫草素對T淋巴細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子c-Jun蛋白表達(dá)的影響 結(jié)果顯示，模型組蛋白表達(dá)水平明顯高于對照組，0.5～2 μg/mL紫草素組的蛋白與模型組比較均有不同程度的降低。見圖3。

圖3 紫草素對活化的T淋巴細(xì)胞c-Jun蛋白表達(dá)的影響

3.11 紫草素對T淋巴細(xì)胞核因子-κB蛋白表達(dá)的影響 結(jié)果顯示，模型組核因子-κB蛋白表達(dá)水平明顯高于對照組；經(jīng)0.5～2 μg/mL紫草素處理后的細(xì)胞，其核因子-κB蛋白表達(dá)量均受到抑制，以1 μg/mL紫草素的作用最明顯。見圖4。

圖4 紫草素對活化的T淋巴細(xì)胞NF-κB蛋白表達(dá)的影響

4 討論

涼血活血膠囊是首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院的院內(nèi)制劑，該方是在趙炳南、張志禮等皮外科名家治療銀屑病常用有效方劑涼血解毒湯的基礎(chǔ)上經(jīng)過改進(jìn)工藝研制而成，充分體現(xiàn)中醫(yī)對于銀屑病血熱證治療以“清熱涼血、活血解毒”為法的辨證思想，是“涼血、解毒”治則指導(dǎo)下治療銀屑病的有效方劑。本課題組對涼血活血膠囊治療銀屑病的臨床療效做了長期且深入的驗(yàn)證和研究，證明該藥治療尋常型銀屑病血熱證安全有效，且涼血活血不留瘀，解毒養(yǎng)陰不傷正[2]。臨床研究證實(shí)，涼血解毒湯可明顯改善患者皮損處紅斑、浸潤面積、瘙癢等癥狀，總有效率達(dá)69.23%[3]；并且可明顯下調(diào)銀屑病血熱證患者外周血中IL-17、IL-1β、IFN-γ、IL-6、TNF-α和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的水平[4-6]，表現(xiàn)出一定的免疫抑制和調(diào)控作用。前期基礎(chǔ)研究表明，高、中、低劑量的涼血活血膠囊均可顯著抑制T淋巴細(xì)胞的異?；罨?，從而調(diào)控炎性反應(yīng)進(jìn)程，具有一定的免疫抑制功效[7]；其涼血、解毒拆方組分雖然在一定程度上也可抑制炎性反應(yīng)，但總體作用不如全方[8]。

本課題組在對涼血活血膠囊的拆方研究中發(fā)現(xiàn)，組方中的涼血類與解毒類藥物在劃分時(shí)存在一個(gè)交叉點(diǎn)，即單味中藥紫草。紫草是涼血活血膠囊中的君藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品。味苦，性寒。有涼血、活血、解毒、透疹之功[9]?？梢?，一味紫草身集涼血、解毒雙重功效，是涼血解毒中醫(yī)治則的典型代表。臨床研究表明，以紫草為君藥的紫草湯治療尋常型銀屑病總有效率達(dá)85.71%[9-10]。外用紫草乳膏可有效改善銀屑病皮損處的干燥、脫屑、瘙癢等癥狀，總有效率達(dá)75.86%[9，11]。實(shí)驗(yàn)研究表明，紫草素可降低咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病樣小鼠皮損的表皮層厚度，并可降低血清中IL-17、IL-6、TNF-α、IL-22的水平[12]；可抑制角質(zhì)細(xì)胞的過度增殖、誘導(dǎo)凋亡[13-14]；并可抑制樹突細(xì)胞成熟、分化，從而抑制其促淋巴細(xì)胞增殖的能力，從而改善銀屑病樣小鼠的皮損程度[15-16]。

本研究繼續(xù)觀察紫草素對T淋巴細(xì)胞活化及相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響。結(jié)果顯示0.5～2.0 μg/mL不同劑量的紫草素均可明顯降低T淋巴細(xì)胞的增殖、顯著抑制細(xì)胞表面活化分子CD69的表達(dá)和T細(xì)胞分泌Th1類細(xì)胞因子的功能，且有劑量依賴性，表現(xiàn)出一定的免疫抑制作用。

T淋巴細(xì)胞的活化是受到嚴(yán)格調(diào)控的。其中，PKC的激活和細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的升高是活化的早期事件，也是調(diào)控T細(xì)胞活化的中心步驟。PKC活化后一方面可通過經(jīng)典的DAG、Ras、Raf和MAPKKK途徑激活Fos和Jun蛋白結(jié)合形成的異源二聚體AP-1，另一方面通過BCL-10、Carma1、MALT1等信號分子直接激活核因子-κB[17]。胞內(nèi)持續(xù)的Ca2+脈沖信號可誘導(dǎo)CaN磷酸化，導(dǎo)致核轉(zhuǎn)錄因子NF-AT脫磷酸而被活化，并移位入核[18]?；罨暮宿D(zhuǎn)錄因子NF-AT與由PKC途徑生成的AP-1結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，與靶基因的調(diào)控元件結(jié)合，共同對靶基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。而活化的核因子-κB與其抑制蛋白IκBα解離后轉(zhuǎn)位入核，其序列上有IL-2、INF-γ、TNF-α等多種基因的結(jié)合位點(diǎn)，可直接調(diào)控多種細(xì)胞因子的表達(dá)。

紫草素對T細(xì)胞活化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究結(jié)果顯示，0.5～2.0 μg/mL紫草素均可顯著降低細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+的濃度和PKC磷酸化蛋白的水平，說明紫草素可對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上游的第二信使及關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)激酶發(fā)揮抑制作用。由此提示，紫草素可能對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的下游同樣具有調(diào)節(jié)作用，從而調(diào)控炎性反應(yīng)的進(jìn)程。實(shí)驗(yàn)對信號通路下游的核轉(zhuǎn)錄因子NF-AT、AP-1、核因子-κB mRNA和蛋白表達(dá)的研究結(jié)果證實(shí)：1)不同劑量的紫草素均對核轉(zhuǎn)錄因子NF-AT mRNA的表達(dá)產(chǎn)生明顯的抑制作用，濃度越高抑制作用越明顯。2)各劑量紫草素均可有效降低AP-1主要組分c-Jun的mRNA表達(dá)，并對其蛋白表達(dá)也均有明顯的抑制趨勢。對c-Jun蛋白表達(dá)的抑制可有效抑制AP-1異源二聚體的形成，從而抑制AP-1的生物活性，使其無法與核轉(zhuǎn)錄因子NF-AT在細(xì)胞核內(nèi)結(jié)合，進(jìn)而遏制需二者共同啟動(dòng)的靶基因的表達(dá)。3)各組紫草素均可抑制核因子-κB蛋白的表達(dá)，其中以1 μg/mL紫草素的作用最明顯。

綜上所述，本研究證明紫草素可以顯著抑制T淋巴細(xì)胞增殖、活化及細(xì)胞因子的釋放，具有一定的免疫抑制作用；同時(shí)還證明，紫草素可以通過下調(diào)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的第二信使Ca2+濃度和關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)激酶PKC的水平，抑制核轉(zhuǎn)錄因子NF-AT、AP-1和核因子-κB等核轉(zhuǎn)錄因子的mRNA及蛋白表達(dá)，從而對T淋巴細(xì)胞活化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)行調(diào)控。本研究為紫草素作為免疫抑制劑用于銀屑病的治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。