高學(xué)忠 袁惠玲 吳麗華

(東莞市人民醫(yī)院乳腺科，廣東 東莞 523000)

乳腺癌發(fā)生于乳腺上皮組織，是一種主要發(fā)生于女性的惡性腫瘤，乳腺癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，加上乳腺癌具有早期癥狀不明顯、發(fā)展速度快等特點(diǎn)〔1，2〕。乳腺癌的發(fā)生同基因的異常表達(dá)有關(guān)，這些異常表達(dá)的基因能夠通過影響乳腺癌細(xì)胞的多種生物學(xué)特性影響腫瘤的發(fā)生〔3〕。E盒鋅指結(jié)合蛋白(ZEB)1是一種鋅指類蛋白轉(zhuǎn)錄的調(diào)控因子，最初在鼠的肢體、脊髓等組織中發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)異常后可以引起較為嚴(yán)重的胚胎畸形〔4，5〕。ZEB1在腫瘤組織中的表達(dá)水平普遍較高，并且與腫瘤的惡性程度有關(guān)，之前的研究報(bào)道顯示，ZEB1沉默具有抑制結(jié)腸癌、肝癌等細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡的作用，而對于沉默ZEB1在乳腺癌細(xì)胞增殖凋亡中的作用尚不明確〔6，7〕。本研究用乳腺癌細(xì)胞作為研究對象，通過siRNA下調(diào)乳腺癌細(xì)胞中ZEB1的表達(dá)，探討沉默ZEB1對乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1材料 乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231購自美國ATCC；慢病毒LV-ZEB1-siRNA和LV-siRNA control由吉滿生物科技(上海)有限公司構(gòu)建；RNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；cDNA合成試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司；ZEB1抗體、激活型Caspase-3(酶切Caspase-3)抗體、細(xì)胞周期素(cyclin)E抗體均購自美國CTS；p27抗體、細(xì)胞色素(Cytochrome)C抗體均購自美國Abcam；胞質(zhì)蛋白提取試劑盒、線粒體蛋白提取試劑盒均購自美國Thermo。

1.2細(xì)胞分組 MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)期以后，接種到12孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，細(xì)胞培養(yǎng)液密度為1×105個/ml，細(xì)胞匯合度為40%時，進(jìn)行慢病毒感染。用含有455 μl培養(yǎng)基、100 μg/ml的polybrene、1×108TU/ml的病毒液20 μl均勻混合后，添加到用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后的上述細(xì)胞中，感染后10 h進(jìn)行換液，培養(yǎng)3 d后，觀察熒光表達(dá)情況，感染效率高于90%，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。把感染慢病毒LV-ZEB1-siRNA和LV-siRNA control的細(xì)胞分為ZEB1 siRNA組和siRNA control組，把沒有感染的細(xì)胞作為Control組。取上述細(xì)胞，以熒光定量PCR和Western印跡檢測沉默效果。

1.3熒光定量PCR檢測沉默效果 Control組、siRNA control組、ZEB1 siRNA組細(xì)胞按照每107個細(xì)胞加入1 ml的Trizol溶液裂解細(xì)胞以后，按照常規(guī)方法提取細(xì)胞中的總RNA，RNA用無RNase的水溶解后，置于-80℃保存。移液槍吸取2 μl RNA樣品，以紫外分光光度計(jì)測定A260/A280的比值在1.8～2.0之間。每組樣品吸取2 μg的RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，步驟同cDNA合成試劑盒，cDNA保存在-20℃。取各組cDNA，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，配制25 μl體系，包含cDNA 1 μl、1 μl的10 μmol/L上下游引物、12.5 μl的2×SYBR Green Supermix。PCR儀程序?yàn)椋?5℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，40個循環(huán)。β-actin作為內(nèi)參，以Step One分析擴(kuò)增產(chǎn)物的Ct值，計(jì)算ZEB1水平。引物如下：β-actin-上游引物5′-GAGGAGGAGGAGAAGGAAT-3′，下游引物5′-AGCCAGTAGTAGCCAACA-3′。ZEB1上游引物5′-GGCAGAGAATGAGGGAGAAG-3′，下游引物5′-CTTCAGACACTTGCTCACTACTC-3′。

