王培昌 張雁冰

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100053)

復(fù)制性衰老又稱細(xì)胞衰老，是指體外培養(yǎng)的細(xì)胞只能進(jìn)行有限次數(shù)的分裂〔1〕。復(fù)制性衰老是生物整體衰老的基礎(chǔ)，鑒于在生物整體水平上衰老研究標(biāo)準(zhǔn)化瓶頸，復(fù)制性衰老研究可作為衰老研究的主要手段。衰老的自由基(FR)學(xué)說認(rèn)為，F(xiàn)R水平隨齡累積，通過脂質(zhì)過氧化及對(duì)生物大分子的損傷而致細(xì)胞衰老〔2〕。前期研究發(fā)現(xiàn)，抗氧化劑L-肌肽、氨基胍可有效滅活FR，并可延緩細(xì)胞衰老〔3,4〕。白藜蘆醇、染料木黃酮、姜黃素、大黃素富含于葡萄、大豆、生姜、大蒜等水果或食物中，且具有較強(qiáng)的抗氧化活性〔5～8〕，其對(duì)細(xì)胞衰老如何影響？本文以人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞(2BS)為模型，觀察上述抗氧化劑對(duì)細(xì)胞體外傳代次數(shù)(PDs)、細(xì)胞生長(zhǎng)增殖能力、細(xì)胞表型及DNA損傷修復(fù)能力的影響。

1 材料與方法

1.1抗氧化劑 白藜蘆醇、染料木黃酮、姜黃素和大黃素皆為分析純(西安天行健天然生物制品有限公司，西安)，由二甲基亞砜(DMSO)溶解，儲(chǔ)存液濃度為1 mmol/L，再由DMEM培養(yǎng)液稀釋至所需濃度，同體積的DMSO加入DMEM作為對(duì)照。

1.2細(xì)胞 2BS(北京天壇生物制品股份有限公司，北京)細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞學(xué)特征均無異常，體外培養(yǎng)代齡平均為55～60代，30代以下為年輕細(xì)胞，55代及以上為衰老細(xì)胞。

1.3主要儀器 酶標(biāo)儀(Bio-TEK，Rockville，MA，USA)，普通光學(xué)顯微鏡(Olympus)，ImageMaster VDS成像系統(tǒng)(Pharmacia Biosci Inc，Sweden)。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)〔4〕使用含有10%胎牛血清(Logan，UT，USA)的DMEM培養(yǎng)基(Gibco，BRL)，在飽和濕度、37℃、5%CO2通用培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度85%～90%時(shí)，按1∶2或1∶4傳代。普通DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)20 h，待細(xì)胞全部貼壁后，轉(zhuǎn)入含藥培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，對(duì)照組2BS培養(yǎng)基加入同體積DMSO。

1.5藥物對(duì)細(xì)胞毒性的觀察 融合狀態(tài)的2BS細(xì)胞(28代)，傳代并接種于無菌6孔板或24孔板，普通DMEM培養(yǎng)20 h，轉(zhuǎn)入含不同濃度藥物的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)3 d，普通光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)、細(xì)胞排列及融合狀況、胞體是否收縮或裂解、細(xì)胞碎片及中毒顆粒的多少等，各抗氧化劑濃度梯度設(shè)為1、10、50、100、200、500、1 000 μmol/L。

1.6抗氧化劑對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響〔4〕將2BS細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔細(xì)胞數(shù)2.5×103個(gè)，每孔體積200 μl。普通DMEM培養(yǎng)基于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)20 h，換含藥DMEM培養(yǎng)基并于上述條件下繼續(xù)培養(yǎng)72 h，每孔加25 μl四甲基偶氮唑鹽(MTT，10 mg/ml)，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)4 h，小心吸凈孔內(nèi)液體，每孔加0.2 ml DMSO，使結(jié)晶物充分溶解，以DMSO作空白，于10 min內(nèi)測(cè)定每孔在490 nm處的吸光值。每點(diǎn)設(shè)6個(gè)平行樣孔。

