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        高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定食品中15 種有毒生物堿

        2018-11-28 06:52:24范素芳馬俊美翟洪穩(wěn)
        食品科學(xué) 2018年22期
        關(guān)鍵詞:方法

        范素芳,馬俊美,劉 茁,俞 婧,翟洪穩(wěn),李 強(qiáng),*,張 巖,*

        (1.河北省食品檢驗研究院,河北省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗室,河北 石家莊 050091;2.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,河北 石家莊 050018)

        生物堿是存在于自然界(主要為植物)中的一類含氮堿性有機(jī)化合物,大多數(shù)生物堿具有復(fù)雜的環(huán)狀結(jié)構(gòu),并且具有明顯的生物活性[1]。生物堿廣泛存在于毛茛科、蕓香科、豆科等植物的根、果實(shí)中,很多食品中也含有生物堿,如馬鈴薯中含有配糖生物堿龍葵素、茄子中含有茄堿、檳榔中含有檳榔堿等[2]。很多生物堿是中藥的有效成分,如嗎啡能鎮(zhèn)痛,麻黃堿可以止咳平喘,喜樹堿、秋水仙堿具有抗癌作用等,生物堿具有生物活性的同時也具有毒性,必須控制其用量,攝入量過大時會產(chǎn)生副作用[3]。生物堿是引發(fā)食物中毒的主要原因之一。馬鈴薯尤其是發(fā)芽的馬鈴薯中含有龍葵素,常有因食用了發(fā)芽的馬鈴薯而引發(fā)的中毒案例,而且通常為群體性事件[4]。烏頭堿、顛茄堿(阿托品)、東莨菪堿、秋水仙堿、馬錢子堿、鬼臼毒素等生物堿由于具有毒性,在臨床應(yīng)用的同時也會因使用不當(dāng)造成食物中毒[5-10]。因此檢測糧食谷物、果蔬、植物飲料中有毒生物堿對保障食品安全非常必要。本實(shí)驗選擇糧谷類玉米粉、面粉、鍋巴和薯片,選擇果蔬類番茄、茄子、桃和土豆,選擇植物源飲料山楂汁、雪梨汁、芒果汁和王老吉,其中土豆中易含龍葵素,茄子中有茄堿,植物源飲料中易混入烏頭堿、莨菪堿、馬錢子堿等有毒生物堿的成分。

        目前,生物堿的檢測方法主要有高效液相色譜法[11-13]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[7,14-17]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[18-19]、高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜[20-21]等,樣品基質(zhì)多為生物樣品。Murauer等[22]用超臨界流體色譜測定金雞納樹皮中喹啉類生物堿,其中定量測定了金雞納堿、奎寧和金雞納啶。Li Lou等[23]用雙環(huán)糊精系統(tǒng)的毛細(xì)管電泳分離并測定了4 種鉤藤堿。Long Zhen等[24]用強(qiáng)離子交換二維液相色譜測定了莨菪烷生物堿。段存賢等[25]用氨基鍵合硅膠為固定相的正相高效液相色譜法測定神農(nóng)丸中士的寧與馬錢子堿的含量。丁琳等[26]建立了莨菪浸膏片的高效液相色譜特征指紋圖譜,并對其中阿托品、山莨菪堿、東莨菪堿、樟柳堿4 種莨菪烷類生物堿進(jìn)行定量分析。已經(jīng)有火鍋底料[27]及罌粟殼[28-29]中生物堿的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法,秦軍燕等[30]建立了肉蓯蓉、枸杞和山藥中6 種生物堿的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法,賀琦等[3]建立了紅酒、牛奶、面包和玉米粉中20 種有害生物堿的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法。但大宗食品中有毒生物堿的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法鮮見報道。本實(shí)驗建立了糧谷、植物源性飲料、蔬菜、水果中茄堿、東莨菪堿、馬錢子堿、士的寧、麻黃堿、烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿、秋水仙堿、阿托品、檳榔堿、毒芹堿、鬼臼毒素、毛果蕓香堿及鉤吻堿15 種生物堿的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        植物源性飲料:山楂汁 北京京膳堂飲料有限公司;冰糖雪梨 康師傅控股有限公司;芒果汁 韓國樂天集團(tuán);涼茶飲料 廣州王老吉藥業(yè)股份有限公司。糧谷類樣品:小米鍋巴 良品鋪?zhàn)庸煞萦邢薰荆皇砥绹鴺肥鹿?;面粉、玉米?市購。果蔬樣品:番茄、茄子、桃、土豆 市購。

        乙腈、甲醇、乙醇(均為色譜純) 美國Fisher Scientific公司;正己烷(分析純) 北京化學(xué)試劑公司;甲酸(色譜純) 美國Supelco Analytical公司;去離子水 屈臣氏集團(tuán)(香港)有限公司;15 種生物堿標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99%) 上海源葉生物科技有限公司;陽離子交換柱(3cc,60 mg) 美國Waters公司。

