張藝欣， 寧 莉， 魏殿軍

（1.天津醫(yī)院輸血科，天津 300211；2.天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，天津 300211；3.河北燕達(dá)醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 廊坊 065201）

對(duì)比劑急性腎損傷（contrast-induced acute kidney injury，CIAKI）是指血管內(nèi)應(yīng)用對(duì)比劑后3 d內(nèi)出現(xiàn)急性腎損傷或原有腎損傷加劇，并排除其他原因?qū)е碌哪I功能障礙[1]。CIAKI是心臟冠狀動(dòng)脈造影和經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療的常見(jiàn)并發(fā)癥。隨著血管造影、增強(qiáng)電子計(jì)算機(jī)斷層掃描（computed tomography，CT）、心臟血管再通技術(shù)等一系列現(xiàn)代影像技術(shù)和介入治療的不斷應(yīng)用和發(fā)展，CIAKI發(fā)生率也呈逐年上升的趨勢(shì)，現(xiàn)居醫(yī)院獲得性急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）病因的第3位[1]?；颊咭坏┏霈F(xiàn)CIAKI，其病死率及預(yù)后不良、終末期腎病的發(fā)生率將顯著增加，同時(shí)住院時(shí)間也明顯延長(zhǎng)。因此，CIAKI的早期診斷對(duì)改善患者預(yù)后極為重要。近年來(lái)，多種具有臨床應(yīng)用潛力的AKI標(biāo)志性蛋白逐漸被發(fā)現(xiàn)，如中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL）、β2-微球蛋白（beta2-microglobulin，β2-MG）、胱抑素C（cystatin C，Cys C）、腎損傷分子1（kidney injury molecule 1，KIM-1）、白細(xì)胞介素18（interleukin 18，IL-18）等，但這些指標(biāo)在輔助臨床診斷及指導(dǎo)疾病治療方面尚不成熟。因此，臨床為實(shí)現(xiàn)CIAKI的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和早期干預(yù)，迫切需要尋找早期的、具有較高敏感性和特異性的生物學(xué)標(biāo)志物。

Semaphorin（Sema）3A是Semaphorins家族中的一種分泌型蛋白，與調(diào)節(jié)免疫功能、腫瘤發(fā)生及發(fā)展、器官形成具有密切關(guān)系[2]。Sema 3A在成年人腎臟的遠(yuǎn)曲小管上皮細(xì)胞中表達(dá)[3]，過(guò)度分泌可導(dǎo)致腎小球內(nèi)皮細(xì)胞損傷和基底膜分層，從而引起腎臟損傷[4]。近期有研究結(jié)果顯示，Sema 3A在正常成人尿中通常檢測(cè)不到，但在AKI發(fā)生后可快速檢出，因此Sema 3A可作為AKI的早期預(yù)測(cè)指標(biāo)[5]。目前，Sema 3A對(duì)CIAKI的臨床診斷價(jià)值報(bào)道甚少，國(guó)內(nèi)尚無(wú)這方面的研究。本研究通過(guò)檢測(cè)成人冠狀動(dòng)脈造影及支架植入術(shù)后并發(fā)CIAKI的患者外周血和尿液Sema 3A水平以及β2-MG、Cys C、血清肌酐（serum creatinine，SCr）早期的變化，分析Sema 3A與早期CIAKI之間的關(guān)系，尋找CIAKI最理想的早期生物學(xué)標(biāo)志物。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2015年6月—2016年6月天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院心臟內(nèi)科行冠狀動(dòng)脈造影及支架植入術(shù)患者350例，其中男220例、女130例，年齡31～84歲。記錄患者的年齡、性別、體重指數(shù)（body mass index，BMI）、血紅蛋白（hemoglobin，Hb）、糖化血紅蛋白（glycated hemoglobin A1c，HbA1c）、空腹血糖（fasting plasma glucose，F(xiàn)PG）、B型鈉尿肽（B-type natriuretic peptide，BNP）、左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）、SCr、β2-MG、Cys C的手術(shù)前基礎(chǔ)值，是否合并高血壓或糖尿病以及冠狀動(dòng)脈造影及介入手術(shù)后的住院時(shí)間、是否透析和發(fā)生死亡等情況。

