張麗娟, 湯興娥, 姚美琪, 劉 怡, 趙翡翠
(新疆醫(yī)科大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院, 烏魯木齊 830000)
準(zhǔn)噶爾烏頭(AconitumsoongoricumStapf.)為毛莨科植物烏頭的干燥塊根[1],主要分布于我國(guó)新疆伊犁地區(qū)和阿勒泰地區(qū),生長(zhǎng)在海拔 1 800~2 600 m的山地草地和陽(yáng)坡[2],其主要的化學(xué)成分為烏頭堿、雪上一枝蒿乙素、3-脫氧烏頭堿等生物堿[3-5],具有散風(fēng)寒、除濕、止痛等功效,臨床上多用于風(fēng)濕類疾病的治療[6]。本課題組前期研究表明新疆準(zhǔn)噶爾烏頭的根中含有準(zhǔn)噶爾烏頭堿、烏頭堿 、苯甲酰烏頭原堿等化學(xué)成分[7-8]。本研究采用Cell Counting Kit-8(CCK8)法檢測(cè)對(duì)細(xì)胞增殖抑制的作用、乳酸脫氫酶(LDH)漏出率評(píng)價(jià)細(xì)胞毒性、流式細(xì)胞術(shù)法檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況,評(píng)價(jià)準(zhǔn)噶爾烏頭對(duì)H9c2細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用,現(xiàn)報(bào)道如下。
1.1細(xì)胞H9c2細(xì)胞(江蘇凱基生物有限公司,批號(hào)JN-3317)。
1.2儀器Smart CeLL HF-90型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(上海力康儀器有限公司),HF1200LC型生物安全柜(上海力康儀器有限公司),TGL-16GB型臺(tái)式低速離心機(jī)(上海飛鴿儀器有限公司),DNP-9272型恒溫箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司),DHG 型恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司),EcLipse TS100-F型熒光倒置顯微鏡(日本尼康公司),xMarkTM型酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司),DK-80型恒溫水浴鍋(上海精宏儀器廠),YDS-50-125型液氮罐(成都金鳳儀器廠),BCD-249LCK型-20℃低溫冰箱(合肥美菱公司), DW-HL388型-80℃低溫冰箱(合肥美菱公司),Research pLus型手動(dòng)單道移液器(德國(guó)Eppendorf公司)。
1.3試藥胎牛血清(FBS,上海依科賽生物公司,批號(hào)FND500),RPMI1640培養(yǎng)基(美國(guó)GIBCO公司,批號(hào)C11875500BT),0.25%胰酶(法國(guó)SANOFI-AVENTIS公司,批號(hào)SC40020)(美國(guó)GIBCO公司,批號(hào)25200-056),PBS磷酸鹽緩沖液粉劑(北京中杉金橋生物公司,批號(hào)ZLI-9062),LDH檢測(cè)試劑盒(普利萊基因技術(shù)有限公司,批號(hào) CK12),青霉素-鏈霉素雙抗(美國(guó)GIBCO公司,批號(hào)SC30010),CCK8試劑(北京全式金生物公司,批號(hào)FC101-03),DMSO(美國(guó)SIGMA公司,批號(hào)D2650),烏頭堿(成都曼斯特生物技術(shù)有限公司,批號(hào)A019),準(zhǔn)噶爾烏堿、12-表-歐烏堿為實(shí)驗(yàn)室自制。
1.4方法
1.4.1 溶液的制備方法 吸取FBS 5 mL,加入青霉素-鏈霉素溶液5 μL,用RPMI 1640培養(yǎng)基定容至50 mL,混勻即得10%FBS完全培養(yǎng)液,4℃保存,備用。分別量取RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、DMSO按(6∶3∶1)混勻,即得凍存液。按照說(shuō)明書(shū)配制10% CCK-8溶液。稱取準(zhǔn)噶爾烏頭堿、烏頭堿、12-表歐烏頭堿適量,配制成終濃度為200 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,后續(xù)不同濃度的溶液通過(guò)稀釋獲得。
