張 英，李 坤，顏 琪，陳紅兵，吳志華,*

（1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2.南昌大學(xué)食品學(xué)院，江西 南昌 330031；3.南昌大學(xué)資源環(huán)境與化工學(xué)院，江西 南昌 330031；4.南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047）

花生作為一種較為普遍的食物或食品加工原料，屬于八大過(guò)敏原之一[1]，可引起嚴(yán)重的過(guò)敏反應(yīng)[2-3]，在西方發(fā)達(dá)國(guó)家，花生過(guò)敏影響約1%～3%的兒童[4-5]?；ㄉ^(guò)敏的發(fā)生機(jī)制主要為免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）介導(dǎo)的I型超敏反應(yīng)[6]，一定量的花生過(guò)敏原蛋白初次進(jìn)入患者體內(nèi)后，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生與膜表面特定受體結(jié)合的IgE，使得機(jī)體處于致敏狀態(tài)。當(dāng)相同的或相似的過(guò)敏原再次進(jìn)入機(jī)體后，會(huì)與體內(nèi)已有的IgE結(jié)合，引起多個(gè)FcεRI交聯(lián)，啟動(dòng)活化信號(hào)，導(dǎo)致肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒，釋放前列腺素、組胺等炎癥因子并出現(xiàn)炎癥反應(yīng)[1,7-9]。

因此，檢測(cè)過(guò)敏原蛋白與過(guò)敏患者血清IgE的結(jié)合能力，或者其后由過(guò)敏反應(yīng)引起的炎癥因子的釋放程度，是研究過(guò)敏原蛋白潛在致敏性強(qiáng)弱的重要指標(biāo)。對(duì)于后者，檢測(cè)炎癥因子釋放的常用方法有細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)常采用肥大細(xì)胞或嗜堿性粒細(xì)胞進(jìn)行，通過(guò)檢測(cè)過(guò)敏原刺激后細(xì)胞上清液中的組胺、β-己糖胺酶、IL-4等細(xì)胞因子的釋放、細(xì)胞內(nèi)鈣離子的變化等指標(biāo)反映過(guò)敏原的致敏能力[10-12]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也被用于食物致敏性評(píng)估，一般使用特定種類的小鼠作為研究模型。小鼠與人類有很多生理學(xué)、基因和免疫學(xué)上的相似之處，它的整個(gè)免疫系統(tǒng)與人類也非常相似，于是可以通過(guò)模擬人體過(guò)敏反應(yīng)的機(jī)制進(jìn)行過(guò)敏原致敏能力的體內(nèi)評(píng)估[13-14]。這兩種檢測(cè)方法均需要較長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間、較大的人力物力消耗和較高的操作技術(shù)要求。

檢測(cè)過(guò)敏原蛋白與過(guò)敏患者血清IgE結(jié)合能力的常用技術(shù)為酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）[15]，是一種將抗原抗體的免疫反應(yīng)和酶的催化反應(yīng)結(jié)合而建立的一門通過(guò)結(jié)合量的多少判定結(jié)合能力的技術(shù)。其中間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法較常用，但此方法的判定結(jié)果會(huì)受到較多因素的影響[16]，首先由于操作步驟繁瑣，很容易受到人為因素的影響，且多次洗板時(shí)容易發(fā)生孔間交叉污染、洗板不干凈等問(wèn)題；另外實(shí)驗(yàn)溫度也會(huì)通過(guò)加快或者減緩反應(yīng)程度影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果；同時(shí)，ELISA測(cè)定方法具有一定的檢測(cè)限，在對(duì)雜交瘤細(xì)胞上清液抗體進(jìn)行篩選時(shí)，當(dāng)抗體的平衡解離常數(shù)（即親和力常數(shù)）低于10 pmol/L時(shí)，ELISA方法將無(wú)法區(qū)分其IgE結(jié)合能力強(qiáng)弱，而生物膜干涉（biolayer interferometry，BLI）技術(shù)可以進(jìn)行較好的分辨和篩選[17]。