CIAKI的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照歐洲泌尿生殖放射協(xié)會(huì)（European Society of Urogenital Radiology，ESUR）2003年制定的標(biāo)準(zhǔn)[6]：與基線值相比，接觸對(duì)比劑后72 h內(nèi)SCr相對(duì)值升高25%或絕對(duì)值升高44.2 μmol/L（0.5 mg/dL），并除外其他可能的原因。所有患者術(shù)前腎功能均正常，基礎(chǔ)肌酐清除率＞100 mL/（min·1.73 m2）（采用Schwartz公式計(jì)算）。為減少術(shù)后循環(huán)損耗和腎前氮質(zhì)血癥的影響，所有受試者應(yīng)在第1次手術(shù)后24 h內(nèi)補(bǔ)充損耗液體的80%，直至100%。根據(jù)CIAKI診斷標(biāo)準(zhǔn)將350例患者分為CIAKI組46例、非CIAKI組304例。

排除標(biāo)準(zhǔn)：碘過(guò)敏者、急慢性感染者、近期發(fā)生急性腎功能衰竭者、SCr＞300 μmol/L的慢性腎功能不全者、處于血液透析治療中的患者、惡性腫瘤患者、最近1周接受過(guò)造影劑檢查以及順應(yīng)性差者、之前服用過(guò)腎臟毒性藥物和尿液收集不完整者。

1.2 樣本采集與檢測(cè)

收集所有患者術(shù)前及術(shù)后6、12、24、48、72 h的血液和尿液樣本。采用促凝劑/分離膠黃帽真空采血管一次性抽取患者血液3～5 mL，以1 260×g離心5 min，分離血清，儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱。留取患者中段清潔尿10 mL，以560×g離心5 min，取上清分裝。檢測(cè)前將樣本恢復(fù)至室溫，完全融化、復(fù)溫、混合均勻。

1.3 儀器與試劑

NORMAN系列散射比濁分析儀（南京諾爾曼生物技術(shù)有限公司）、BS2000M全自動(dòng)生化分析儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）。β2-MG及Cr試劑盒購(gòu)自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，Cys C試劑盒購(gòu)自北京九強(qiáng)生物技術(shù)股份有限公司。Sema 3A試劑盒購(gòu)自天津信睿生物科技有限公司。

1.4 血清、尿液Sema 3A水平檢測(cè)

采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)患者血清和尿液Sema 3A水平。嚴(yán)格按試劑說(shuō)明書(shū)操作。為排除尿液稀釋對(duì)Sema 3A水平的影響，采用尿液肌酐（urinary creatinine，UCr）矯正Sema 3A檢測(cè)結(jié)果，最終結(jié)果以Sema 3A/UCr比值表示，單位為pg/μmol Cr。ELISA試劑盒的最低檢出率為0.57 ng/ mL，檢測(cè)范圍為1.563～100.000 ng/mL，變異系數(shù)為6.8 %。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以表示。2個(gè)組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素ANOVA分析。呈非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25～P75）]表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評(píng)估各項(xiàng)目診斷CIAKI的價(jià)值。采用Spearman相關(guān)分析評(píng)估不同時(shí)間點(diǎn)的尿液Sema 3A水平與臨床表現(xiàn)（SCr百分比變化、手術(shù)后住院時(shí)間和AKI持續(xù)時(shí)間）的相關(guān)性。采用Logistic回歸分析評(píng)估AKI的預(yù)測(cè)因子，潛在獨(dú)立預(yù)測(cè)變量包括最佳檢出時(shí)間的尿液Sema 3A水平、年齡、性別、心臟手術(shù)和住院時(shí)間。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象一般臨床資料比較

