周冬冬 劉晶晶 史振東 楊茜曦 張 瑾

(天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院乳腺三科，天津 300060)

三陰性乳腺癌既不表達(dá)雌激素和孕激素受體，也不表達(dá)人表皮生長因子受體-2，是乳腺癌的一個(gè)特殊亞型，占乳腺癌的10%～20%，具有惡性程度更高、侵襲能力更強(qiáng)、預(yù)后更差的特點(diǎn)，且對(duì)人表皮生長因子受體-2的曲妥珠單抗分子的靶向治療無效〔1，2〕。微小RNAs(miRNAs)是一類非編碼單鏈的小分子RNA，能夠通過與目標(biāo)mRNA結(jié)合直接降解mRNA或抑制其翻譯等機(jī)制發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞發(fā)育、增殖等功能，在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用〔3，4〕。miR-21、-200a、-200b均是調(diào)控細(xì)胞發(fā)育、增殖的重要miRNAs，但目前有關(guān)三者血清水平在老年三陰性乳腺癌中臨床意義的報(bào)道較少。本研究通過探討血清miR-21、-200a、-200b水平在老年三陰性乳腺癌患者中的臨床意義，為其診療提供參考。

1 對(duì)象與方法

1.1對(duì)象 2014年1月至2017年12月天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院接受治療的80例經(jīng)病理學(xué)確診為乳腺癌(雌激素和孕激素受體及人表皮生長因子受體-2表達(dá)均陰性)、年齡60～78歲、平均(65.3±7.6)歲的老年三陰性乳腺癌患者為觀察組，同時(shí)選擇50名年齡60～76歲、平均(66.2±8.4)歲的健康體檢者為對(duì)照組。觀察組浸潤性導(dǎo)管癌52例、浸潤性導(dǎo)管癌28例。

1.2主要試劑與儀器 Trizol試劑盒、miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光實(shí)時(shí)定量試劑盒分別購于美國Invitrogen公司、德國QIAGEN公司和日本Takara公司；miR-21引物：5′-tagcttatcagactgatgttga-3′；miR-200a引物：5′-taacactgtctggtaacgatgt-3′-miR-200b引物：5′-taatactgcctggtaatgatga-3′、下游通用引物和內(nèi)參U6引物均由試劑盒提供。紫外分光光度計(jì)Ultrospec與熒光實(shí)時(shí)定量儀分別購于美國GE Healtbcare公司和BioRad公司。

1.3RNA的提取 于清晨抽取兩組對(duì)象靜脈血5 ml，離心，分離血清，按照Trizol試劑盒說明書提取RNA：取0.5 ml分離好的血清，加入0.5 ml Trizol，于室溫下靜置10 min；加入0.5 ml氯仿，混勻，于低溫下12 000 r/min離心10 min，吸取上層透明液體，加入0.75倍上層液體量的異丙醇，混勻后，于低溫下12 000 r/min離心10 min，沉淀加入1.0 ml乙醇洗滌后，于低溫下12 000 r/min離心5 min，置室溫下干燥15 min；加入無RNA酶的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解，用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行定量后，保存于-80℃冰箱。

1.4miRNA cDNA反轉(zhuǎn)錄及熒光實(shí)時(shí)定量 按照試劑盒說明書進(jìn)行操作：取出提取好的RNA，配制成體積為20 μl的反應(yīng)體系；反應(yīng)條件為：37℃反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)60 min，95℃滅活反應(yīng)5 min；取出反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，配制成體積為20 μl的反應(yīng)體系，將其放置于熒光定量儀中進(jìn)行反應(yīng)，95℃預(yù)變性反應(yīng)15 min，94℃變性反應(yīng)15 s，55℃退火反應(yīng)30 s，70℃延伸反應(yīng)30 s，40個(gè)循環(huán)。用2-△ct計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS19.0進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1兩組血清miR-21、-200a和-200b水平的比較 與對(duì)照組比較，觀察組血清miR-21、-200a水平顯著升高，miR-200b水平降低(P均<0.01)，見表1。

表1 兩組血清miR-21、-200a和-200b水平的比較相對(duì)表達(dá)量)

2.2不同臨床病理特征老年三陰性乳腺癌患者血清miR-21、-200a和-200b水平的比較 與中、高度分化、Ⅰ～Ⅱ期和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的老年三陰性乳腺癌患者比較，低分化、Ⅲ～Ⅳ期和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的老年三陰性乳腺癌患者血清miR-21、-200a水平顯著升高，miR-200b水平顯著降低(P均<0.01)，見表2。

表2 不同臨床病理特征老年三陰性乳腺癌患者血清miR-21、-200a和-200b水平的比較相對(duì)表達(dá)量)

3 討 論

因三陰性乳腺癌惡性程度高、侵襲能力強(qiáng)、預(yù)后差，因此給女性健康及生命帶來了嚴(yán)重的威脅〔5，6〕，早期發(fā)現(xiàn)、早期治療對(duì)其預(yù)后具有重要意義。目前，miRNAs在調(diào)控腫瘤發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后方面的作用已經(jīng)得到證實(shí)〔7〕，是腫瘤研究的熱點(diǎn)之一。miR-21是在人體組織和細(xì)胞中較早發(fā)現(xiàn)的微小RNA分子，由單個(gè)基因編碼，在多種非實(shí)體瘤(如淋巴瘤等)和實(shí)體瘤(如胃癌、肝癌、肺癌等)腫瘤組織中高水平表達(dá)，是第一個(gè)在腫瘤患者血清中檢測到的微小RNA分子，其可以通過抑制程序性細(xì)胞死亡基因(PDCD)4、原肌球蛋白1基因(TPM1)、磷酸酶及張力蛋白同源基因(PTEN)、轉(zhuǎn)錄激活基因(TAP)63等腫瘤抑制基因表達(dá)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，并與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移等病理過程密切相關(guān)〔8，9〕。李強(qiáng)等〔10〕研究顯示，高水平表達(dá)的miR-21會(huì)降低腫瘤化療的敏感性，增加耐藥性；而抑制miR-21的表達(dá)，能夠逆轉(zhuǎn)化療藥物耐藥性，提高化療效果。miR-200a是miR-200家族中的成員之一，其在卵巢癌、胰腺癌等腫瘤組織中高水平表達(dá)，被認(rèn)為是上皮細(xì)胞分化和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中的關(guān)鍵調(diào)控因子，與腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)〔11，12〕。miR-200b是miR-200家族中研究較多的一個(gè)微小RNA分子，在多種腫瘤中表現(xiàn)出一定的抗腫瘤作用，而且能夠抑制腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移〔13，14〕。陳志凱等〔15〕研究發(fā)現(xiàn)，胃癌患者血清miR-200b水平顯著降低，并與腫瘤的臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，有助于判斷疾病的預(yù)后。

本研究結(jié)果表明老年三陰性乳腺癌患者血清miR-21、-200a及-200b水平的高低與腫瘤分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，均可作為三陰性乳腺癌嚴(yán)重程度及預(yù)后的判斷指標(biāo)，為其診療提供參考。