1.4Western印跡檢測沉默效果 Control組、siRNA control組、ZEB1 siRNA組細(xì)胞中加入蛋白裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1)，放在冰上充分裂解約30 min，收集上清，用聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白定量試劑盒對蛋白定量。將蛋白同十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)上樣緩沖液在100℃孵育5 min后，在每個上樣孔中加入20 μg的蛋白樣品。蛋白凝膠用10%分離膠和5%的濃縮膠進(jìn)行電泳，蛋白樣品在濃縮膠中以70 V電壓進(jìn)行電泳，以100 V電壓在分離膠中電泳，肉眼觀察染料跑出凝膠之后終止電泳。取出凝膠，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜條件為：100 mA，4℃，此時蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移至NC膜上。取NC膜，進(jìn)行抗體孵育，NC膜置于含有5%牛血清白蛋白封閉液的平皿中，置于室溫條件下孵育1 h，再將NC膜置于含有1∶800稀釋的抗ZEB1抗體中，在4℃中結(jié)合反應(yīng)12 h，再同辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(1∶3 000稀釋)置于室溫中結(jié)合孵育2 h。電化學(xué)發(fā)光(ECL)法發(fā)光以后，曝光。對各蛋白條帶進(jìn)行灰度值掃描，β-actin為參照，用各組目的條帶的灰度值與β-actin灰度值的比值表示目的蛋白水平。

1.5MTT法檢測細(xì)胞增殖能力 Control組、siRNA control組、ZEB1 siRNA組細(xì)胞接種到96孔板，分別在培養(yǎng)1 d、2 d、3 d、4 d后各取出一個培養(yǎng)板，進(jìn)行MTT檢測。MTT方法為：按照每個孔內(nèi)加入20 μl的MTT，放在37℃的培養(yǎng)箱中孵育結(jié)合4 h，把培養(yǎng)板取出后，按照每個孔中加入150 μl的二甲基亞砜(DMSO)，在震蕩儀上反應(yīng)10 min，再放置于酶標(biāo)儀上，檢測波長490 nm的A值，用不加入細(xì)胞的孔調(diào)零。

1.6流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 Control組、siRNA control組、ZEB1 siRNA組細(xì)胞以0.25%的胰酶消化后，用PBS洗滌，加入用PBS配制的75%的乙醇，放在4℃條件中孵育過夜。收集細(xì)胞，加入RNaseA酶，添加50 μg/ml的PI染液，混合后，放在4℃孵育結(jié)合，300目濾網(wǎng)過濾以后，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期變化。

1.7流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 Control組、siRNA control組、ZEB1 siRNA組細(xì)胞以0.25%的胰酶消化后，制成單細(xì)胞懸浮液，細(xì)胞密度為每毫升含有106個細(xì)胞，1 000 r/min離心10 min，用PBS將細(xì)胞沉淀懸浮洗滌2次，加入200 μl的Annexin V-FITC結(jié)合緩沖液將細(xì)胞懸浮，分別添加各5 μl的Annexin V-FITC和PI染液，以流式細(xì)胞儀測定每組乳腺癌細(xì)胞的凋亡情況。