1.4.2 H9c2細(xì)胞的培養(yǎng)方法 取H9c2細(xì)胞用含10%FBS和1%青-鏈霉素溶液的RPMI 1640培養(yǎng)基于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng),鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)密度,更換培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng),待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后(細(xì)胞密度約占10 cm2培養(yǎng)皿面積的80%~90%)進(jìn)行傳代。超凈臺(tái)預(yù)先用紫外燈照射30 min,操作過(guò)程均保證無(wú)菌。用移液器吸棄培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液,用無(wú)菌PBS溶液沖洗細(xì)胞3次后棄去,加入500 μL胰蛋白酶消化,室溫放置3 min于倒置顯微鏡下觀察,輕晃培養(yǎng)皿如有細(xì)胞脫落,加入2 mL完全培養(yǎng)基終止消化,輕輕吹打使細(xì)胞完全脫落,放置離心管中1 000 r/min離心3 min,棄上清液,細(xì)胞懸液用完全培養(yǎng)基重懸,平均加于2個(gè)培養(yǎng)皿中,每個(gè)培養(yǎng)皿加入完全培養(yǎng)液8 mL,置于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)后換液,根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)及密度定期進(jìn)行換液或傳代,計(jì)數(shù)接種于不同種類孔板,加藥處理。
1.4.3 3種烏頭堿對(duì)H9c2細(xì)胞增殖抑制率的測(cè)定方法 將H9c2細(xì)胞按“1.4.2”項(xiàng)下培養(yǎng)方法計(jì)數(shù)接種于96孔板中(100 μL/孔,即每孔2×105個(gè)細(xì)胞/孔),每孔加入完全培養(yǎng)基0.1 mL,37℃ 、5% CO2培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng),棄上清液,考察不同藥物濃度(烏頭堿150、250、400、500、1 000 μg/mL,準(zhǔn)噶爾烏頭堿100、250、400、600、800、1 000 μg/mL,12-表-歐烏堿100.0、400.0、600.0、800、1 000 μg/mL)的細(xì)胞抑制率,每組平行6次,藥物作用24 h后,每孔加入10% CCK-8溶液20 μL,37℃培養(yǎng)2 h,用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處各組細(xì)胞的吸光度A450,計(jì)算細(xì)胞抑制率??瞻捉M細(xì)胞抑制率為0,其他各組細(xì)胞抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組A450/對(duì)照組A450)×100%。
1.4.4 3種烏頭堿對(duì)H9c2細(xì)胞毒性作用的測(cè)定方法 將H9c2細(xì)胞按“1.4.2”項(xiàng)下方法培養(yǎng),計(jì)數(shù)接種于96孔板中(100 μL/孔,即每孔2×105個(gè)細(xì)胞/孔),實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組(10%FBS 100 μL/孔),實(shí)驗(yàn)組(烏頭堿組100、400、500 μg/mL,準(zhǔn)噶爾烏頭堿組100、400、800 μg/mL, 12-表歐烏頭堿組100、400、800 μg/mL)。每孔加入10%FBS 100 μL, 37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng),吸去培養(yǎng)液,用PBS洗滌1次,加入完全培養(yǎng)液,進(jìn)行藥物處理。各組細(xì)胞經(jīng)給藥后嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,計(jì)算細(xì)胞培養(yǎng)液LDH漏出率[細(xì)胞培養(yǎng)液LDH漏出率(%)=培養(yǎng)液LDH總活性/(培養(yǎng)液LDH總活性+細(xì)胞勻漿液LDH總活性)×100%,式中培養(yǎng)液LDH總活性=培養(yǎng)液LDH活性×培養(yǎng)液的體積;細(xì)胞勻漿液LDH總活性=細(xì)胞勻漿液LDH活性×細(xì)胞勻漿液蛋白含量×細(xì)胞勻漿液LDH體積]。
1.4.5 3種生物堿對(duì)H9c2細(xì)胞凋亡的測(cè)定方法 將H9c2細(xì)胞按 “1.4.2”項(xiàng)下方法培養(yǎng),計(jì)數(shù)接種于96孔板中(100 μL/孔,即每孔2×105個(gè)細(xì)胞/孔),分為空白對(duì)照組(10%FBS 100 μL/孔),實(shí)驗(yàn)組(烏頭堿組100、400、500 μg/mL, 準(zhǔn)噶爾烏頭堿組100、600、800 μg/mL, 12-表歐烏頭堿組100、400、1 000 μg/mL),每孔加入10%FBS 100 μL,37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng),吸去培養(yǎng)液,用PBS洗滌1次,用胰酶消化細(xì)胞,1 000 r/min離心5 min,棄上清液,收集細(xì)胞,PBS緩沖液輕懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。 