        1.2 儀器與設(shè)備

        Triple Quad 6500液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(配有電噴霧離子源和MultiQuant 3.0.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)) 美國AB Sciex公司;3K13高速冷凍離心機(jī) 德國Sigma公司;渦旋混勻儀 德國IKA公司;KQ-500DB超聲儀 昆山市超聲儀器公司。

        1.3 方法

        1.3.1 溶液配制及試樣制備

        標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:分別稱取各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)10 mg置于100 mL容量瓶中,用體積分?jǐn)?shù)20%乙醇溶液溶解并定容至刻度,搖勻,制得100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,于-20 ℃避光保存,可使用2 個月。根據(jù)實(shí)驗需要,用20%乙醇溶液將標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制成不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,現(xiàn)配現(xiàn)用。

        液態(tài)樣品進(jìn)行搖勻;固態(tài)樣品粉碎均勻;果蔬樣品切碎后勻漿。制備好的試樣于0~5 ℃保存,盡快測定。

        1.3.2 樣品前處理

        1.3.2.1 液態(tài)試樣

        稱取1.000 g植物源性飲料于離心管中,加入20%乙醇溶液定容至20 mL,9 500 r/min離心10 min,吸取1.0 mL上層清液,0.22 μm濾膜過濾,待測。

        1.3.2.2 固態(tài)樣品(糧谷類)

        取1.000 g樣品加入10 mL 20%乙醇溶液,超聲提取30 min,9 500 r/min離心10 min,過濾,收集濾液。殘渣用10 mL 20%乙醇溶液重復(fù)提取1 次,合并濾液,并用乙醇定容至20 mL。取5 mL濾液,加入5 mL正己烷,渦旋混勻1 min,于4 ℃、9 500 r/min離心5 min,取1 mL下層清液,過0.22 μm濾膜,待測。

        1.3.2.3 果蔬樣品

        取1.000 g樣品加入10 mL 20%乙醇溶液,室溫超聲輔助提取30 min,于4 ℃、9 500 r/min離心10 min,上層清液過濾,收集濾液。殘渣用10 mL 20%乙醇溶液重復(fù)提取1 次,合并濾液,并用乙醇定容至20 mL。取1 mL濾液,過0.22 μm濾膜過濾,待測。

        1.3.2.4 空白實(shí)驗

        除不加試樣外,均按上述步驟進(jìn)行。

        1.3.3 高效液相色譜-質(zhì)譜條件

        1.3.3.1 色譜條件

        Waters Xbridge BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,5 μm);0.1%甲酸溶液和乙腈為流動相,梯度洗脫,洗脫條件見表1;流速0.30 mL/min;柱溫30 ℃;進(jìn)樣量2 μL。

        表1 梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions

        1.3.3.2 質(zhì)譜條件

        電離方式:電噴霧電離,正離子模式;噴霧電壓:5.5 kV;離子源溫度:500 ℃;氣簾氣壓力:30 psi;霧化氣壓力:50 psi;輔助氣壓力:50 psi;掃描模式:多反應(yīng)監(jiān)測模式,15 種生物堿的質(zhì)譜參數(shù)見表2。

        表2 15 種生物堿的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Mass spectrometric parameters for 15 alkaloids

        1.4 方法的準(zhǔn)確度和精密度

        通過向陰性樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)樣品,按相同的方法進(jìn)行測定,外標(biāo)法定量,驗證方法的回收率。分別向不同基質(zhì)添加1、3、5倍定量限3個水平的標(biāo)準(zhǔn)樣品,每個水平5個平行,計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

        1.5 方法的穩(wěn)定性

        在番茄陰性樣品中添加待測物,按照本方法處理后,在第0、4、8、12、16、20、24小時分別測定,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算被測物質(zhì)的濃度,并計算其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差,考察被測物質(zhì)在測試溶液中放置24 h內(nèi)的穩(wěn)定性(環(huán)境溫度25℃)。

        1.6 基質(zhì)效應(yīng)評價

        定量測定空白基質(zhì)提取液配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液與20%乙醇溶液中相同質(zhì)量濃度待測物的離子響應(yīng)強(qiáng)度,計算二者相對比值評價其基質(zhì)效應(yīng):

        式中:A和B分別為20%乙醇溶液配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液與空白基質(zhì)液配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化結(jié)果