已有研究表明[18-19]，BLI技術(shù)檢測(cè)分子間相互作用具有分辨率高、速度快、結(jié)果精準(zhǔn)、可實(shí)現(xiàn)高通量以及不需要樣品前處理等優(yōu)點(diǎn)。更重要的是彌補(bǔ)了ELISA容易受到人為因素影響以及只能檢測(cè)抗原抗體結(jié)合量的缺點(diǎn)，BLI技術(shù)通過(guò)傳感器的連續(xù)上機(jī)檢測(cè)聯(lián)合結(jié)合速率Ka與解離速率Kd計(jì)算得到親和力常數(shù)，親和力常數(shù)越小則說(shuō)明其與血清IgE的結(jié)合能力越強(qiáng)，由此直接評(píng)估分子之間的結(jié)合能力強(qiáng)弱。

BLI技術(shù)所使用的傳感器光纖表面末端包裹一層特殊的光學(xué)膜，可以選擇性的結(jié)合相應(yīng)生物分子，通過(guò)分子與分子之間的特異性相互作用在傳感器頭部形成分子層。當(dāng)白光直射入傳感器，兩束光線將會(huì)反射到傳感器的末端。第1道光線由傳感器內(nèi)表面反射而來(lái)，第2道光線來(lái)自于分子層。這兩束光線由于生物膜導(dǎo)致的干涉現(xiàn)象造成的波長(zhǎng)變化與傳感器表面分子吸附分子質(zhì)量有關(guān)。與表面等離子共振（surface plasmon resonance，SPR）技術(shù)相比，BLI技術(shù)具有不受樣品組分變化影響的特點(diǎn)[20]，并因此應(yīng)用廣泛，如Wallner等[19]使用鏈霉親和素（streptavidin，SA）傳感器檢測(cè)重組人紅細(xì)胞生成素與3 種不同脂質(zhì)體的結(jié)合能力，發(fā)現(xiàn)1,2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-磷酰膽堿具有最強(qiáng)的結(jié)合能力。Morita等[21]檢測(cè)與大麻素具有高親和力的基因定點(diǎn)突變的Fv片段和野生型Fv片段分別與Δ9-四氫大麻酚的親和力常數(shù)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)基因突變后的Fv片段具有比野生型高10 倍的結(jié)合能力。Sun Tingwan等[22]運(yùn)用BLI技術(shù)檢測(cè)抗體自身相互作用從而可以在數(shù)小時(shí)之內(nèi)進(jìn)行大量抗體的篩選。

生物素-親和素的結(jié)合是一種很強(qiáng)的非特異性分子相互作用，能快速反應(yīng)形成穩(wěn)定的復(fù)合物[23]。本研究采用的SA傳感器表面固定有鏈霉親和素，偶聯(lián)生物素標(biāo)記的羊抗人IgE抗體，形成穩(wěn)定復(fù)合物，再特異性結(jié)合過(guò)敏患者血清IgE，之后令其與花生過(guò)敏原蛋白反應(yīng)且經(jīng)解離步驟檢測(cè)由于分子膜厚度變化引起的光譜波長(zhǎng)位移變化，即可通過(guò)計(jì)算其親和力常數(shù)KD分析結(jié)合能力大小。

本實(shí)驗(yàn)基于BLI技術(shù)利用SA傳感器、生物素化的羊抗人IgE抗體、花生過(guò)敏患者血清池以及花生蛋白建立了對(duì)花生蛋白與花生過(guò)敏患者血清IgE結(jié)合能力的檢測(cè)方法，并利用該方法對(duì)不同熱加工花生中蛋白與過(guò)敏患者血清IgE的結(jié)合能力進(jìn)行了檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生為購(gòu)自江西南昌青山湖市場(chǎng)的新鮮贛花品種。

SA傳感器（18-5019） 美國(guó)ForteBio公司；生物素標(biāo)記的羊抗人IgE抗體 美國(guó)Bio-Rad公司；花生過(guò)敏患者血清池（10 位花生過(guò)敏患者血清組成，特異性IgE的平均水平約66.5 IU/mL） 重慶曼紐艾克科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BLItz系統(tǒng) 美國(guó)ForteBio公司；1860酶標(biāo)儀、Power Pac3000迷你蛋白垂直電泳儀 美國(guó)Bio-Rad公司；FDV型超細(xì)粉碎機(jī) 中國(guó)臺(tái)灣欣鎮(zhèn)企業(yè)有限公司；LEGEND MACH 1.6R高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Thermo公司；RH basic 2 S25磁力攪拌器 德國(guó)IKA公司；GBOX-CHEMI-XRQ凝膠成像系統(tǒng) 英國(guó)Syngene公司。

