甘輝云 杜敬東 歐陽(yáng)虹 程 杰

(三峽大學(xué)附屬仁和醫(yī)院耳鼻咽喉科，湖北 宜昌 443001)

異硫氰酸酯類化合物(ITCs)可由十字花科植物如花椰菜、甘南、水芹等提取得到，是十字花科植物發(fā)揮抗腫瘤作用的主要成分。近年來(lái)ITCs因其良好的抗腫瘤作用而受到廣泛關(guān)注，苯乙基(PE)ITC是其中研究最為廣泛的一種〔1〕。多項(xiàng)體內(nèi)外研究結(jié)果顯示，PEITC在包括肺癌、乳腺癌、前列腺癌及血液系統(tǒng)腫瘤等多種腫瘤中可發(fā)揮明顯的抗癌活性。PEITC的抗腫瘤活性包括抑制Ⅰ相代謝酶的活性及激活Ⅱ相代謝酶、抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯、誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基(ROS)水平升高和促進(jìn)氧化應(yīng)激過(guò)程、誘導(dǎo)線粒體凋亡途徑、抑制新生血管生成和腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等〔2,3〕。PEITC具有相當(dāng)可觀的抗腫瘤潛力，然而目前對(duì)其作用及機(jī)制研究還不夠透徹〔4～6〕。迄今為止，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)研究報(bào)道PEITC在喉癌中的作用。本研究觀察PEITC對(duì)Hep-2細(xì)胞增殖、凋亡、周期及侵襲能力的影響，分析其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 人喉癌細(xì)胞株 Hep-2，人支氣管上皮細(xì)胞株 16HBE購(gòu)自四川大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，儲(chǔ)存于液氮中。主要試劑：PEITC 美國(guó)(Sigma 公司)；培養(yǎng)基 RPMI1640、胰蛋白酶(Hyclone 公司)；胎牛血清(美國(guó) Gibco 公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS，杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)公司)；二甲基亞砜(DMSO，Invitrogen公司)；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK8，日本dojindo公司)；AnnexinV-PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，PI細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司)；末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記(TUNEL)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(瑞士Roche 公司)；人工重組基底膜Matrigel膠(美國(guó)BD公司)；Tanswell Chamber(美國(guó)Costar公司)；鏈霉素青霉素雙抗液、細(xì)胞總蛋白提取試劑盒(武漢谷歌生物)；聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天公司)；聚偏氟乙烯(PVDF)膜(美國(guó) Millipore 公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)分組 選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的喉癌Hep-2細(xì)胞和人支氣管上皮16HBE細(xì)胞，按完全隨機(jī)的原則分為6組，空白組：常規(guī)培養(yǎng)；DMSO(0.0 μmol/L)組：于培養(yǎng)基中加入與藥物處理組等體積的 DMSO；藥物組：分別給予不同濃度的PEITC(2.5、5.0、7.5、10.0 μmol/L)處理喉癌Hep-2細(xì)胞，PEITC (5.0、10.0、15.0、20.0 μmol/L)處理人支氣管上皮16HBE細(xì)胞。

1.3CCK8檢測(cè)細(xì)胞活性 0.25%胰酶消化，計(jì)數(shù)并接種細(xì)胞于96孔板，每孔細(xì)胞數(shù)量為2 000～5 000個(gè)，37℃ 5%CO2條件下培養(yǎng)12～24 h；每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，另設(shè)4個(gè)孔作為空白對(duì)照組(加入與處理組等量的培養(yǎng)液和CCK8檢測(cè)液，無(wú)細(xì)胞)。吸去原培養(yǎng)液，加入含藥物培養(yǎng)液至各組對(duì)應(yīng)的PEITC終濃度。每孔中加入CCK8檢測(cè)液10 μl，注意關(guān)掉光源；使用酶標(biāo)儀檢測(cè)各組在450 nm波長(zhǎng)的吸光度數(shù)值；計(jì)算各組細(xì)胞的增殖抑制率。