350例患者中有46例患者術(shù)后發(fā)生CIAKI，發(fā)生率為13.1%。住院期間CIAKI組發(fā)生死亡1例（男性）。CIAKI組性別比例、糖尿病和住院時(shí)間與非CIAKI組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其他項(xiàng)目差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。患者一般情況見(jiàn)表1。

2.2 CIAKI患者血清SCr、β2-MG、Cys C水平及血清、尿液Sema 3A水平的變化

與術(shù)前基礎(chǔ)值比較，CIAKI組SCr、β2-MG、Cys C、血清Sema 3A水平均有不同程度的升高（P＜0.05），于術(shù)后48 h達(dá)到最高值。CIAKI組24和48 h的SCr、β2-MG、Cys C、血清Sema 3A水平明顯高于非CIAKI組（P＜0.05）。CIAKI組尿液Sema 3A在手術(shù)后6 h明顯升高（P＜0.05），而術(shù)后12 h后則明顯降低（P＜0.05）。非CIAKI組尿液Sema 3A僅有短暫、較小幅度的升高，手術(shù)12 h后保持在基線水平。見(jiàn)表2～表 6、圖1。

表1 研究對(duì)象一般臨床資料比較

表2 CIAKI組和非CIAKI組術(shù)前及術(shù)后血清SCr的變化 （μmol/L，）

表2 CIAKI組和非CIAKI組術(shù)前及術(shù)后血清SCr的變化 （μmol/L，）

注：與非CIAKI組比較，*P＜0.05；與同組術(shù)前基礎(chǔ)值比較，#P＜0.05

組別 例數(shù) 術(shù)前基礎(chǔ)值 術(shù)后6 h 12 h 24 h 48 h 72 h CIAKI組 46 53.11±10.30 56.88±12.45 58.71±11.63 68.11±13.24*# 72.53±12.10*#67.11±11.04*#非CIAKI組 304 57.22±11.90 54.62±10.01 56.35±12.11 54.16±10.58 55.54±12.42 50.90±11.21

表3 CIAKI組和非CIAKI組術(shù)前及術(shù)后血清β2-MG的變化 （mg/L，）

表3 CIAKI組和非CIAKI組術(shù)前及術(shù)后血清β2-MG的變化 （mg/L，）

注：與非CIAKI組比較，*P＜0.05；與同組術(shù)前基礎(chǔ)值比較，#P＜0.05；與同組術(shù)后6 h比較，△P＜0.05；與同組術(shù)后12 h比較，▲P＜0.05

組別 例數(shù) 術(shù)前基礎(chǔ)值 術(shù)后6 h 12 h 24 h 48 h 72 h CIAKI組 46 1.59±0.71 1.52±0.68 1.62±0.87 1.82±0.74*# 2.13±0.50*#△▲ 1.55±0.62非CIAKI組 304 1.54±0.74 1.51±0.63 1.55±0.44 1.49±0.74 1.49±0.85 1.50±0.76

表4 CIAKI組和非CIAKI組術(shù)前及術(shù)后血清Cys C的變化 （mg/L，）

表4 CIAKI組和非CIAKI組術(shù)前及術(shù)后血清Cys C的變化 （mg/L，）

注：與非CIAKI組比較，*P＜0.05；與同組術(shù)前基礎(chǔ)值比較，#P＜0.05

組別 例數(shù) 術(shù)前基礎(chǔ)值 術(shù)后6 h 12 h 24 h 48 h 72 h CIAKI組 46 0.53±0.35 0.51±0.41 0.51±0.37 0.75±0.32*# 0.83±0.19*# 0.76±0.21*#非CIAKI組 304 0.57±0.51 0.56±0.23 0.49±0.31 0.58±0.45 0.54±0.11 0.57±0.33

表5 CIAKI組和非CIAKI組術(shù)前及術(shù)后血清Sema 3A的變化 [ng/mL，M（P25～P75）]