1.3 方法

1.3.1 條件優(yōu)化

參考張峰等[24]的方法并略有改動(dòng)，用0.01 mol/L pH 7.2～7.4的磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）作為緩沖液，緩沖液中加入體積分?jǐn)?shù)0.1%的牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）和0.05%的Tween-20作為稀釋液，依次將生物素化的羊抗人IgE抗體、花生過(guò)敏原患者血清設(shè)置不同的濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，上機(jī)操作用量均為250 μL/孔，篩選實(shí)驗(yàn)濃度和檢測(cè)時(shí)間。

1.3.1.1 生物素標(biāo)記羊抗人IgE抗體稀釋倍數(shù)的確定

固化抗體作為生物傳感器檢測(cè)分子間相互作用中較重要的一個(gè)步驟[25]，可以提高實(shí)驗(yàn)的高效性和特異性。采用不同稀釋倍數(shù)的生物素標(biāo)記的羊抗人IgE抗體固化傳感器，比較固化信號(hào)曲線，觀察生物素標(biāo)記抗體的結(jié)合情況。

高稀釋倍數(shù)的生物素標(biāo)記抗體的結(jié)合曲線測(cè)定操作步驟為：傳感器預(yù)濕（緩沖液）10 min，平衡基線（緩沖液）30 s，固化（生物素標(biāo)記抗體）1 800 s，封阻（稀釋液）300 s，洗基線（稀釋液）30 s。

低稀釋倍數(shù)的生物素標(biāo)記抗體的結(jié)合曲線測(cè)定操作步驟為：傳感器預(yù)濕（緩沖液）10 min，平衡基線（緩沖液）30 s，固化（生物素標(biāo)記抗體）1 200 s，解離（緩沖液）120 s。

1.3.1.2 血清稀釋倍數(shù)的確定

根據(jù)已優(yōu)化的稀釋倍數(shù)稀釋生物素標(biāo)記羊抗人IgE抗體，固化傳感器，將血清稀釋5、10 倍進(jìn)行檢測(cè)，觀察信號(hào)變化。選擇較優(yōu)曲線。

操作步驟為：傳感器預(yù)濕（緩沖液）10 min，平衡基線（緩沖液）30 s，固化（生物素標(biāo)記抗體）350 s，封阻（稀釋液）300 s，洗基線（稀釋液）30 s，結(jié)合（血清）600 s，解離（稀釋液）120 s。

1.3.2 花生的熱加工

參考Zhang Wenju[26]和Sayers[27]等的方法略有改動(dòng)。將新鮮花生進(jìn)行不同形式的熱處理，分組為鮮花生未加工（XX）、鮮花生帶殼水煮（DZ，水煮15 min）、鮮花生去殼水煮（QZ，水煮15 min）、鮮花生帶殼烘烤（DH，170 ℃、80 min）、鮮花生去殼烘烤（QH，170 ℃、60 min）和鮮花生油炸（YZ，花生油150 ℃、400 s）。

1.3.3 脫脂粉的制備

參考Wu Zhihua等[28]的方法，將處理后的花生進(jìn)行去殼去紅衣得到花生仁，用液氮在超細(xì)粉碎機(jī)研磨，并用質(zhì)量體積比為1∶5的含有體積分?jǐn)?shù)0.07%的β-巰基乙醇的丙酮在4 ℃條件下磁力攪拌脫脂2 h，抽濾，重復(fù)脫脂2 次，共脫脂3 次。3 次脫脂結(jié)束后抽濾并置于通風(fēng)櫥風(fēng)干至質(zhì)量恒定即可。