        配制質(zhì)量濃度為100 ng/mL的15 種生物堿的單標(biāo)溶液,采用針泵注射的方式將標(biāo)準(zhǔn)溶液泵入質(zhì)譜,優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)。生物堿大都含有雜環(huán)原子,在正離子模式下易得到一個H+形成準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+,所以實(shí)驗選用正離子模式。采用全掃描模式找到母離子,通過子離子掃描模式選擇響應(yīng)較高的兩個碎片離子,對碰撞能、去簇電壓等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。最終選定母離子與豐度較高,干擾較小的1 對特征子離子進(jìn)行定性分析,選擇其中響應(yīng)值高的作為定量離子。

        2.2 色譜柱的選擇及分離條件的選擇結(jié)果

        考察3 種色譜柱(Waters Xbridge BEH C18(2.1 mm×100 mm,2.5 μm);Thermo Accuore-150 C18(2.1 mm×100 mm,2.5 μm)和資生堂Capcell PAK C18(2.1 mm×100 mm,2 μm))對15 種生物堿的分離效果。結(jié)果表明,使用Thermo C18柱時檳榔堿和毛果蕓香堿沒有基線分離,士的寧、馬錢子堿、阿托品也沒有基線分離;使用資生堂色譜柱時,15 種生物堿峰形良好,但峰面積普遍偏低;使用Waters C18時,15 種生物堿實(shí)現(xiàn)了基線分離,并且峰形良好,峰響應(yīng)也有所提高,因此選擇Waters Xbridge BEH C18柱。

        本研究對比了甲醇-水體系、甲醇-0.1%甲酸溶液體系、乙腈-水體系、乙腈-0.1%甲酸溶液體系作為流動相時15 種生物堿的色譜行為和質(zhì)譜響應(yīng)。結(jié)果表明,流動相中含有0.1%甲酸溶液時,儀器信號響應(yīng)明顯高,因此選擇含0.1%甲酸溶液的體系;有機(jī)相為乙腈時,色譜柱的柱壓比有機(jī)相為甲醇時低,并且有機(jī)相為乙腈時分析物的峰形相對更好。因此選擇乙腈-0.1%甲酸溶液作為流動相。

        為實(shí)現(xiàn)15 種生物堿的基線分離,考察不同梯度條件下的分離情況。C18柱對毛果蕓香堿幾乎沒有保留,不同梯度條件下毛果蕓香堿的保留時間變化不大。檳榔堿和毛果蕓香堿、士的寧、馬錢子堿、阿托品的出峰時間比較接近,為實(shí)現(xiàn)基線分離,需要比較平緩的梯度;次烏頭堿、烏頭堿結(jié)構(gòu)類似,保留時間也比較接近。通過改變梯度洗脫條件,最終實(shí)現(xiàn)了15 種生物堿的基線分離,最終優(yōu)化的梯度洗脫條件見表1。在優(yōu)化好的洗脫條件下,分離情況最差的檳榔堿和毛果蕓香堿的分離度達(dá)1.8,能滿足定量分析要求。玉米基質(zhì)中15 種生物堿的總離子流圖(添加量100 μg/kg)見圖1。

        圖1 玉米基質(zhì)中15 種生物堿的總離子流圖(添加量100 μg/kg)Fig. 1 Total ion chromatogram of 15 alkaloids in corn samples at spiked level of 100 μg/kg

        2.3 試樣前處理條件的選擇和優(yōu)化結(jié)果

        2.3.1 提取溶劑的選擇

        文獻(xiàn)[31]報道采用酸性溶液振蕩,超聲提取后用三氯甲烷萃取測定藥材中二萜類生物堿,另外根據(jù)大部分生物堿難溶或微溶于水、易溶于有機(jī)溶劑的特點(diǎn)選擇常用的甲醇和乙醇、乙腈有機(jī)溶劑,考察三氯甲烷、甲醇、乙醇、乙腈4 種有機(jī)溶劑的提取效果。通過標(biāo)品添加方式考察不同提取溶劑時分析物的回收率最終確定20%乙醇溶液為后續(xù)實(shí)驗的提取溶劑。

        2.3.2 凈化方法的考察

        由于食品基質(zhì)復(fù)雜,形態(tài)多樣,為降低基質(zhì)效應(yīng)的影響采用固相萃取柱對目標(biāo)物進(jìn)行凈化。選擇玉米粉為基質(zhì),15 種生物堿添加量為100 μg/kg,考察陽離子交換柱的凈化效果。

        經(jīng)陽離子交換柱后,秋水仙堿、鬼臼毒素沒有檢測到,表明陽離子交換柱不適合這兩種物質(zhì);毛果蕓香堿、茄堿,回收率分別為2.9%和64.5%;馬錢子堿的回收率為75.6%,其他10 種生物堿的回收率在86.3%~110.7%之間。

        后續(xù)選擇番茄、雪梨汁加標(biāo)樣品經(jīng)陽離子交換柱后進(jìn)行測定,結(jié)果與玉米粉類似。因此,該前處理過程沒有采用陽離子固相萃取柱凈化。

