伍連春 陳杰翔 喻小蘭 唐小平 王曉燕 張宇驕 夏紀(jì)毅，5

(內(nèi)江市隆昌縣中醫(yī)醫(yī)院泌尿外科，四川 內(nèi)江 642150)

膀胱癌的發(fā)生發(fā)展與癌細(xì)胞的失控增殖、惡性轉(zhuǎn)移和凋亡息息相關(guān)〔1〕。膀胱癌的治療策略之一是促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。細(xì)胞增殖和凋亡平衡失控是導(dǎo)致癌變的重要原因〔2〕。B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2)相關(guān)X蛋白(Bax)可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而B(niǎo)cl-2抑制細(xì)胞凋亡，二者相互拮抗，Bcl-2/Bax比值與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)〔3〕。促分裂原激活蛋白激酶(MAPK)參與細(xì)胞增殖、分化及癌變，主要包括細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)1/2和P38等信號(hào)蛋白，通過(guò)調(diào)控多種癌基因，促進(jìn)細(xì)胞過(guò)度增殖、分化和凋亡，在乳腺癌、結(jié)腸癌和肺癌等惡性癌癥中發(fā)揮作用。U0126是MAPK抑制劑，可抑制癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡〔4〕。中藥黃芩素在腫瘤中可發(fā)揮抑癌作用〔5〕，但黃芩素聯(lián)合U0126在膀胱癌中的作用和分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

1 材料與方法

1.1材料 人膀胱癌T24細(xì)胞株從西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心獲贈(zèng)，細(xì)胞用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 g/ml鏈霉素(美國(guó)invitrogen公司)的改良杜氏伊格爾(DMEM)培養(yǎng)液(美國(guó)hyclone公司)，于37℃、5%CO2細(xì)胞孵育箱(型號(hào)：HERAcell 240i，美國(guó)Thermo Scientific Forma公司)內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。黃芩素(四川成都曼斯特科技公司，純度≥ 98%，批號(hào)A0779)；U0126(碧云天生物科技公司，批號(hào)S1901)，內(nèi)參3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)(碧云天生物科技公司，批號(hào)AG019)，細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)(CCK8)試劑盒(南京凱基生物有限公司，批號(hào)C0037)，ERK1/2、Bax、Bcl-2、P38引物由上海生工合成，對(duì)應(yīng)的抗體均購(gòu)于Cell signal technology公司(ERK1/2批號(hào)4695，p-ERK1/2批號(hào)9101，P38批號(hào)8690，磷酸化(p)-P38批號(hào)4511，Bax 批號(hào)14796，Bcl-2批號(hào)15071)。碘化丙啶(PI)染色液(批號(hào)550825，美國(guó)BD Biosciences公司)。Annexin V/PI試劑盒(批號(hào)556547，美國(guó)BD Biosciences公司)。反轉(zhuǎn)錄試劑盒(型號(hào)：K1622，美國(guó)Thermo Fermentas公司)，流式細(xì)胞檢測(cè)儀(型號(hào)：BD FACSAria Ⅱ，美國(guó)BD Biosciences公司)。全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(型號(hào)：Multiskan Spectrum，美國(guó)Thermo Electron公司)。

1.2方法

1.2.1CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖 制備T24細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)細(xì)胞；將2×105個(gè)細(xì)胞接種至96孔板中，每孔100 μl，隨機(jī)分為對(duì)照組、黃芩素組(加入20 μmol/L黃芩素培養(yǎng)24 h)、U0126組、(加入20 μmol/L U0126培養(yǎng)24 h)、黃芩素聯(lián)合U0126組(加入20 μmol/L黃芩素和20 μmol/L U0126共同培養(yǎng)24 h)，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24、48、72 h，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)加入10 μl CCK8，混勻；培養(yǎng)4 h，在450 nm處檢測(cè)吸光度，計(jì)算各組細(xì)胞增殖率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 膀胱癌細(xì)胞株T24接種于12孔板，按各分組處理后，收集細(xì)胞，室溫磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，加入1 ml 70%預(yù)冷乙醇固定過(guò)夜，第2天離心去除乙醇，PBS重懸，加入RNase至終濃度為100 mg/L，37℃水浴30 min，加入PI染色液至終濃度為50 mg/L，4℃避光染色30 min，用激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm的紅色熒光檢測(cè)細(xì)胞周期。結(jié)果采用細(xì)胞周期擬合軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡 各組細(xì)胞用Annexin V/PI試劑盒染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)早期凋亡和晚期凋亡。實(shí)驗(yàn)操作按照試劑盒說(shuō)明書嚴(yán)格執(zhí)行。收集懸浮細(xì)胞，PBS漂洗2次，加入400 μl 1×結(jié)合緩沖液(Binding Buffer)重懸細(xì)胞，接著加入5 μl Annexin V-FITC，混勻，室溫避光孵育15 min加入10 μl PI染色液，混勻，避光孵育5 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)早期凋亡和晚期凋亡。檢測(cè)結(jié)果采用CellQuest軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.2.4Real Time PCR檢測(cè)細(xì)胞ERK1/2、Bax、Bcl-2和P38 mRNA水平 將各組細(xì)胞棄掉培養(yǎng)基，PBS漂洗2遍，Trizol提取總RNA，并以此為模板，Oligo(dT)為引物，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒K1622反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈，采用Real Time PCR檢測(cè)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)水平。引物序列：ERK1/2：前向：AATCACACGGTAGACACTGAAATGCC，反向：CATCATCCCATCTAAAATGTCCCCTG；Bax：前向：CCCGAGAGGTCTTTTTCCGAG，反向：CCAGCCCATGATGGTTCTGAT；Bcl-2：前向：GGTGGGGTCATGTGTGTGG，反向：CGGTTCAGGTACTCAGTCATCC；P38：前向：CCCGAGCGTTACCAGAACC，反向：TCGCATGAATGATGGACTGAAAT；GAPDH：前向：GCACCGTCAAGGCTGAGAAC，反向：TGGTGAAGACGCCAGTGGA。