1.3.4 花生蛋白的提取

參考Zhang Wenju等[26]的方法，采用Tris-HCl（20 mmol/L，pH 8.2）作為蛋白提取緩沖液，花生脫脂粉與蛋白提取緩沖液5 g/100 mL混合，于4 ℃磁力攪拌提取3 h，之后4 ℃、5 000×g離心5 min，取上清液，4 ℃、20 000×g再次離心30 min，收集上清液，用0.45 μm的濾膜過(guò)濾，并通過(guò)二喹啉甲酸（bicinchoninic acid disodium，BCA）試劑盒測(cè)定蛋白濃度。

1.3.5 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）分析

參考詹少德[29]的測(cè)定方法略有改動(dòng)。采用12%的分離膠和4%的濃縮膠制備單塊膠，蛋白樣品與上樣緩沖液1∶1混合，并煮沸加熱5 min，之后3 000 r/min離心3 min，每個(gè)樣品的上樣量為10 μL，設(shè)定條件為6 mA 30 min，12 mA 90 min，使得板中溴酚藍(lán)指示劑泳動(dòng)到板底即可關(guān)閉電泳儀。使用考馬斯亮藍(lán)染色15 min后進(jìn)行脫色，直至有清晰條帶出現(xiàn)。采用SDS-PAGE對(duì)花生蛋白進(jìn)行分離并通過(guò)灰度掃描分析其平均分子質(zhì)量，作為計(jì)算花生蛋白摩爾質(zhì)量的數(shù)據(jù)用于BLI技術(shù)分析。

1.3.6 BLI技術(shù)檢測(cè)花生蛋白與過(guò)敏患者血清IgE的結(jié)合能力

用蛋白提取緩沖液將各蛋白樣品稀釋至1 mg/mL的質(zhì)量濃度。蛋白提取緩沖液中加入體積分?jǐn)?shù)0.1%的BSA和0.05%的Tween-20作為實(shí)驗(yàn)稀釋液。根據(jù)相關(guān)研究[19-20]以及本研究的優(yōu)化條件，本實(shí)驗(yàn)的操作步驟分為線下處理和線上檢測(cè)，線下處理包括：傳感器預(yù)濕（蛋白提取緩沖液，100 μL/孔）10 min，固化（1∶100稀釋的生物素標(biāo)記羊抗人IgE抗體，100 μL/孔）23 min，封阻（實(shí)驗(yàn)稀釋液，100 μL/孔）20 min，結(jié)合（1∶10稀釋的花生過(guò)敏患者血清池，50 μL/孔）12 h，線上檢測(cè)包括：洗基線（實(shí)驗(yàn)稀釋液，250 μL/孔）60 s，結(jié)合（花生蛋白，250 μL/孔）3 600 s，解離（實(shí)驗(yàn)稀釋液，250 μL/孔）120 s。將上機(jī)數(shù)據(jù)結(jié)合各花生蛋白樣品的摩爾質(zhì)量，計(jì)算親和力常數(shù)KD（KD=Kd/Ka），親和力常數(shù)越小說(shuō)明其IgE結(jié)合能力越強(qiáng)。

1.3.7 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)花生蛋白與過(guò)敏患者血清IgE的結(jié)合能力

參考李坤等[30]的方法略有改動(dòng)。10 μg/mL未加工鮮花生蛋白作為包被抗原，空白組用PBS代替花生蛋白；熱加工花生蛋白和未加工花生蛋白作為競(jìng)爭(zhēng)抗原（質(zhì)量濃度梯度設(shè)置為0.05、0.15、0.5、1.5、5 μg/mL），陽(yáng)性對(duì)照組用PBS替代競(jìng)爭(zhēng)蛋白參與反應(yīng)，1∶80稀釋的花生過(guò)敏患者血清池作為一抗，1∶5 000稀釋的生物素標(biāo)記羊抗人IgE抗體作為二抗，用1∶100稀釋的HRP標(biāo)記的鏈霉親和素放大信號(hào)，最后加OPD溶液顯色15 min，酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)量其OD值。陽(yáng)性對(duì)照孔和實(shí)驗(yàn)組OD值均扣除空白組OD值后分別標(biāo)記為B0和B。以抑制率（抑制率/%=[1-（B/B0）]×100）值為縱坐標(biāo)，以相對(duì)應(yīng)的競(jìng)爭(zhēng)蛋白濃度為橫坐標(biāo)，繪制競(jìng)爭(zhēng)ELISA曲線，根據(jù)IC50值的大小判定花生蛋白的IgE結(jié)合能力強(qiáng)弱，IC50值越小代表其IgE結(jié)合能力越強(qiáng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 條件優(yōu)化

