范素芳，馬俊美，劉 茁，俞 婧，翟洪穩(wěn)，李 強(qiáng),*，張 巖,*

（1.河北省食品檢驗研究院，河北省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗室，河北 石家莊 050091；2.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018）

生物堿是存在于自然界（主要為植物）中的一類含氮堿性有機(jī)化合物，大多數(shù)生物堿具有復(fù)雜的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，并且具有明顯的生物活性[1]。生物堿廣泛存在于毛茛科、蕓香科、豆科等植物的根、果實(shí)中，很多食品中也含有生物堿，如馬鈴薯中含有配糖生物堿龍葵素、茄子中含有茄堿、檳榔中含有檳榔堿等[2]。很多生物堿是中藥的有效成分，如嗎啡能鎮(zhèn)痛，麻黃堿可以止咳平喘，喜樹堿、秋水仙堿具有抗癌作用等，生物堿具有生物活性的同時也具有毒性，必須控制其用量，攝入量過大時會產(chǎn)生副作用[3]。生物堿是引發(fā)食物中毒的主要原因之一。馬鈴薯尤其是發(fā)芽的馬鈴薯中含有龍葵素，常有因食用了發(fā)芽的馬鈴薯而引發(fā)的中毒案例，而且通常為群體性事件[4]。烏頭堿、顛茄堿（阿托品）、東莨菪堿、秋水仙堿、馬錢子堿、鬼臼毒素等生物堿由于具有毒性，在臨床應(yīng)用的同時也會因使用不當(dāng)造成食物中毒[5-10]。因此檢測糧食谷物、果蔬、植物飲料中有毒生物堿對保障食品安全非常必要。本實(shí)驗選擇糧谷類玉米粉、面粉、鍋巴和薯片，選擇果蔬類番茄、茄子、桃和土豆，選擇植物源飲料山楂汁、雪梨汁、芒果汁和王老吉，其中土豆中易含龍葵素，茄子中有茄堿，植物源飲料中易混入烏頭堿、莨菪堿、馬錢子堿等有毒生物堿的成分。

目前，生物堿的檢測方法主要有高效液相色譜法[11-13]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[7,14-17]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[18-19]、高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜[20-21]等，樣品基質(zhì)多為生物樣品。Murauer等[22]用超臨界流體色譜測定金雞納樹皮中喹啉類生物堿，其中定量測定了金雞納堿、奎寧和金雞納啶。Li Lou等[23]用雙環(huán)糊精系統(tǒng)的毛細(xì)管電泳分離并測定了4 種鉤藤堿。Long Zhen等[24]用強(qiáng)離子交換二維液相色譜測定了莨菪烷生物堿。段存賢等[25]用氨基鍵合硅膠為固定相的正相高效液相色譜法測定神農(nóng)丸中士的寧與馬錢子堿的含量。丁琳等[26]建立了莨菪浸膏片的高效液相色譜特征指紋圖譜，并對其中阿托品、山莨菪堿、東莨菪堿、樟柳堿4 種莨菪烷類生物堿進(jìn)行定量分析。已經(jīng)有火鍋底料[27]及罌粟殼[28-29]中生物堿的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法，秦軍燕等[30]建立了肉蓯蓉、枸杞和山藥中6 種生物堿的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法，賀琦等[3]建立了紅酒、牛奶、面包和玉米粉中20 種有害生物堿的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法。但大宗食品中有毒生物堿的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法鮮見報道。本實(shí)驗建立了糧谷、植物源性飲料、蔬菜、水果中茄堿、東莨菪堿、馬錢子堿、士的寧、麻黃堿、烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿、秋水仙堿、阿托品、檳榔堿、毒芹堿、鬼臼毒素、毛果蕓香堿及鉤吻堿15 種生物堿的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物源性飲料：山楂汁 北京京膳堂飲料有限公司；冰糖雪梨 康師傅控股有限公司；芒果汁 韓國樂天集團(tuán)；涼茶飲料 廣州王老吉藥業(yè)股份有限公司。糧谷類樣品：小米鍋巴 良品鋪?zhàn)庸煞萦邢薰荆皇砥绹鴺肥鹿?；面粉、玉米?市購。果蔬樣品：番茄、茄子、桃、土豆 市購。