1.2.5Western印跡檢測(cè)細(xì)胞ERK1/2、Bax、Bcl-2和P38蛋白表達(dá)和對(duì)ERK1/2、P38磷酸化的影響 將各組細(xì)胞棄掉培養(yǎng)基，PBS洗2次，加入含5%蛋白酶抑制劑的強(qiáng)裂解液RIPA，冰上裂解20 min，15 000 r/min離心后取上清液，超聲破碎后，收集細(xì)胞總蛋白，-20℃保存?zhèn)溆?。?0 μg蛋白進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，轉(zhuǎn)膜到0.2 μmol/L聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉的1×Tris-HCl緩沖鹽吐溫溶液(TBST)封閉1 h。ERK1/2、Bax、Bcl-2、P38、p-ERK1/2、p-P38和GAPDH(稀釋比例分別為1∶1 000，1∶800，1∶500，1∶1 000，1∶1 000，1∶1 000，1∶2 000)一抗4℃孵育過(guò)夜。1×TBST漂洗2次，10 min/次，加入1∶2 000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記二抗IgG(H+L)，室溫孵育1 h，1×TBST漂洗2次，5 min/次，凝膠成像儀成像后進(jìn)行灰度分析，計(jì)算相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件，組間比較采用t檢驗(yàn)，多個(gè)樣本之間的兩兩比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1黃芩素聯(lián)合U0126對(duì)人膀胱癌T24細(xì)胞增殖的影響 單獨(dú)應(yīng)用黃芩素、U0126或聯(lián)合應(yīng)用黃芩素和U0126可顯著抑制細(xì)胞增殖，與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且具有時(shí)間依賴性，而黃芩素聯(lián)合U0126作用對(duì)膀胱癌細(xì)胞的抑制作用更加明顯(P<0.01)，見(jiàn)表1。

表1 黃芩素聯(lián)合U0126對(duì)人膀胱癌T24細(xì)胞增殖的影響

與對(duì)照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；下表同

2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)黃芩素聯(lián)合U0126對(duì)T24細(xì)胞周期的影響 單獨(dú)應(yīng)用黃芩素、U0126或聯(lián)合應(yīng)用黃芩素和U0126 作用24 h，G0～G1期細(xì)胞含量增多，S期細(xì)胞下降，與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而黃芩素聯(lián)合U0126作用對(duì)細(xì)胞周期的影響更加顯著(P<0.01)，說(shuō)明二者聯(lián)合使用具有協(xié)同效應(yīng)，見(jiàn)表2。

表2 黃芩素聯(lián)合U0126對(duì)人膀胱癌T24細(xì)胞周期的影響

2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)黃芩素聯(lián)合U0126對(duì)T24細(xì)胞凋亡的影響 單獨(dú)應(yīng)用黃芩素、U0126或聯(lián)合應(yīng)用黃芩素和U0126 作用T24細(xì)胞24 h，早期凋亡率和晚期凋亡率增多，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而黃芩素聯(lián)合U0126作用對(duì)T24細(xì)胞早期凋亡率和晚期凋亡率的誘導(dǎo)更加顯著(P<0.01)，說(shuō)明二者聯(lián)合使用具有協(xié)同誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的效應(yīng)，見(jiàn)表3。

表3 黃芩素聯(lián)合U0126對(duì)人膀胱癌T24細(xì)胞凋亡的影響

2.4Real Time PCR檢測(cè)黃芩素聯(lián)合U0126對(duì)T24細(xì)胞ERK1/2、Bax、Bcl-2和P38 mRNA水平的影響 單獨(dú)應(yīng)用黃芩素、U0126或聯(lián)合應(yīng)用黃芩素和U0126 作用T24細(xì)胞24 h，Bax mRNA表達(dá)增加，Bcl-2 mRNA表達(dá)減少，ERK1/2和P38 mRNA水平顯著降低，與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而黃芩素聯(lián)合U0126作用對(duì)T24細(xì)胞ERK1/2、Bax、Bcl-2和P38 mRNA的影響更加顯著(P<0.01)，見(jiàn)表4。

