朱曉東， 張佳佳， 郭玉婷， 蘭 衛(wèi)

(1新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院， 烏魯木齊 830011； 2烏魯木齊市中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部， 烏魯木齊 830000； 33新疆醫(yī)科大學(xué)克拉瑪依學(xué)院， 新疆 克拉瑪依 834099)

牛舌草為紫草科植物意大利牛舌草(AnchusaitalicaRetiz.)或琉璃苣(BorageofficinalesL.)的地上部分[1],主要含有揮發(fā)油、脂肪酸、三萜類和黃酮類等成分[2],其中，黃酮類化合物包括蕓香苷、異槲皮苷和黃芪苷等，在其新鮮植物體中還分離出抗壞血酸和脫氫抗壞血酸[3]。具有生濕生熱、祛寒補(bǔ)心、潤(rùn)燥消炎等功效，臨床上多用于心腦血管疾病的治療[4]。近年來(lái)，心腦血管疾病是影響人類健康的慢性疾病之一，也逐漸趨于年輕化，除了損害健康以外還會(huì)帶來(lái)諸多的并發(fā)癥，臨床多采用化學(xué)藥物治療，但副作用較大[5]。徐曉娜等研究發(fā)現(xiàn)牛舌草總黃酮具有抗大鼠心肌缺血再灌注損傷的作用并對(duì)機(jī)制進(jìn)行了研究[6]。研究表明，意大利牛舌草不同提取物具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抗病毒和中樞神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用[7-10]。本研究采用立體恒溫灌流系統(tǒng)和壓力換能器研究意大利牛舌草提取物對(duì)大鼠主動(dòng)脈血管的舒張作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性SD大鼠，體質(zhì)量(200±20)g，由新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物使用許可證號(hào)為SCXK(新)2011-0004。

1.2儀器JY96-IIN型超聲提取儀(上海滬析儀器廠)，RE-3000B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，CTHI-100B型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(施都凱儀器設(shè)備上海有限公司)，BL-420型生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)。

1.3試劑乙酰膽堿(美國(guó)sigma公司，批號(hào)20161222，Ach)，去甲腎上腺素(美國(guó)sigma公司，批號(hào)20161222，PE)， Kreb-Henseleit(K-H)液(NaCl 118mmol/L，KCl 4.7 mmol/L，NaHCO325 mmol/L，KH2PO41.2 mmol/L，MgCl21.2 mmol/L,CaCl22.5 mmol/L，glucose 2 g/L， pH 7.4并用雙蒸水定容至1 L)，試劑均為分析純。

1.4藥材意大利牛舌草2017年3月購(gòu)于新疆維吾爾藥業(yè)有限公司(批號(hào)：20161012)，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院資源教研室盛萍教授鑒定為紫草科植物意大利牛舌草(AnchusaitalicaRetiz)的干燥地上部分。

1.5牛舌草提取物的制備方法稱取意大利牛舌草粗粉 0.5 kg置容器中，加入70%乙醇超聲提取3次，每次40 min，過(guò)濾，合并濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，將濃縮液倒入腎形盤中放于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中烘干成浸膏，使用時(shí)配制成所需濃度。

1.6溶液的制備方法

1.6.1 對(duì)照品溶液的制備 將Ach溶于雙蒸水，配制成濃度分別為0.01、0.10、1.00、10.00 μmol/L的溶液。將PE均溶于雙蒸水，配制成濃度為l.0 μmol/L的溶液。

1.6.2 牛舌草提取物溶液的制備 將“1.5”項(xiàng)下牛舌草提取物用1%的DMSO溶液溶解，配制成濃度分別為 1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0 mg/mL的溶液。

1.7大鼠胸主動(dòng)脈血管環(huán)的制備方法將大鼠脫頸處死后，迅速打開胸腔，剪下腎主動(dòng)脈以上的胸主動(dòng)脈，取出后放入已通過(guò)氧氣并置于冰育的K-H液中，輕輕甩動(dòng)將血管中的血液沖出，去除血管上附著的脂肪和結(jié)締組織，將血管環(huán)剪成3 mm長(zhǎng)的血管環(huán)，備用。

1.8血管環(huán)的分組及給藥方法隨機(jī)取部分血管環(huán)，用牙簽插入血管環(huán)內(nèi)部來(lái)回滾動(dòng)，去除血管內(nèi)皮細(xì)胞，此為內(nèi)皮去除組；未去除內(nèi)皮的血管環(huán)稱為內(nèi)皮完整組。將血管環(huán)用2個(gè)三角形不銹鋼金屬絲掛起，置于37℃恒溫浴槽中，持續(xù)通入95%的氧氣和5%的二氧化碳混合氣體。主動(dòng)脈環(huán)的一段連接張力換能器，另一端固定在浴槽中。調(diào)整動(dòng)脈環(huán)靜息負(fù)荷2 g，用BL-420生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)對(duì)血管張力進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)前用60mmol/L的KCl溶液收縮并沖洗2次，收縮活性良好的血管環(huán)用于實(shí)驗(yàn)。