        2.4 方法的線性范圍、檢出限和定量限

        用20%乙醇溶液配制質(zhì)量濃度分別為1、2、5、10、20、50 ng/mL和100 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,按照質(zhì)量濃度由低到高依次進(jìn)行測定。以分析物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),以分析物定量離子對的質(zhì)譜響應(yīng)值為縱坐標(biāo),擬合曲線,得到線性回歸方程,15 種化合物的相關(guān)系數(shù)均高于0.99。阿托品的線性范圍為0.5~100 μg/L,次烏頭堿、新烏頭堿的線性范圍為1~100 μg/L,東莨菪堿、馬錢子堿、烏頭堿、秋水仙堿、士的寧、鬼臼毒素、毛果蕓香堿、檳榔堿的線性范圍為2~100 μg/L,麻黃堿、毒芹堿、茄堿、鉤吻堿的線性范圍為4~100 μg/L。采用加標(biāo)回收的方法確定方法的檢出限和定量限,分別以3、10 倍信噪比為方法的檢出限和定量限。各生物堿的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、回歸方程、檢出限和定量限見表3。阿托品的檢出限為4 μg/kg,次烏頭堿、新烏頭堿為6 μg/kg,東莨菪堿、馬錢子堿、烏頭堿、秋水仙堿、士的寧、鬼臼毒素、毛果蕓香堿、檳榔堿為10 μg/kg,麻黃堿、毒芹堿、茄堿、鉤吻堿為20 μg/kg。阿托品的定量限為10 μg/kg,次烏頭堿、新烏頭堿為20 μg/kg,東莨菪堿、馬錢子堿、烏頭堿、秋水仙堿、士的寧、鬼臼毒素、毛果蕓香堿、檳榔堿為40 μg/kg,麻黃堿、毒芹堿、茄堿、鉤吻堿為80 μg/kg。

        表3 15 種生物堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)參數(shù)Table 3 Standard curve equations, LODs and LOQs for 15 alkaloids

        2.5 方法的準(zhǔn)確度和精密度實(shí)驗結(jié)果

        表4 方法回收率Table 4 Recoveries of the method

        續(xù)表4

        由表4可知,生物堿在植物源性飲料中回收率為83.1%~119.8%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.05%~9.81%;糧谷類食品中回收率為82.4%~119.4%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.06%~9.86%;果蔬類食品中回收率為80.9%~118.4%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.01%~9.9%,均滿足標(biāo)準(zhǔn)檢測方法的要求。

        2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗結(jié)果

        表5 日內(nèi)穩(wěn)定性Table 5 Intra-day stability

        日內(nèi)穩(wěn)定性測定結(jié)果見表5,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.78%~5.21%,符合檢測要求。

        2.7 基質(zhì)效應(yīng)的評價結(jié)果

        15 種生物堿質(zhì)量濃度為20 μg/L,平行測定3 次。結(jié)果顯示,各分析物的平均基質(zhì)效應(yīng)為17.5%~117.7%。評價結(jié)果見表6,阿托品、東莨菪堿、檳榔堿、士的寧、鉤吻堿基質(zhì)效應(yīng)比較明顯,實(shí)際樣品檢測時如檢出該類物質(zhì),應(yīng)該用陰性基質(zhì)提取液配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液定量。

        表6 基質(zhì)效應(yīng)Table 6 Matrix effect %

        2.8 樣品檢測結(jié)果

        使用本研究建立的分析方法,對典型植物源飲料、糧谷食品和果蔬等15 個樣品進(jìn)行了檢測,其中鍋巴和薯片樣品中有茄堿檢出,檢出含量分別為800.4 μg/kg和100.3 μg/kg,其他生物堿均未檢出。

        3 結(jié) 論

        本實(shí)驗建立了食品中15 種有毒生物堿的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法,研究和優(yōu)化提取條件、凈化方式、色譜-質(zhì)譜參數(shù)等指標(biāo),對方法的檢出限、線性范圍、回收率、精密度、基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評價和驗證。經(jīng)實(shí)際樣品測定表明建立的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法適用于植物源飲料、糧谷食品和果蔬等樣品中15 種生物堿的檢測。與賀琦等[3]建立的食品(紅酒、牛奶、面包、米粉)中20 種有害生物堿含量測定的液相色譜-質(zhì)譜法相比,本方法的適用范圍更廣,對糧谷類玉米粉、面粉、鍋巴和薯片,果蔬類番茄、茄子、桃和土豆,植物源飲料類山楂汁、雪梨汁、芒果汁和王老吉等樣品進(jìn)行驗證,并且前處理過程簡單、快速,適用于主要食品中15 種有毒生物堿的快速篩查分析。本方法的建立為相關(guān)監(jiān)測機(jī)構(gòu)提供技術(shù)支撐,有利于保障消費(fèi)者健康。

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