吳風(fēng)雷 宋子琰 劉 毅 鄭義同 卞保祥

(徐州醫(yī)科大學(xué)附屬連云港醫(yī)院，江蘇 連云港 221002)

最新的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表明，肺癌在所有的惡性腫瘤中發(fā)病率最高〔1〕，其中大部分(約80%)病理類型為非小細(xì)胞肺癌；而且絕大部分患者一經(jīng)診斷就是晚期，失去手術(shù)機(jī)會?；熓峭砥诜切〖?xì)胞肺癌治療的基本手段，但5年生存率也只有15%左右〔2〕，臨床上經(jīng)常會遇到不同非小細(xì)胞肺癌患者接受同一種方案化療，但療效卻相差甚遠(yuǎn)。單核苷酸多態(tài)性(SNP)指DNA序列上發(fā)生的單個核苷酸堿基之間的變異。這種遺傳多態(tài)性可導(dǎo)致基因組編碼的相應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，從而導(dǎo)致不同個體對疾病的易感性及藥物的療效差異〔3〕。SNP的這種特點(diǎn)決定了它能夠應(yīng)用于腫瘤的治療和預(yù)后等有關(guān)研究。因此，檢測某些特定基因特定位點(diǎn)的SNP，觀察其在不同個體或人群中基因序列上的差異，可用來提前預(yù)測惡性腫瘤患者對不同化療藥物的療效，使精準(zhǔn)個體化化療成為可能。

吉西他濱屬核苷類藥物，是第三代抗腫瘤化療藥物，對腫瘤細(xì)胞的DNA合成期(S期)產(chǎn)生作用，也可阻滯腫瘤細(xì)胞從合成前期(G1期)向合成期甚至合成后期(G2期)發(fā)展。該藥物需通過細(xì)胞膜上的載體將其轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)，其中最重要的載體是人類平衡型核苷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(hENT)1。已有研究表明在實(shí)體腫瘤患者中，hENT1(-706)GC基因型與GG基因型相比，前者能降低10%的吉西他濱體內(nèi)清除率〔4〕。本研究探討 hENT1(-706)SNP與含吉西他濱為主的化療方案對非小細(xì)胞肺癌患者療效間的關(guān)系，為指導(dǎo)臨床個體化精準(zhǔn)治療提供一定的生物預(yù)測標(biāo)志。

1 資料與方法

1.1一般資料 2009年1月至2012年12月共納入連云港第一醫(yī)院腫瘤科和淮安市第一人民醫(yī)院的225例非小細(xì)胞肺癌患者，其中男性146例，女性79例，年齡33～79歲，平均55歲；鱗癌120例，腺癌105例；高分化61例，中分化82例，低分化82例。ⅢA期126例，ⅢB期87例，Ⅳ期12例，其中hENT1(-706)位點(diǎn)GG基因型124，GC基因型90例，CC基因型11例。患者均配合良好，取得準(zhǔn)確數(shù)據(jù)。

1.2化療方案及評價標(biāo)準(zhǔn) 所有患者接受以下的化療方案：吉西他濱劑量及用法：1 000 mg/m2，用藥時間為化療開始的第1和第8天。順鉑劑量及用法：一次40 mg/m2，連用3 d，第2～4天給藥?？ㄣK：曲線下面積(AUC=4～5 mg·ml-1·min-1)，第1天，21 d為1個周期。以實(shí)體瘤療效評價標(biāo)準(zhǔn)評價療效：完全緩解(CR)：病灶完全消失4 w以上；部分緩解(PR)：單個病灶或多個病灶的長徑總和縮小超過50%超過4 w以上；進(jìn)展(PD)；出現(xiàn)新病灶，單個病灶或多個病灶的長徑總和增大超過20%；穩(wěn)定(SD)：單個病灶或多個病灶的長徑總和縮小介于PR和PD之間，通過客觀緩解率(ORR)CR+PR的總例數(shù)和總生存期(OS)即從患者開始接受化療的日期至患者最終死亡的日期作為觀察指標(biāo)評價化療療效。

1.3基因組DNA提取 所有患者化療前抽取靜脈外周血2 ml。采用Dneasy?blood&tissue 試劑盒(Qiagen，Hiden，Germany)提取外周血基因組DNA，-20℃冷藏備用。

1.4PCR擴(kuò)增目的基因并對目的位點(diǎn)進(jìn)行測序 hENT1 G-706C的引物為：正義5′-GGGAGCAGGAGAGGGACGCT-3′，反義3′-AGGCAGGCAAGAGGACGAGAGG-5′，反應(yīng)體系總體積為30 μl，包括模板1 μl，10×緩沖液3 μl，10 mmol/L dNTP0.5 μl，rTAq酶0.5 μl，正向引物0.5 μl，反向引物0.5 μl。擴(kuò)增條件為：變性：95℃30 s，退火：56℃30 s，延伸：72℃30 s，總共35個循環(huán)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海歐易科技有限公司在Biosystems DNA測序儀進(jìn)行單向測序。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)應(yīng)用 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、非條件Logistic回歸分析、Kaplan-Meier分析、Log-rank檢驗(yàn)、Cox比例風(fēng)險回歸模型。

2 結(jié) 果

2.1hENT1(-706)基因多態(tài)性和化療療效之間的關(guān)系 肺癌患者ORR與其hENT1(-706)位點(diǎn)SNP相關(guān)(P<0.05)，hENT1(-706)GG 基因型的患者ORR明顯高于GC或CC基因型(圖1，表1)。