1.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率及周期 依據(jù)實(shí)驗(yàn)分組方案給予每組DMSO或不同濃度PEITC處理，每組平行設(shè)3個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，將原細(xì)胞培養(yǎng)液吸出至離心管內(nèi)，PBS洗滌細(xì)胞，加入適量胰酶消化，室溫孵育致使貼壁細(xì)胞可被輕輕吹打下來(lái)時(shí)，加入之前吸至離心管內(nèi)的對(duì)應(yīng)各組細(xì)胞培養(yǎng)液。將混勻的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至另一5 ml離心管，經(jīng)AnnexinV-PI染色后，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，用300目(孔徑40～50 μm)尼龍網(wǎng)過(guò)濾，上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.5TUNEL染色 用胰酶消化細(xì)胞，加入含10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培養(yǎng)基中和胰酶，吹打混懸細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，低倍鏡下分別計(jì)數(shù)4個(gè)方格的細(xì)胞總數(shù)，公式如下：細(xì)胞總數(shù)=(4個(gè)方格的活細(xì)胞總數(shù)/4)×104×稀釋倍數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104/ml。上述細(xì)胞懸液接種于已置入爬片的6孔板中，每孔500 μl；于熒光顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞：綠色熒光的發(fā)射波長(zhǎng)范圍為515～565 nm。計(jì)算結(jié)果時(shí)，每樣本隨機(jī)選取10個(gè)高倍鏡下視野，計(jì)數(shù)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞所占全部細(xì)胞的比例，以反映腫瘤細(xì)胞的凋亡率。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 將Matrigel膠放置于4℃過(guò)夜使其充分溶解，稀釋至終濃度為200 μg/ml(用預(yù)冷后的超純水或PBS)；每孔Transwell上室鋪入50 μl濃度為200 μg/ml的Matrigel凝膠，37℃放置2 h以上或者超凈臺(tái)過(guò)夜風(fēng)干；在Transwell上室加入無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)基100 μl/孔，室溫下于搖床上100 r/min放置1 h，吸取未結(jié)合的液體；將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組經(jīng)不同濃度PEITC處理的細(xì)胞，以不含血清的RPMI1640培養(yǎng)液重懸，制作細(xì)胞懸液(調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104/L)；將處理好的單細(xì)胞懸液用移液器取每孔100 μl，緩緩加入Transwell上室，在下室加入含10%血清的培養(yǎng)液500～600 μl；48 h后棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，取出小室，PBS沖洗1次，甲醇-丙酮固定液固定10 min；以棉簽輕輕拭去上室面黏附的細(xì)胞；結(jié)晶紫染色10 min，沖洗3次，用中性樹(shù)膠封片；顯微鏡下計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，選取上下左右隨機(jī)6個(gè)視野，以每視野觀察到的細(xì)胞平均數(shù)代表細(xì)胞侵襲能力，每組平行設(shè)3～5個(gè)濾膜。

1.7Western印跡 在處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞中加入對(duì)應(yīng)濃度的PEITC，培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次，每次5 min，棄去洗液，晾干；配制蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(濃度為25 mg/ml)，分裝避免反復(fù)凍融，使用時(shí)稀釋至終濃度為5.0 mg/ml；96孔板中，在蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液孔中按0，1，2，4，8，12，16，20 μl順序加入蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，PBS補(bǔ)足20 μl；在樣品孔中加入2 μl樣品(依據(jù)蛋白濃度酌情調(diào)整)，PBS補(bǔ)足20 μl。每樣品設(shè)4個(gè)復(fù)孔。在96孔板中每孔加入200 μl配好的BCA工作液，37℃恒溫箱避光孵育30 min；檢測(cè)A570 nm波長(zhǎng)下的吸光度值；以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品吸光值，求出樣品稀釋后濃度，樣品實(shí)際濃度=樣品稀釋后濃度×稀釋倍數(shù)(單位：μg/μl)。應(yīng)用Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)(LI-COR公司，美國(guó))掃描，Odyssey圖像處理軟件半定量分析顯影條帶。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，方差齊者采用SNK檢驗(yàn)，方差不齊者進(jìn)行TamhaneT2檢驗(yàn)。每組隨時(shí)間變化資料均數(shù)之間的比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析。

2 結(jié) 果

2.1不同濃度PEITC對(duì)細(xì)胞增殖的影響 隨著PEITC濃度和作用時(shí)間的增加，Hep-2細(xì)胞的增殖能力顯著下降，下降趨勢(shì)具有濃度和時(shí)間依賴性，各藥物處理組細(xì)胞吸光度數(shù)值與0.0 μmol/L組差異顯著(P<0.05)，其中以10.0 μmol/L的PEITC作用效果最為顯著；而5.0 μmol/L和10.0 μmol/L的PEITC處理正常人支氣管上皮16HBE細(xì)胞后，相比0.0 μmol/L組而言，細(xì)胞吸光度數(shù)值變化無(wú)顯著差異。由此說(shuō)明PEITC在能夠有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖的濃度范圍內(nèi)，對(duì)16HBE細(xì)胞的增殖活性影響不大。見(jiàn)表1。