乙腈、甲醇、乙醇（均為色譜純） 美國Fisher Scientific公司；正己烷（分析純） 北京化學(xué)試劑公司；甲酸（色譜純） 美國Supelco Analytical公司；去離子水 屈臣氏集團(tuán)（香港）有限公司；15 種生物堿標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%） 上海源葉生物科技有限公司；陽離子交換柱（3cc，60 mg） 美國Waters公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Triple Quad 6500液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（配有電噴霧離子源和MultiQuant 3.0.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)） 美國AB Sciex公司；3K13高速冷凍離心機(jī) 德國Sigma公司；渦旋混勻儀 德國IKA公司；KQ-500DB超聲儀 昆山市超聲儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制及試樣制備

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：分別稱取各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)10 mg置于100 mL容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)20%乙醇溶液溶解并定容至刻度，搖勻，制得100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于-20 ℃避光保存，可使用2 個月。根據(jù)實(shí)驗需要，用20%乙醇溶液將標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制成不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

液態(tài)樣品進(jìn)行搖勻；固態(tài)樣品粉碎均勻；果蔬樣品切碎后勻漿。制備好的試樣于0～5 ℃保存，盡快測定。

1.3.2 樣品前處理

1.3.2.1 液態(tài)試樣

稱取1.000 g植物源性飲料于離心管中，加入20%乙醇溶液定容至20 mL，9 500 r/min離心10 min，吸取1.0 mL上層清液，0.22 μm濾膜過濾，待測。

1.3.2.2 固態(tài)樣品（糧谷類）

取1.000 g樣品加入10 mL 20%乙醇溶液，超聲提取30 min，9 500 r/min離心10 min，過濾，收集濾液。殘渣用10 mL 20%乙醇溶液重復(fù)提取1 次，合并濾液，并用乙醇定容至20 mL。取5 mL濾液，加入5 mL正己烷，渦旋混勻1 min，于4 ℃、9 500 r/min離心5 min，取1 mL下層清液，過0.22 μm濾膜，待測。

1.3.2.3 果蔬樣品

取1.000 g樣品加入10 mL 20%乙醇溶液，室溫超聲輔助提取30 min，于4 ℃、9 500 r/min離心10 min，上層清液過濾，收集濾液。殘渣用10 mL 20%乙醇溶液重復(fù)提取1 次，合并濾液，并用乙醇定容至20 mL。取1 mL濾液，過0.22 μm濾膜過濾，待測。

1.3.2.4 空白實(shí)驗

除不加試樣外，均按上述步驟進(jìn)行。

1.3.3 高效液相色譜-質(zhì)譜條件

1.3.3.1 色譜條件

Waters Xbridge BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，5 μm）；0.1%甲酸溶液和乙腈為流動相，梯度洗脫，洗脫條件見表1；流速0.30 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量2 μL。

表1 梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions

1.3.3.2 質(zhì)譜條件

電離方式：電噴霧電離，正離子模式；噴霧電壓：5.5 kV；離子源溫度：500 ℃；氣簾氣壓力：30 psi；霧化氣壓力：50 psi；輔助氣壓力：50 psi；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測模式，15 種生物堿的質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 15 種生物堿的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Mass spectrometric parameters for 15 alkaloids

1.4 方法的準(zhǔn)確度和精密度

通過向陰性樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)樣品，按相同的方法進(jìn)行測定，外標(biāo)法定量，驗證方法的回收率。分別向不同基質(zhì)添加1、3、5倍定量限3個水平的標(biāo)準(zhǔn)樣品，每個水平5個平行，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.5 方法的穩(wěn)定性

在番茄陰性樣品中添加待測物，按照本方法處理后，在第0、4、8、12、16、20、24小時分別測定，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算被測物質(zhì)的濃度，并計算其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，考察被測物質(zhì)在測試溶液中放置24 h內(nèi)的穩(wěn)定性（環(huán)境溫度25℃）。

1.6 基質(zhì)效應(yīng)評價

定量測定空白基質(zhì)提取液配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液與20%乙醇溶液中相同質(zhì)量濃度待測物的離子響應(yīng)強(qiáng)度，計算二者相對比值評價其基質(zhì)效應(yīng)：

式中：A和B分別為20%乙醇溶液配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液與空白基質(zhì)液配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化結(jié)果

配制質(zhì)量濃度為100 ng/mL的15 種生物堿的單標(biāo)溶液，采用針泵注射的方式將標(biāo)準(zhǔn)溶液泵入質(zhì)譜，優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)。生物堿大都含有雜環(huán)原子，在正離子模式下易得到一個H+形成準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+，所以實(shí)驗選用正離子模式。采用全掃描模式找到母離子，通過子離子掃描模式選擇響應(yīng)較高的兩個碎片離子，對碰撞能、去簇電壓等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。最終選定母離子與豐度較高，干擾較小的1 對特征子離子進(jìn)行定性分析，選擇其中響應(yīng)值高的作為定量離子。