表6 CIAKI組和非CIAKI組術(shù)前及術(shù)后尿液Sema A的變化 （pg/μmol Cr，）

表6 CIAKI組和非CIAKI組術(shù)前及術(shù)后尿液Sema A的變化 （pg/μmol Cr，）

注：與非CIAKI組比較，*P＜0.05；與同組術(shù)前基礎(chǔ)值比較，#P＜0.05

組別 例數(shù) 術(shù)前基礎(chǔ)值 術(shù)后6 h 12 h 24 h 48 h 72 h CIAKI組 46 35.0±5.1 293.8±25.3*# 158.2±17.3*# 67.8±6.6*# 56.5±5.9 46.0±4.5非CIAKI組 304 34.8±4.3 51.9±6.5 33.9±4.5 27.1±2.4 27.9±2.3 30.2±2.5

圖1 心臟造影術(shù)后患者血清、尿液Sema 3A變化

2.3 尿液Sema 3A與CIAKI的相關(guān)性分析

單因素Logistic回歸分析顯示男性（P=0.023 0）、住院時(shí)間較長(zhǎng)（P=0.000 7）及術(shù)后6 h（P=0.002 5）、12 h（P=0.003 8）、24 h（P=0.008 6）的高尿Sema 3A水平與CIAKI發(fā)病相關(guān)。進(jìn)一步行逐步Logistic回歸分析，以年齡、性別、住院時(shí)間、尿Sema 3A最佳檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)（術(shù)后6 h）為變量預(yù)測(cè)CIAKI，隊(duì)列模型顯示性別、術(shù)后6 h 尿Sema 3A水平是獨(dú)立預(yù)測(cè)CIAKI的指標(biāo)。

對(duì)尿液Sema 3A與CIAKI患者臨床指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，術(shù)前尿液Sema 3A水平與年齡、術(shù)后SCr變化和AKI持續(xù)時(shí)間呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。術(shù)后6 h和12 h的高尿液Sema 3A水平與SCr升高及住院時(shí)間、AKI持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)明顯相關(guān)（P＜0.01）。而尿液Sema 3A水平與手術(shù)后48 h年齡、術(shù)后SCr變化、住院時(shí)間、AKI持續(xù)時(shí)間無(wú)相關(guān)性。見(jiàn)表7。

表7 尿液Sema 3A與臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析

2.4 尿液Sema 3A與各項(xiàng)指標(biāo)診斷CIAKI的性能評(píng)價(jià)

ROC曲線分析顯示，SCr、β2-MG、Cys C術(shù)后48 h診斷CIAKI的AUC[95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）]分別為0.821（0.542～0.963）、0.750（0.454～0.901）、0.839（0.593～0.965）。確定3種生物標(biāo)志物的最佳診斷時(shí)間點(diǎn)為術(shù)后48 h，其中Cys C診斷性能最佳。

繪制尿液Sema 3A診斷CIAKI的ROC曲線并計(jì)算曲線下面積（area under curve，AUC）。6、12 h尿液Sema 3A的AUC分別為0.856（P＜0.000 1）和0.732（P=0.000 9），高于β2-MG、Cys C、SCr的AUC。尿液Sema 3A 24 h時(shí)的診斷性能稍低于血清Sema 3A。比較各時(shí)間點(diǎn)不同標(biāo)志物的AUC和P值的預(yù)測(cè)模型，結(jié)果顯示術(shù)后6 h的尿液Sema 3A的診斷性能最佳。

患者術(shù)后血清SCr、β2-MG、Cys C及血清、尿液Sema 3A的診斷性能見(jiàn)表8。術(shù)后尿液Sema 3A的ROC曲線分析見(jiàn)圖2。