1.7抗氧化劑對(duì)2BS細(xì)胞DNA損傷的影響 將30代齡2BS細(xì)胞，以不同濃度的含藥DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h(藥物濃度梯度為10 μmol/L、100 μmol/L、1 mmol/L、10 mmol/L、100 mmol/L)，收集細(xì)胞，以下述程序行彗星試驗(yàn)〔4〕：取110 μl 0.5%的正常熔點(diǎn)瓊脂糖(NMA)鋪于預(yù)冷的磨毛玻片上，用蓋玻片壓平膠面，4℃凝固15 min，移去蓋玻片，于37℃水浴中將100 μl 1%低熔點(diǎn)瓊脂糖(LMA)與等體積的細(xì)胞懸液混勻，細(xì)胞密度約為1×106個(gè)/ml，取75 μl鋪于第一層膠上，迅速蓋上蓋玻片，4℃凝固15 min，去掉蓋玻片。將膠板浸于預(yù)冷的細(xì)胞裂解液(2.5 mol/L NaCl，100 mmol/L Na2EDTA，1%十二烷基肌氨酸鈉，10 mmol/L Tris，pH 10，1%Triton X-100)中，4℃避光裂解1 h，取出膠板，放于水平電泳槽中，加入新配制的電泳緩沖液(0.3 mmol/L NaOH，1 mmol/L Na2EDTA，pH 13)，4℃、避光靜置10 min，4℃、15 V(1 V/cm，200 mA)電泳25 min。將膠板移置一潔凈平皿中，中和液(0.4 mol/L Tris-Cl，pH7.5)中和兩次，然后以5 μg/ml的PI避光染色20 min，置于熒光顯微鏡(TCS.SPZ，Leica，Manheim，Germany)下觀察，攝取圖象。綠光激發(fā)，激發(fā)波長(zhǎng)567 nm，阻擋波長(zhǎng)590 nm。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1四種抗氧化劑對(duì)2BS細(xì)胞體外PDs的影響 各含藥培養(yǎng)基(抗氧化劑濃度均為1 μmol/L)培養(yǎng)的細(xì)胞體外PDs均較對(duì)照組細(xì)胞有所下降，以姜黃素〔(46.0±3.2)代〕、大黃素〔(41.0±2.9)代〕培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞PDs下降最為顯著(P<0.05)，提示上述抗氧化劑可能存在一定的細(xì)胞毒性。白藜蘆醇〔(50.0±2.9)代〕、染料木黃酮〔(52.0±3.0)代〕與對(duì)照組〔(54.2±3.4)代〕無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

2.2四種抗氧化劑對(duì)2BS細(xì)胞生長(zhǎng)增殖能力的影響 圖1是不同濃度的藥物培養(yǎng)基培養(yǎng)2BS細(xì)胞72 h后在490 nm處光吸收變化，結(jié)果顯示白藜蘆醇、染料木黃酮、姜黃素均在低濃度下促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的最佳濃度分別是1.0 μmol/L、1.0～5.0 μmol/L、1.0 μmol/L。大黃素對(duì)2BS細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的促進(jìn)作用不顯著。隨著濃度升高，四種抗氧化劑對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖能力的促進(jìn)作用逐步下降，并在高濃度下表現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的抑制作用。

圖1 四種抗氧化劑對(duì)2BS細(xì)胞生長(zhǎng)增殖能力的影響

2.3四種抗氧化劑對(duì)2BS細(xì)胞表型的影響 以1、10、50、100、200、500 μmol/L、1 mmol/L濃度的藥物培養(yǎng)基培養(yǎng)28代齡2BS細(xì)胞3 d，細(xì)胞形態(tài)見圖2。結(jié)果顯示，隨著抗氧化劑濃度升高，細(xì)胞胞體逐漸收縮、折光性逐漸下降，細(xì)胞融合速度減緩等，200 μmol/L白藜蘆醇、500 μmol/L染料木黃酮、50 μmol/L姜黃素、10 μmol/L大黃素培養(yǎng)的細(xì)胞既可在顯微鏡下觀察到細(xì)胞表型、融合速度的變化。