圖1 hENT1G-706C位點(diǎn)基因測序

表1 化療敏感性和hENT1G-706C 位點(diǎn)基因多態(tài)性之間的關(guān)系

1)非條件Logistic回歸校正了年齡、性別、美國東部腫瘤協(xié)作組評分、分期、分級

2.2hENT1(-706)基因多態(tài)性和OS之間的關(guān)系 攜帶hENT1(-706)OS：GG 為19.0個月，GC為 15.7個月，CC為14.5個月，GG與GC，CC比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，GC，CC比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。將hENT1(-706)GC和CC基因型合并，與GG型比較，生存時間顯著減少(P<0.001)(表2，圖3)。將臨床病理等相關(guān)的因素與基因型之間的聯(lián)系通過Cox 回歸模型(單因素及多因素)分析顯示，基因分型、臨床分期及分化程度與OS相關(guān)。攜帶hENT1(-706)GC或CC基因型的患者死亡風(fēng)險明顯高于GG

基因型的患者(P<0.05)(表3)。

表2 hENT1(-706)基因多態(tài)性和OS之間的關(guān)系

圖2 hENT1(-706)GG，GC，CC基因型NSCLC患者的總生存曲線

表3 晚期NSCLC預(yù)后影響因素的Cox多因素回歸分析結(jié)果

HR風(fēng)險比，HR>1 表明OS時間短;1)OR通過單變量非條件COX回歸分析;2)OR通過多變量非條件COX回歸分析

圖3 hENT1(-706)GG，GC+CC基因型NSCLC患者的總生存曲線

3 討 論

化療是目前NSCLC患者綜合治療的重要手段之一。但是，不同患者即使接受了相同的化療方案，療效或不良反應(yīng)可能會存在很大的差異。近年來，越來越多的研究表明藥物相關(guān)酶基因SNP和化療藥物敏感性密切相關(guān)。

吉西他濱是親水性化療藥物，需要通過相應(yīng)的核苷載體才能進(jìn)入腫瘤細(xì)胞發(fā)揮藥效。目前已經(jīng)被確認(rèn)總共有5種核苷轉(zhuǎn)運(yùn)載體和吉西他濱轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)：人富集型核苷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(hCNT)1-3和hENT1-2。其中hENT1的轉(zhuǎn)運(yùn)作用最重要〔5〕。hENT1缺乏的腫瘤細(xì)胞對核苷類藥物耐藥〔4〕。Wei等〔6〕通過納入10項(xiàng)研究對399例接受吉西他濱治療的胰腺癌患者進(jìn)行Meta分析發(fā)現(xiàn)：hENT1預(yù)測是吉西他濱療效的生物靶標(biāo)。Deng等〔7〕發(fā)現(xiàn)hENT1高表達(dá)的晚期膽道癌患者接受含有吉西他濱方案的化療效果要優(yōu)于低表達(dá)的患者。Elebro等〔8〕建立肺癌組織塊活體移植動物模型發(fā)現(xiàn)，吉西他濱對hENT1陽性表達(dá)的負(fù)瘤裸鼠總生存時間明顯長于對照組。已有研究表明攜帶hENT1 mRNA高表達(dá)患者中大部分單倍體型為CGG，CGC〔9〕。因此，hENT1 SNP與吉西他濱藥物敏感性相關(guān)很有可能是改變了hENT1表達(dá)水平所致，接下來的研究將檢測患者h(yuǎn)ENT1基因及蛋白表達(dá)，對其可能的機(jī)制進(jìn)一步闡明。Myers等〔9〕發(fā)現(xiàn)hENT1-1345C>G、-1050G>A和-706G>C 3位點(diǎn)的基因多態(tài)性影響hENT1蛋白表達(dá)，而hENT1CGG/CGG野生型單倍體型和CGG/CGC突變型單倍體型主要的變異位點(diǎn)是-706G>C。推測hENT1-706G>C位點(diǎn)基因多態(tài)性在影響hENT1表達(dá)中起重要作用。Gusella等〔4〕發(fā)現(xiàn)hENT1GC基因型患者對吉西他濱血清清除率明顯低于GG基因型患者。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示GG基因型患者對GP方案化療更敏感。其機(jī)制可能是hENT1(-706)GG基因型改變了hENT1基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，降低了hENT1的表達(dá)，從而影響了吉西他濱進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)的濃度。推測：hENT1(-706)位點(diǎn)SNP是一個潛在的獨(dú)立的化療療效預(yù)測因子。本研究表明，hENT1(-706)位點(diǎn)SNP可能與接受GP方案化療晚期NSCLC患者的敏感性相關(guān)，攜帶GC或CC基因型患者可能提示預(yù)后不良。該結(jié)果與Myers等〔9〕的研究中提及野生型和變異性單倍體型中hENT1(-706)是影響hENT1表達(dá)中最關(guān)鍵的SNP位點(diǎn)相一致。同時，需要指出的是：本實(shí)驗(yàn)結(jié)果和Gusella等〔5〕研究相反，Gusella等〔5〕發(fā)現(xiàn)hENT1(-706)GG型患者的吉西他濱血漿清除率明顯高于hENT1(-706)GC型患者。這可能是因?yàn)椴煌N族人群對同一種化療藥物的特異性不同。本實(shí)驗(yàn)存在一定不足之處：hENT1(-706)位點(diǎn)SNP是否會影響hENT1表達(dá)僅在理論上及以前相關(guān)研究結(jié)果進(jìn)行推測，因此，在后續(xù)研究中應(yīng)該進(jìn)一步進(jìn)行基因及蛋白表達(dá)水平的測定，并對結(jié)果進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，進(jìn)一步明確相關(guān)耐藥機(jī)制。