2.2 色譜柱的選擇及分離條件的選擇結(jié)果

考察3 種色譜柱（Waters Xbridge BEH C18（2.1 mm×100 mm，2.5 μm）；Thermo Accuore-150 C18（2.1 mm×100 mm，2.5 μm）和資生堂Capcell PAK C18（2.1 mm×100 mm，2 μm））對15 種生物堿的分離效果。結(jié)果表明，使用Thermo C18柱時檳榔堿和毛果蕓香堿沒有基線分離，士的寧、馬錢子堿、阿托品也沒有基線分離；使用資生堂色譜柱時，15 種生物堿峰形良好，但峰面積普遍偏低；使用Waters C18時，15 種生物堿實(shí)現(xiàn)了基線分離，并且峰形良好，峰響應(yīng)也有所提高，因此選擇Waters Xbridge BEH C18柱。

本研究對比了甲醇-水體系、甲醇-0.1%甲酸溶液體系、乙腈-水體系、乙腈-0.1%甲酸溶液體系作為流動相時15 種生物堿的色譜行為和質(zhì)譜響應(yīng)。結(jié)果表明，流動相中含有0.1%甲酸溶液時，儀器信號響應(yīng)明顯高，因此選擇含0.1%甲酸溶液的體系；有機(jī)相為乙腈時，色譜柱的柱壓比有機(jī)相為甲醇時低，并且有機(jī)相為乙腈時分析物的峰形相對更好。因此選擇乙腈-0.1%甲酸溶液作為流動相。

為實(shí)現(xiàn)15 種生物堿的基線分離，考察不同梯度條件下的分離情況。C18柱對毛果蕓香堿幾乎沒有保留，不同梯度條件下毛果蕓香堿的保留時間變化不大。檳榔堿和毛果蕓香堿、士的寧、馬錢子堿、阿托品的出峰時間比較接近，為實(shí)現(xiàn)基線分離，需要比較平緩的梯度；次烏頭堿、烏頭堿結(jié)構(gòu)類似，保留時間也比較接近。通過改變梯度洗脫條件，最終實(shí)現(xiàn)了15 種生物堿的基線分離，最終優(yōu)化的梯度洗脫條件見表1。在優(yōu)化好的洗脫條件下，分離情況最差的檳榔堿和毛果蕓香堿的分離度達(dá)1.8，能滿足定量分析要求。玉米基質(zhì)中15 種生物堿的總離子流圖（添加量100 μg/kg）見圖1。

圖1 玉米基質(zhì)中15 種生物堿的總離子流圖（添加量100 μg/kg）Fig. 1 Total ion chromatogram of 15 alkaloids in corn samples at spiked level of 100 μg/kg

2.3 試樣前處理條件的選擇和優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 提取溶劑的選擇

文獻(xiàn)[31]報道采用酸性溶液振蕩，超聲提取后用三氯甲烷萃取測定藥材中二萜類生物堿，另外根據(jù)大部分生物堿難溶或微溶于水、易溶于有機(jī)溶劑的特點(diǎn)選擇常用的甲醇和乙醇、乙腈有機(jī)溶劑，考察三氯甲烷、甲醇、乙醇、乙腈4 種有機(jī)溶劑的提取效果。通過標(biāo)品添加方式考察不同提取溶劑時分析物的回收率最終確定20%乙醇溶液為后續(xù)實(shí)驗的提取溶劑。

2.3.2 凈化方法的考察

由于食品基質(zhì)復(fù)雜，形態(tài)多樣，為降低基質(zhì)效應(yīng)的影響采用固相萃取柱對目標(biāo)物進(jìn)行凈化。選擇玉米粉為基質(zhì)，15 種生物堿添加量為100 μg/kg，考察陽離子交換柱的凈化效果。

經(jīng)陽離子交換柱后，秋水仙堿、鬼臼毒素沒有檢測到，表明陽離子交換柱不適合這兩種物質(zhì)；毛果蕓香堿、茄堿，回收率分別為2.9%和64.5%；馬錢子堿的回收率為75.6%，其他10 種生物堿的回收率在86.3%～110.7%之間。

后續(xù)選擇番茄、雪梨汁加標(biāo)樣品經(jīng)陽離子交換柱后進(jìn)行測定，結(jié)果與玉米粉類似。因此，該前處理過程沒有采用陽離子固相萃取柱凈化。