1.8Western印跡檢測細(xì)胞中酶切Caspase-3、cyclin E、p27和線粒體、胞質(zhì)中CytochromeC蛋白水平 Control組、siRNA control組、ZEB1 siRNA組細(xì)胞按照1.4中Western印跡方法檢測細(xì)胞中酶切Caspase-3、cyclin E、p27蛋白水平，同時以Western印跡方法檢測線粒體、胞質(zhì)中CytochromeC蛋白水平，線粒體和胞質(zhì)蛋白提取參照線粒體、胞質(zhì)蛋白提取試劑盒。酶切Caspase-3、cyclin E、p27蛋白表達(dá)水平以β-actin作為參照，線粒體中CytochromeC蛋白水平以VDAC1為內(nèi)參，胞質(zhì)中CytochromeC蛋白水平以β-actin為內(nèi)參。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1成功構(gòu)建沉默ZEB1的乳腺癌細(xì)胞 如圖1和表1中所示，乳腺癌細(xì)胞感染慢病毒LV-ZEB1-siRNA后，細(xì)胞中ZEB1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯降低，說明構(gòu)建了沉默ZEB1的乳腺癌細(xì)胞，為后續(xù)研究提供了條件。

2.2沉默ZEB1可明顯降低乳腺癌細(xì)胞增殖能力 表2所示，沉默ZEB1后的乳腺癌細(xì)胞A490值明顯降低，提示沉默ZEB1可以下調(diào)乳腺癌細(xì)胞的增殖能力。

圖1 Western印跡測定穩(wěn)定感染慢病毒LV-ZEB1-siRNA后細(xì)胞中ZEB1蛋白水平

表1 乳腺癌細(xì)胞中ZEB1 mRNA和蛋白表達(dá)水平變化

與Control組比較：1)P<0.05，下表同

表2 沉默ZEB1后的乳腺癌細(xì)胞A490值變化

圖2 Western印跡檢測沉默ZEB1后的乳腺癌細(xì)胞中cyclinE、p27蛋白水平

2.3沉默ZEB1可阻礙乳腺癌細(xì)胞從G0/G1向S期進(jìn)展 如圖2和表3中所示，沉默ZEB1后的乳腺癌細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例明顯升高，同時細(xì)胞中cyclinE蛋白水平降低，p27蛋白水平升高，說明沉默ZEB1可以誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞周期阻滯。

表3 沉默ZEB1后的乳腺癌細(xì)胞周期分布和cyclinE、p27蛋白水平變化

2.4沉默ZEB1可明顯促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡 如圖3和表4中所示，沉默ZEB1后的乳腺癌細(xì)胞凋亡率明顯升高，同時細(xì)胞中酶切Caspase-3蛋白水平升高，說明沉默ZEB1可以誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡發(fā)生。

2.5沉默ZEB1促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞線粒體釋放CytochromeC 如圖4和表5中所示，沉默ZEB1后的乳腺癌細(xì)胞胞質(zhì)中CytochromeC水平明顯升高，線粒體中CytochromeC水平明顯降低，說明沉默ZEB1可以促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞線粒體釋放CytochromeC。