表1 不同濃度PEITC對(duì)細(xì)胞增殖活性細(xì)胞凋亡率的影響

與0.0 μmol/L相比：1)P<0.05，2)P<0.01；表2同

2.2不同濃度PEITC對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 2.5 μmol/L組Hep-2細(xì)胞凋亡率與0.0 μmol/L組比較無(wú)明顯差異(P>0.05)，5.0 μmol/L組相較0.0 μmol/L組有顯著差異(P<0.05)，而7.5 μmol/L組與10.0 μmol/L組和0.0 μmol/L組相比有顯著差異(P<0.01)，提示PEITC濃度達(dá)到5.0 μmol/L即可顯著誘導(dǎo)Hep-2細(xì)胞凋亡，PEITC誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡呈劑量依賴性；而在16HBE細(xì)胞中，5.0 μmol/L組和10.0 μmol/L組與0.0 μmol/L組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說(shuō)明10.0 μmol/L以內(nèi)的PEITC并沒(méi)有誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞凋亡發(fā)生顯著變化。15.0、20.0 μmol/L組與0.0 μmol/L組相比差異顯著(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.3不同濃度PEITC對(duì)細(xì)胞周期分布的影響 隨著PEITC的濃度升高，G0/G1期細(xì)胞比例減少(P<0.05)，G2/M期細(xì)胞比例上升(P<0.05)，S期細(xì)胞比例略微上升(P>0.05)，提示PEITC誘導(dǎo)Hep-2細(xì)胞發(fā)生了G2/M期阻滯。見(jiàn)表2。

2.4不同濃度PEITC對(duì)Hep-2細(xì)胞凋亡的影響 0.0，2.5，5.0，7.5，10.0 μmol/L組細(xì)胞平均凋亡率分別為1.32%±2.57%，4.80%±1.77%，8.98%±4.41%，19.50%±1.58%，44.23%±2.31%，說(shuō)明PEITC以劑量依賴性方式誘導(dǎo)Hep-2細(xì)胞凋亡。見(jiàn)圖1。

表2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度PEITC對(duì)細(xì)胞周期分布的影響

2.5不同濃度PEITC對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響 0.0，2.5，5.0，7.5，10.0 μmol/L組細(xì)胞平均侵襲數(shù)分別為298.25±24.23，275.52±44.21，154.65±14.25，97.73±9.54，52.51±4.38。PEITC可以顯著降低Hep-2細(xì)胞侵襲能力，隨著給藥濃度增加，Hep-2細(xì)胞侵襲能力顯著下降，與0.0 μmol/L組相比，5.0，7.5和10.0 μmol/L組差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

DAPI：4′,a-二胺基-2-苯基吲哚圖1 TUNEL法檢測(cè)不同濃度PEITC對(duì)Hep-2細(xì)胞凋亡的影響(×200)

圖2 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度PEITC對(duì)Hep-2細(xì)胞侵襲能力的影響(×200)

2.6不同濃度PEITC對(duì)Hep-2細(xì)胞胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶(PI3K)/Akt信號(hào)通路及其下游蛋白表達(dá)水平的影響 PEITC處理前，Hep-2細(xì)胞中PI3K/Akt通路蛋白PI3KclsssⅢ、PI3Kp110α、PI3Kp110β、p-Akt、總-Akt、磷酸化3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶(p-PDK)1及其下游關(guān)鍵蛋白糖原合成酶激酶(GSK)3-β、p-核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κBp65、總-NF-κBp65、Bcl-2、Bax和Bcl-xl表達(dá)水平均較高，而在PEITC處理后，PI3KclsssⅢ、PI3Kp110α、PI3Kp110β、p-Akt、p-PDK1、GSK3-β、p-NF-κBp65、Bcl-2和Bcl-xl蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)，呈濃度依賴性，促凋亡蛋白Bax表達(dá)上調(diào)，而總Akt和NF-κBp65水平基本不變。不同濃度藥物處理組細(xì)胞與0.0 μmol/L組相比PI3K/Akt信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)水平的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 不同濃度PEITC對(duì)Hep-2細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)通路蛋白及下游蛋白表達(dá)水平的影響