2.4 方法的線性范圍、檢出限和定量限

用20%乙醇溶液配制質(zhì)量濃度分別為1、2、5、10、20、50 ng/mL和100 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照質(zhì)量濃度由低到高依次進(jìn)行測定。以分析物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以分析物定量離子對的質(zhì)譜響應(yīng)值為縱坐標(biāo)，擬合曲線，得到線性回歸方程，15 種化合物的相關(guān)系數(shù)均高于0.99。阿托品的線性范圍為0.5～100 μg/L，次烏頭堿、新烏頭堿的線性范圍為1～100 μg/L，東莨菪堿、馬錢子堿、烏頭堿、秋水仙堿、士的寧、鬼臼毒素、毛果蕓香堿、檳榔堿的線性范圍為2～100 μg/L，麻黃堿、毒芹堿、茄堿、鉤吻堿的線性范圍為4～100 μg/L。采用加標(biāo)回收的方法確定方法的檢出限和定量限，分別以3、10 倍信噪比為方法的檢出限和定量限。各生物堿的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、回歸方程、檢出限和定量限見表3。阿托品的檢出限為4 μg/kg，次烏頭堿、新烏頭堿為6 μg/kg，東莨菪堿、馬錢子堿、烏頭堿、秋水仙堿、士的寧、鬼臼毒素、毛果蕓香堿、檳榔堿為10 μg/kg，麻黃堿、毒芹堿、茄堿、鉤吻堿為20 μg/kg。阿托品的定量限為10 μg/kg，次烏頭堿、新烏頭堿為20 μg/kg，東莨菪堿、馬錢子堿、烏頭堿、秋水仙堿、士的寧、鬼臼毒素、毛果蕓香堿、檳榔堿為40 μg/kg，麻黃堿、毒芹堿、茄堿、鉤吻堿為80 μg/kg。

表3 15 種生物堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)參數(shù)Table 3 Standard curve equations, LODs and LOQs for 15 alkaloids

2.5 方法的準(zhǔn)確度和精密度實(shí)驗結(jié)果

表4 方法回收率Table 4 Recoveries of the method

續(xù)表4

由表4可知，生物堿在植物源性飲料中回收率為83.1%～119.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.05%～9.81%；糧谷類食品中回收率為82.4%～119.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.06%～9.86%；果蔬類食品中回收率為80.9%～118.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.01%～9.9%，均滿足標(biāo)準(zhǔn)檢測方法的要求。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗結(jié)果

表5 日內(nèi)穩(wěn)定性Table 5 Intra-day stability

日內(nèi)穩(wěn)定性測定結(jié)果見表5，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.78%～5.21%，符合檢測要求。

2.7 基質(zhì)效應(yīng)的評價結(jié)果

15 種生物堿質(zhì)量濃度為20 μg/L，平行測定3 次。結(jié)果顯示，各分析物的平均基質(zhì)效應(yīng)為17.5%～117.7%。評價結(jié)果見表6，阿托品、東莨菪堿、檳榔堿、士的寧、鉤吻堿基質(zhì)效應(yīng)比較明顯，實(shí)際樣品檢測時如檢出該類物質(zhì)，應(yīng)該用陰性基質(zhì)提取液配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液定量。

表6 基質(zhì)效應(yīng)Table 6 Matrix effect %

2.8 樣品檢測結(jié)果

使用本研究建立的分析方法，對典型植物源飲料、糧谷食品和果蔬等15 個樣品進(jìn)行了檢測，其中鍋巴和薯片樣品中有茄堿檢出，檢出含量分別為800.4 μg/kg和100.3 μg/kg，其他生物堿均未檢出。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗建立了食品中15 種有毒生物堿的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，研究和優(yōu)化提取條件、凈化方式、色譜-質(zhì)譜參數(shù)等指標(biāo)，對方法的檢出限、線性范圍、回收率、精密度、基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評價和驗證。經(jīng)實(shí)際樣品測定表明建立的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法適用于植物源飲料、糧谷食品和果蔬等樣品中15 種生物堿的檢測。與賀琦等[3]建立的食品（紅酒、牛奶、面包、米粉）中20 種有害生物堿含量測定的液相色譜-質(zhì)譜法相比，本方法的適用范圍更廣，對糧谷類玉米粉、面粉、鍋巴和薯片，果蔬類番茄、茄子、桃和土豆，植物源飲料類山楂汁、雪梨汁、芒果汁和王老吉等樣品進(jìn)行驗證，并且前處理過程簡單、快速，適用于主要食品中15 種有毒生物堿的快速篩查分析。本方法的建立為相關(guān)監(jiān)測機(jī)構(gòu)提供技術(shù)支撐，有利于保障消費(fèi)者健康。