表8 Sema 3A、SCr、β2-MG、Cys C診斷CIAKI的性能比較

續(xù)表8

圖2 術(shù)后6 h、12 h尿液Sema 3A診斷CIAKI的ROC曲線

進(jìn)一步評(píng)價(jià)術(shù)后6 h尿液Sema 3A診斷CIAKI的最佳臨界值，比較120、245、428 pg/μmol Cr 3個(gè)不同水平的診斷性能，結(jié)果顯示當(dāng)術(shù)后6 h尿液Sema 3A為245 pg/μmol Cr時(shí)診斷性能最優(yōu)，此時(shí)敏感性為84%，特異性為92%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為91%，陰性預(yù)測(cè)值為87%。見(jiàn)表9。

表9 尿液Sema3A術(shù)后6 h診斷性能評(píng)價(jià)

3 討論

CIAKI可導(dǎo)致急性腎衰竭，延長(zhǎng)了患者的住院時(shí)間，增加了不良事件及終末期腎病的發(fā)生率。因此，實(shí)現(xiàn)對(duì)CIAKI的早期診斷，從而控制疾病的發(fā)生發(fā)展、改善患者預(yù)后已成為臨床亟待解決的問(wèn)題。CIAKI的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，還未被完全闡明。目前認(rèn)為，對(duì)比劑引起的腎臟血流動(dòng)力學(xué)變化[7-8]和對(duì)比劑的直接腎小管毒性[6]是CIAKI的主要發(fā)病機(jī)制。Sema 3A是抗血管生成因子，與細(xì)胞遷移相關(guān)。在生理?xiàng)l件下，通過(guò)Sema 3A的受體神經(jīng)纖毛蛋白-1（neuropilin-1，Nrp-1）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2和整合素β3的相互作用來(lái)維持基底膜的完整性；當(dāng)Sema 3A表達(dá)增加時(shí)，與Nrp-1結(jié)合增加，激活叢狀蛋白-A1受體，從而影響毛細(xì)血管袢和腎小球基底膜的形成[4]。Sema 3A可在腎臟發(fā)育和成年人腎臟遠(yuǎn)曲小管上皮細(xì)胞中被檢測(cè)到[7]，且在特定刺激下會(huì)分泌到尿液中，表明Sema 3A在腎臟損傷中發(fā)揮重要作用[9]。腎損傷時(shí)Sema 3A有可能參與了腎小管上皮細(xì)胞的增殖和遷移。有研究結(jié)果顯示，Sema 3A在腎臟發(fā)育和損傷中具有重要作用，可通過(guò)調(diào)控足細(xì)胞分化來(lái)影響腎小球發(fā)育[10]。在藥物刺激或缺氧條件下，Sema 3A自腎遠(yuǎn)曲小管上皮細(xì)胞分泌至尿液中[11]，引起短暫的大量蛋白尿，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。本研究結(jié)果顯示，冠狀動(dòng)脈造影后數(shù)小時(shí)Sema 3A水平明顯升高，很容易從尿液中檢出。CIAKI患者血清、尿液Sema 3A水平在術(shù)后6 h達(dá)到最高，而血清β2-MG、Cys C、SCr則在術(shù)后48～72 h才升高，Sema 3A峰值的出現(xiàn)遠(yuǎn)早于其他AKI標(biāo)志蛋白。由此可見(jiàn)，腎損傷時(shí)尿液Sema 3A可在短時(shí)間內(nèi)升高，可作為早期診斷CIAKI的生物標(biāo)志物。ROC曲線分析顯示，術(shù)后6 h尿液Sema 3A診斷CIAKI的性能最佳，最佳臨界值為245 pg/μmol Cr，敏感性為84%，特異性為92%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為91%，陰性預(yù)測(cè)值為87%。Logistic回歸分析顯示性別、術(shù)后6 h Sema 3A水平是獨(dú)立預(yù)測(cè)CIAKI的指標(biāo)。

綜上所述，本研究結(jié)果證實(shí)Sema 3A可作為CIAKI的早期生物標(biāo)志物，對(duì)CIAKI具有早期診斷價(jià)值，可以幫助臨床盡早對(duì)CIAKI患者實(shí)施干預(yù)，對(duì)降低醫(yī)療費(fèi)用和患者死亡率具有重要的價(jià)值。