2.5Western印跡檢測(cè)黃芩素聯(lián)合U0126對(duì)T24細(xì)胞Bax、Bcl-2蛋白及P38 ERK1/2磷酸化的影響 單獨(dú)應(yīng)用黃芩素、U0126或聯(lián)合應(yīng)用黃芩素和U0126 作用T24細(xì)胞24 h，Bax蛋白表達(dá)增加，Bcl-2蛋白表達(dá)減少，而ERK1/2和P38磷酸化水平顯著降低，與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而黃芩素聯(lián)合U0126作用對(duì)Bax、Bcl-2蛋白和P38、ERK1/2磷酸化的影響更加顯著(P<0.01)，見(jiàn)圖1，表5。

表4 各組ERK1/2、Bax、Bcl-2和P38 mRNA相對(duì)表達(dá)量分析

1.對(duì)照組；2.黃芩素組；3.U0126組；4.黃芩素聯(lián)合U0126組圖1 黃芩素聯(lián)合U0126對(duì)T24細(xì)胞Bax、Bcl-2蛋白及P38、ERK1/2磷酸化的影響

表5 Bax、Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量和p-ERK1/2、p-P38 磷酸化水平分析

3 討 論

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的癌癥，膀胱上皮性腫瘤占95%～98%，其中移行細(xì)胞癌約占90%，少數(shù)鱗狀上皮癌和腺癌等非上皮性腫瘤占2%～5%〔6〕。膀胱癌的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞增殖和凋亡息息相關(guān)，多種生長(zhǎng)因子、癌基因及它們之間的相互作用在膀胱癌的增殖和凋亡中發(fā)揮著重要作用〔7〕。

Bcl-2和Bax是Bcl-2家族中最重要的兩個(gè)成員，主要分布于細(xì)胞質(zhì)中的線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜上，Bax可拮抗Bcl-2的功能，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；Bcl-2對(duì)多種因素介導(dǎo)的凋亡產(chǎn)生抗性，抑制細(xì)胞凋亡〔8〕。本研究結(jié)果表明，單獨(dú)使用黃芩素或U0126作用T24細(xì)胞，可促進(jìn)Bax表達(dá)升高，Bcl-2表達(dá)降低，而黃芩素和U0126聯(lián)合使用使Bax表達(dá)升高及Bcl-2表達(dá)降低的作用更加顯著，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的早期凋亡和晚期凋亡。

MAPK是絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶，其主要成員ERK激活或磷酸化與細(xì)胞增殖有關(guān)〔9〕。ERK/MAPK信號(hào)通路可被生長(zhǎng)因子、血清、GPCR的配體和轉(zhuǎn)錄因子等激活，將細(xì)胞外刺激傳遞至細(xì)胞核，參與細(xì)胞正常的生長(zhǎng)、發(fā)育和分化〔10〕。同時(shí)，ERK信號(hào)通路還可參與細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和癌癥的發(fā)生發(fā)展，近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，ERK1/2在膀胱癌中被顯著激活，促進(jìn)細(xì)胞增殖〔11〕。本研究結(jié)果表明，單獨(dú)使用黃芩素或U0126作用T24細(xì)胞，可抑制ERK1/2 mRNA和蛋白的表達(dá)，ERK1/2磷酸化顯著降低；聯(lián)合使用黃芩素和U0126作用于細(xì)胞，對(duì)ERK1/2 mRNA和蛋白的抑制作用及抑制ERK1/2磷酸化作用更加顯著，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖能力，絕大多數(shù)細(xì)胞停留在G0～G1期，細(xì)胞凋亡能力顯著增強(qiáng)。

在膀胱癌患者中，P38的表達(dá)和磷酸化水平顯著增加，因此，P38信號(hào)通路在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用〔12〕。本研究結(jié)果表明，單獨(dú)使用黃芩素或U0126作用T24細(xì)胞，可抑制P38 mRNA和蛋白的表達(dá)，P38磷酸化顯著降低，聯(lián)合使用黃芩素和U0126作用于細(xì)胞，對(duì)P38 mRNA和蛋白的抑制作用及抑制ERK1/2磷酸化作用更加顯著，腫瘤細(xì)胞增殖受到抑制，凋亡顯著增強(qiáng)。因此，聯(lián)合使用黃芩素和U0126可通過(guò)調(diào)控ERK1/2和P38信號(hào)通路作用于膀胱癌。

綜上所述，黃芩素聯(lián)合U0126具有協(xié)同效應(yīng)，可通過(guò)調(diào)控ERK1/2和P38信號(hào)通路抑制人膀胱癌細(xì)胞增殖，改變細(xì)胞周期，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，為膀胱癌治療和機(jī)制研究提供參考依據(jù)。