取1×104個(gè)細(xì)胞,1 000 r/min離心5 min,棄掉上清液,加入200 μL Annexin V-FITC結(jié)合液輕懸細(xì)胞,再加入5 μL Annexin V-FITC,輕輕混勻,室溫下避光孵育15 min,1 000 r/min離心5 min,棄掉上清液,加入200 mL Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞,然后加入10 μL PI染色液,混勻,避光孵育5 min。細(xì)胞懸液用200目篩網(wǎng)過(guò)濾,流式細(xì)胞儀檢測(cè),激發(fā)波長(zhǎng)488 nm,發(fā)射波長(zhǎng)530 nm, Annexin V-FITC的綠色熒光通過(guò)FITC通道(FL1)檢測(cè),PI的紅色熒光通過(guò)PI通道(FL2)檢測(cè)。使用未經(jīng)凋亡誘導(dǎo)處理的正常細(xì)胞作為對(duì)照進(jìn)行熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)去除光譜重疊和設(shè)定十字門的位置,計(jì)算細(xì)胞凋亡率。
2.13種生物堿對(duì)H9c2細(xì)胞的抑制作用結(jié)果與空白對(duì)照組比較(濃度為0),實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞體積變小,隨著時(shí)間推移細(xì)胞皺縮成橢圓形、球形或其它不規(guī)則形狀,細(xì)胞胞體的折光性下降,細(xì)胞胞漿內(nèi)黑褐色沉積斑點(diǎn)增多。藥物干預(yù)24 h后,細(xì)胞隨藥物濃度的增加逐漸出現(xiàn)死亡脫壁現(xiàn)象,顯微鏡視野中多見(jiàn)無(wú)核的細(xì)胞殘片(見(jiàn)圖1-3)。 與空白對(duì)照組比較,烏頭堿組、準(zhǔn)噶爾烏頭堿組、12-表-歐烏堿組對(duì)H9c2細(xì)胞的抑制率隨著藥物濃度的增大而升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。烏頭堿組、準(zhǔn)噶爾烏頭堿組、12-表-歐烏堿組IC50值分別為 562.06、726.80、766.11 μg/mL,見(jiàn)表1。
A: 正常對(duì)照組 B: 烏頭堿低劑量組 C: 烏頭堿中劑量組 D: 烏頭堿高劑量組
A: 正常對(duì)照組 B: 烏頭堿低劑量組 C: 12-表-歐烏堿中劑量組 D: 烏頭堿高劑量組
A: 正常對(duì)照組 B: 烏頭堿低劑量組 C: 準(zhǔn)噶爾烏頭堿中劑量組 D: 烏頭堿高劑量組
表1 不同濃度烏頭堿、準(zhǔn)噶爾烏頭堿、12-表-歐烏堿對(duì)H9c2細(xì)胞增殖抑制結(jié)果
注:與空白對(duì)照組比較,*P<0.05。
2.23種生物堿的乳酸脫氫酶(LDH)漏出率實(shí)驗(yàn)結(jié)果與空白組比較,烏頭堿組、準(zhǔn)噶爾烏頭堿組、12-表-歐烏堿組對(duì)H9c2細(xì)胞的細(xì)胞LDH漏出率均隨著濃度的增大而升高,且呈一定的劑量依賴性,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表2。
表2 LDH法評(píng)價(jià)不同濃度烏頭堿、準(zhǔn)噶爾烏頭堿、12-表歐烏堿對(duì)H9c2細(xì)胞的毒性結(jié)果
注: 與空白對(duì)照組比較,*P<0.05。
2.33種生物堿的流式細(xì)胞術(shù)凋亡實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與空白對(duì)照組比較(濃度為0),在烏頭堿濃度為400 μg/mL、12-表-歐烏堿濃度為400 μg/mL、準(zhǔn)噶爾烏頭堿濃度為600 μg/mL以上時(shí),細(xì)胞的凋亡差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。
表3 不同濃度烏頭堿、準(zhǔn)噶爾烏頭堿、12-表-歐烏堿流式細(xì)胞術(shù)凋亡實(shí)驗(yàn)的結(jié)果
注:與空白組比較,△P<0.05。
研究發(fā)現(xiàn)天然藥物具有預(yù)防和治療腫瘤的作用,天然藥物已成為最重要的抗腫瘤藥物來(lái)源[9-10]。與人體正常組織細(xì)胞相比,腫瘤細(xì)胞在形態(tài)、組織結(jié)構(gòu)上都有不同程度的差異[11-15]。目前對(duì)準(zhǔn)噶爾烏頭的化學(xué)成分與藥理作用的研究較少,研究方向主要集中在研究其粗提物的藥理活性等方面,對(duì)其單體化合物的研究較少。本研究通過(guò)對(duì)大鼠心肌細(xì)胞(H9c2細(xì)胞)的細(xì)胞毒性研究發(fā)現(xiàn),新疆準(zhǔn)噶爾烏頭中準(zhǔn)噶爾烏頭堿、烏頭堿與12-表-歐烏堿這3種生物堿對(duì)H9c2細(xì)胞的增殖具有抑制和促凋亡作用,為抗腫瘤藥物提供了心臟毒性安全性參考資料。
新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)2018年11期