圖3 Western印跡測定沉默ZEB1后乳腺癌細(xì)胞中酶切Caspase-3蛋白水平

表4 沉默ZEB1后的乳腺癌細(xì)胞凋亡率和酶切Caspase-3蛋白水平變化

圖4 Western印跡檢測沉默ZEB1的乳腺癌細(xì)胞線粒體和胞質(zhì)中CytochromeC蛋白變化

表5 沉默ZEB1后的乳腺癌細(xì)胞線粒體和胞質(zhì)中CytochromeC蛋白變化

3 討 論

ZEB1是具有抑制IL-2表達(dá)作用的鋅指結(jié)構(gòu)蛋白，其基因定位在10p11.2染色體上在，含有多個剪切變異體，其含有兩個相鄰的鋅指簇，這兩個鋅指簇能夠特異性地同CACCT序列、CAGGTG序列結(jié)合，調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄〔8，9〕。兩個鋅指簇中間含有的結(jié)構(gòu)域不參與DNA的結(jié)合，能夠與其他相關(guān)調(diào)節(jié)因子結(jié)合影響ZEB1功能發(fā)揮，另外ZEB1含有CID結(jié)構(gòu)域，能夠與CtBP結(jié)合，促進(jìn)染色質(zhì)的凝聚，影響靶分子的轉(zhuǎn)錄〔10，11〕。ZEB1在成人的膀胱、子宮等中高表達(dá)，在胎兒的心臟、肺臟、甲狀腺中也具有較高水平的表達(dá)，ZEB1與腫瘤發(fā)生有關(guān)，其在膽囊癌、胰腺癌等腫瘤組織中表達(dá)水平較高，并且沉默ZEB1表達(dá)后可以發(fā)揮抑制腫瘤的作用〔12，13〕。目前在膀胱癌、結(jié)腸癌等腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)ZEB1表達(dá)下調(diào)可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長、侵襲、遷移，同時還具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用〔14，15〕。在乳腺癌中的研究顯示，ZEB1下調(diào)可以抑制乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能〔16〕。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，沉默ZEB1后的乳腺癌細(xì)胞增殖能力降低，細(xì)胞凋亡水平升高，說明沉默ZEB1具有抑制乳腺癌細(xì)胞生長誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡的作用，這明確了ZEB1在乳腺癌細(xì)胞增殖凋亡中的作用，說明沉默ZEB1具有抗乳腺癌細(xì)胞的作用。

細(xì)胞周期是生命活動的基礎(chǔ)，細(xì)胞在細(xì)胞周期時相變化中發(fā)生增殖、分化、衰老等狀態(tài)，細(xì)胞周期主要分為G1期、S期、G2期和M期，細(xì)胞周期蛋白一共含有8個亞型，分別在不同的周期變化時呈現(xiàn)規(guī)律性的表達(dá)，其中cyclinE是哺乳動物中G1期調(diào)控蛋白，在G1期的晚期表達(dá)水平最高，能夠促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入S期，cyclin E是細(xì)胞周期進(jìn)展的促進(jìn)因子〔17～19〕。p27是細(xì)胞周期抑制蛋白，其可以通過末端的Thr位點(diǎn)阻礙周期蛋白功能發(fā)揮，高表達(dá)p27能夠使細(xì)胞停滯在G1期〔20〕。研究顯示，ZEB1敲減可以將脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞周期阻滯在G1期，抑制細(xì)胞增殖能力，后續(xù)在胰腺癌、大腸癌中的研究顯示，ZEB1敲減可能通過阻滯G1期進(jìn)展降低癌細(xì)胞增殖能力〔21～23〕。本實(shí)驗(yàn)表明，沉默ZEB1后的乳腺癌細(xì)胞G1期比例升高，細(xì)胞中cyclin E蛋白水平降低，p27蛋白水平升高，說明沉默ZEB1可以將乳腺癌細(xì)胞阻滯在G1期。

細(xì)胞凋亡機(jī)制較為復(fù)雜，其中包括線粒體途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑、死亡受體途徑等，線粒體途徑是發(fā)現(xiàn)較早的一種凋亡發(fā)生機(jī)制，其發(fā)生的關(guān)鍵是線粒體內(nèi)CytochromeC的釋放，正常情況下，CytochromeC主要存在于線粒體內(nèi)，在受到外界因素的刺激以后，線粒體中的CytochromeC進(jìn)入到胞質(zhì)內(nèi)，激活下游Caspase級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生，CytochromeC進(jìn)入胞質(zhì)是線粒體凋亡途徑發(fā)生的關(guān)鍵因素〔24～26〕。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，沉默ZEB1可以促進(jìn)線粒體中CytochromeC進(jìn)入胞質(zhì)，誘導(dǎo)細(xì)胞中凋亡執(zhí)行因子Caspase-3的活化，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生，這提示沉默ZEB1可以通過線粒體途徑誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡。

總之，沉默ZEB1具有抗乳腺癌的作用，其可以抑制乳腺癌細(xì)胞的生長，阻滯乳腺癌細(xì)胞周期，誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡，這為以后研究ZEB1在乳腺癌發(fā)生中的作用奠定了基礎(chǔ)，為基因靶向治療乳腺癌提供了思路。