3 討 論

流行病學(xué)調(diào)查研究顯示，飲食中十字花科植物的攝入水平與多種人類腫瘤發(fā)病率的降低呈顯著負(fù)相關(guān)〔7〕。十字花科植物如西蘭花、甘南、水芹等，因其獨(dú)特的天然抗癌活性，受到了廣泛關(guān)注。ITCs是大量存在于十字花科植物中的硫苷酶解產(chǎn)物，是十字花科植物中關(guān)鍵的抗腫瘤活性成分，而PEITC是其中研究最為廣泛的一種〔8〕。PEITC的抗腫瘤作用是多方面的，包括抑制Ⅰ相代謝酶的活性及激活Ⅱ相代謝酶、誘發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡和周期阻滯、激活氧化應(yīng)激過(guò)程及線粒體凋亡途徑、抑制新生血管生成和腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等。研究發(fā)現(xiàn)PEITC對(duì)包括前列腺癌、乳腺癌、肺癌等細(xì)胞均具有抗腫瘤作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PEITC可以有效抑制喉癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)喉癌Hep-2細(xì)胞的凋亡，并誘導(dǎo)G2/M期阻滯。同時(shí)，PEITC還能夠抑制喉癌Hep-2細(xì)胞的體外侵襲能力。而相同濃度的PEITC作用于人支氣管上皮16HBE細(xì)胞，并沒(méi)有引起細(xì)胞增殖和凋亡發(fā)生顯著改變。PEITC發(fā)揮抗腫瘤作用可能與下調(diào)PI3K/Akt通路蛋白PI3KclsssⅢ、PI3Kp110α、PI3K-p110β、p-Akt、p-PDK1及下游關(guān)鍵蛋白GSK3-β、p-NF-κBp65、Bcl-2、Bax和Bcl-xl的表達(dá)水平相關(guān)。

PI3K/Akt信號(hào)通路被認(rèn)為是癌細(xì)胞存活的首要通路之一，有“抗凋亡通路”之稱。該信號(hào)通路異常激活，可引起細(xì)胞過(guò)度增殖及代謝紊亂，從而導(dǎo)致多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展〔9,10〕。PI3K通過(guò)直接或間接方式被激活，從而催化質(zhì)膜生成第二信使PIP3，PIP3和Akt結(jié)合形成復(fù)合物，導(dǎo)致Akt在激酶PDK1和PDK2的作用下被激活?；罨腁kt通過(guò)磷酸化作用激活或抑制其下游的Bcl-2/Bcl-XL相關(guān)死亡促進(jìn)因子(BAD)、NF-κB、霉帕霉素靶蛋白、GSK3-β、Forkhead蛋白家族和caspase蛋白家族等，進(jìn)而參與調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、分化、侵襲轉(zhuǎn)移等多種生理過(guò)程。目前已證實(shí)在肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、白血病等多種惡性腫瘤中，都存在著PI3K/Akt信號(hào)通路的異常激活，其活化程度與腫瘤的惡性程度密切相關(guān)。近來(lái)研究顯示，頭頸部鱗癌的發(fā)生發(fā)展也與PI3K/Akt信號(hào)通路的活化有密切聯(lián)系。本文結(jié)果說(shuō)明PEITC誘導(dǎo)喉癌細(xì)胞凋亡及抑制細(xì)胞增殖，可能與下調(diào)PI3K/Akt信號(hào)通路及下游蛋白的表達(dá)水平有關(guān)；這與PEITC胰腺癌和乳腺癌細(xì)胞中的研究結(jié)果類似〔11～13〕。傳統(tǒng)放化療對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用缺乏選擇性，殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，不可避免地?fù)p傷正常細(xì)胞和組織，引起局部或全身不良反應(yīng)。PEITC在較低濃度范圍內(nèi)對(duì)喉癌Hep-2細(xì)胞有著顯著的抗腫瘤作用，而正常人支氣管上皮16HBE細(xì)胞對(duì)同等濃度范圍內(nèi)的PEITC不敏感，這證實(shí)作為抗腫瘤藥物，PEITC對(duì)非腫瘤細(xì)胞是相對(duì)安全的。研究證實(shí)PEITC僅能誘導(dǎo)人慢性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞凋亡，對(duì)健康淋巴細(xì)胞毒性很低〔14,15〕。PEITC高效無(wú)毒的特性使其成為具有潛力的天然抗腫瘤活性藥物。

總之，PEITC能夠有效抑制喉癌Hep-2細(xì)胞的增殖能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯及抑制細(xì)胞體外侵襲能力，其作用可能與下調(diào)PI3K/Akt通路及下游關(guān)鍵蛋白的表達(dá)水平有關(guān)。此外，在能夠有效抑制腫瘤細(xì)胞的濃度范圍內(nèi)，PEITC對(duì)正常人支氣管上皮16HBE細(xì)胞無(wú)顯著影響。本實(shí)驗(yàn)僅從體外研究探討了PEITC抗喉癌作用及其分子機(jī)制，但是對(duì)于確切的PEITC在喉癌中的作用方式還有待在體實(shí)驗(yàn)去闡明。