1.9指標(biāo)的測(cè)定方法

1.9.1 血管內(nèi)皮功能的檢測(cè) 血管環(huán)在浴槽中達(dá)到平衡后，加入終濃度為1.0 μmol/L PE孵育血管環(huán)進(jìn)行預(yù)收縮，待收縮達(dá)到穩(wěn)定，用4個(gè)濃度(0.01、0.10、1.00、10.00 μmol/L)的Ach累積加入浴槽舒張血管環(huán)，待Ach引起的血管環(huán)舒張達(dá)到平衡臺(tái)期后，加入1 μmol/L的forskolin 舒張血管環(huán)，待forskolin引起的血管環(huán)舒張為最大舒張狀態(tài)(100%)，舒張率為50%及以上的血管環(huán)為內(nèi)皮完整組，不舒張甚至繼續(xù)收縮的血管環(huán)為內(nèi)皮去除組。

1.9.2 舒張率的測(cè)定 內(nèi)皮完整組和內(nèi)皮去除組更換K-H液平衡45 min(每15 min換液1次)后，加入PE(1 μmol/L)對(duì)血管環(huán)進(jìn)行預(yù)收縮，待收縮穩(wěn)定后，逐步累積加入牛舌草提取物，前一個(gè)劑量達(dá)到平衡后再給下一個(gè)劑量，最后加入1 μmol/L的forskolin至最大舒張。舒張率=(血管環(huán)預(yù)收縮最大張力-不同藥物濃度血管環(huán)的張力)/(血管環(huán)預(yù)收縮最大張力-基礎(chǔ)平衡張力)×100%。

2 結(jié)果

2.1大鼠胸主動(dòng)脈血管環(huán)內(nèi)皮活性檢測(cè)內(nèi)皮完整組的最大舒張率Emax為(77.97%±18.92%)，內(nèi)皮去除組為(12.40%±6.37%)，2組大鼠胸主動(dòng)脈血管環(huán)的內(nèi)皮活性符合實(shí)驗(yàn)要求，均可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，見(jiàn)表1。

2.2意大利牛舌草提取物對(duì)大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)的舒張作用內(nèi)皮完整組的血管舒張率為(15.13%±3.67%～93.82%±5.35%)，意大利牛舌草醇提物濃度范圍在(1.0～11.0)mg/L內(nèi)具有濃度-劑量效應(yīng)，內(nèi)皮去除組與內(nèi)皮完整組的血管舒張變化情況一致。內(nèi)皮完整組和內(nèi)皮去除組的Emax分別為(93.82%±5.35%)和(91.54%±5.00%)，內(nèi)皮完整組和內(nèi)皮去除組的血管舒張作用比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表1 Ach對(duì)PE預(yù)收縮的主動(dòng)脈環(huán)的舒張作用/%

表2 牛舌草醇提物對(duì)PE預(yù)收縮的主動(dòng)脈環(huán)的舒張作用/%

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)大鼠離體主動(dòng)脈環(huán)來(lái)檢測(cè)意大利牛舌草提取物的舒張血管作用。血管平滑肌的收縮狀態(tài)決定血管腔的大小，血管平滑肌的緊張程度異常增大可以參與血管性疾病的發(fā)生機(jī)制，因此，意大利牛舌草提取物具有舒張血管作用的化合物或中藥提取物對(duì)心腦血管等一系列疾病具有積極的作用。研究表明，血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)血管平滑肌的舒張起著非常重要的作用，當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放一些一氧化氮(NO)、前列腺素、超極化因子(EDHF)等從而使血管達(dá)到舒張的作用[11]。而PE誘導(dǎo)的血管收縮主要作用在α-腎上腺受體，從而激活磷脂酶C，產(chǎn)生三磷酸肌醇，刺激平滑肌細(xì)胞內(nèi)貯鈣的釋放，同時(shí)也可激活細(xì)胞膜上的操縱性鈣通道(ROC)和磷酸化電壓依賴性鈣通道使細(xì)胞外鈣內(nèi)流而達(dá)到血管收縮的作用[12-13]。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，意大利牛舌草對(duì)血管具的舒張作用，但對(duì)于內(nèi)皮完整組和內(nèi)皮去除組并無(wú)性差異，表明牛舌草提取物誘導(dǎo)的舒張作用無(wú)內(nèi)皮依賴性，可能是抑制了細(xì)胞內(nèi)鈣的釋放和細(xì)胞外鈣的內(nèi)流，引起血管環(huán)舒張，從而產(chǎn)生血管舒張的作用，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。