圖2 四種抗氧化劑培養(yǎng)基培養(yǎng)28代齡2BS細(xì)胞3 d后的細(xì)胞形態(tài)及融合狀況(×100)

2.4四種抗氧化劑對(duì)2BS細(xì)胞DNA損傷的影響 將30代齡2BS細(xì)胞，以不同濃度的含藥DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h(藥物濃度梯度為10 μmol/L、100 μmol/L、1 mmol/L、10 mmol/L、100 mmol/L)，彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。結(jié)果顯示，隨著抗氧化劑濃度升高，彗尾長(zhǎng)度逐漸增加，尤以姜黃素、大黃素最為明顯，說明上述四種抗氧化劑在高濃度下均對(duì)DNA有一定的損傷作用。

圖3 四種抗氧化劑培養(yǎng)基培養(yǎng)30代齡2BS細(xì)胞4 h彗星試驗(yàn)結(jié)果(×100)

3 討 論

FR隨齡累積，并通過脂質(zhì)過氧化損傷細(xì)胞膜磷脂雙分子層、DNA單鏈斷裂或基因突變影響基因表達(dá)、染色體端粒縮短速度加快等加速細(xì)胞衰老〔2，9，10〕。前期研究發(fā)現(xiàn)，有效滅活FR可延緩細(xì)胞衰老〔3，4〕。白藜蘆醇、染料木黃酮、姜黃素、大黃素富含于葡萄、大豆、生姜、大蒜等水果或食物中，且具有較強(qiáng)的抗氧化活性〔5～8〕，那么，上述抗氧化劑能否有效地延緩細(xì)胞衰老呢？本研究發(fā)現(xiàn)上述藥物培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞PDs均低于對(duì)照組細(xì)胞，尤以大黃素培養(yǎng)的細(xì)胞傳代次數(shù)最少，推測(cè)上述四種抗氧化劑可能同時(shí)存在延緩細(xì)胞衰老及抑制細(xì)胞衰老的雙重效果。

細(xì)胞生長(zhǎng)增殖能力是細(xì)胞衰老的主要生物學(xué)指標(biāo)之一，本研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇、染料木黃酮、姜黃素均在低濃度時(shí)顯示了較好的促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖效果，然而，隨著濃度升高其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖能力的促進(jìn)作用逐步下降，并在高濃度下表現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的抑制作用，而大黃素即使在低劑量條件下亦未顯示對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的促進(jìn)作用。為驗(yàn)證上述結(jié)論，本研究以不同濃度的上述抗氧化劑培養(yǎng)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)低劑量時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好、細(xì)胞融合速度優(yōu)于對(duì)照組細(xì)胞，隨著抗氧化劑濃度升高，細(xì)胞胞體逐漸收縮、折光性逐漸下降，細(xì)胞融合速度減緩等，從而驗(yàn)證了上述結(jié)論。提示上述抗氧化劑存在促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞毒性雙重作用，且隨劑量加大其雙重作用均加大，低劑量抗氧化劑連續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞毒性隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而累積，從而抵消了其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖能力的促進(jìn)效果。上述抗氧化劑細(xì)胞毒性的機(jī)制如何呢？本研究以不同濃度的抗氧化劑培養(yǎng)細(xì)胞，而后行彗星試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)隨著抗氧化劑濃度的加大，彗尾長(zhǎng)度逐漸加大、說明上述抗氧化劑可斷裂單鏈DNA，且隨著劑量加大其損傷作用愈強(qiáng)，提示上述四種抗氧化劑的細(xì)胞毒性基于其對(duì)細(xì)胞DNA損傷作用。

白藜蘆醇、染料木黃酮、姜黃素、大黃素在低濃度時(shí)可促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖，但存在基于損傷DNA的細(xì)胞毒性；上述四種抗氧化劑不能延緩細(xì)胞衰老，歸因于其促進(jìn)細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的雙重生物學(xué)作用。