2.1.1 生物素標(biāo)記羊抗人IgE抗體稀釋倍數(shù)的確定

首先采用說(shuō)明書(shū)建議ELISA使用的稀釋倍數(shù)：1∶4 000、1∶8 000和1∶12 000進(jìn)行傳感器的固化30 min，得到結(jié)合曲線如圖1A所示：固化曲線的上升趨勢(shì)與稀釋倍數(shù)有良好的對(duì)應(yīng)關(guān)系，但經(jīng)過(guò)30 min的結(jié)合均未達(dá)到飽和，可能是由于固化抗體濃度過(guò)低引起的結(jié)合速率緩慢，因此選用低稀釋倍數(shù)進(jìn)行固化，用1∶20和1∶100稀釋的抗體進(jìn)行結(jié)合實(shí)驗(yàn)，如圖1B所示，在100 倍的稀釋條件下仍然可以得到明顯的且可接受的結(jié)合信號(hào)，在短時(shí)間內(nèi)可以達(dá)到平衡狀態(tài)，且不會(huì)發(fā)生明顯的解離，說(shuō)明親和素與生物素的結(jié)合在此條件下是穩(wěn)定的，考慮到試劑用量以及防止過(guò)多的抗體會(huì)產(chǎn)生擁擠，導(dǎo)致空間位阻和聚集效應(yīng)，影響后續(xù)檢測(cè)，選擇100 倍稀釋的生物素標(biāo)記羊抗人IgE抗體結(jié)合350 s進(jìn)行下一步的優(yōu)化，選用上機(jī)時(shí)間的4倍作為線下處理時(shí)長(zhǎng)（即23 min）以達(dá)到同樣的效果進(jìn)行花生蛋白與過(guò)敏患者血清IgE親和力的測(cè)定實(shí)驗(yàn)。

圖1 測(cè)定條件的優(yōu)化Fig. 1 Optimization of experimental conditions

2.1.2 血清稀釋倍數(shù)的確定

如圖1C可見(jiàn)，1∶5稀釋倍數(shù)下可能由于血清稠度的影響，結(jié)合曲線信號(hào)變化并不明顯，1∶10稀釋的血清具有明顯的結(jié)合信號(hào)。但是對(duì)進(jìn)行結(jié)合時(shí)間表征時(shí)（圖1D），結(jié)合6 h后仍未達(dá)到飽和，考慮到結(jié)合效果以及實(shí)驗(yàn)時(shí)間，本研究后續(xù)均采用10 倍稀釋的血清過(guò)夜結(jié)合的方法進(jìn)行線下預(yù)處理。

2.1.3 檢測(cè)穩(wěn)定性

圖2 檢測(cè)穩(wěn)定性評(píng)估Fig. 2 Evaluation of the stability of the method

使用1∶100稀釋倍數(shù)的抗體，進(jìn)行多個(gè)傳感器的重復(fù)實(shí)驗(yàn)，從圖2A可以看到，這些結(jié)合曲線幾乎是相互重合疊加的。對(duì)于同一個(gè)樣品蛋白（帶殼烘烤鮮花生）進(jìn)行結(jié)合實(shí)驗(yàn)（圖2B），發(fā)現(xiàn)即使單獨(dú)分析（local分析模式）數(shù)據(jù)得到的親和力常數(shù)也是無(wú)顯著性差異的，故本研究中均不設(shè)置平行組。

2.2 BLI方法與ELISA方法檢測(cè)結(jié)果的比較

圖3 不同熱加工花生的蛋白SDS-PAGE圖Fig. 3 SDS-PAGE profiles of proteins from different heat treated peanuts

表1 不同熱加工花生蛋白分子質(zhì)量Table 1 Relative molecular masses of proteins from different heat treated peanuts

圖4 BLI技術(shù)與ELISA檢測(cè)結(jié)果Fig. 4 Results of BLI and ELISA

使用SDS-PAGE分析結(jié)果（圖3，表1）計(jì)算得到的花生蛋白摩爾質(zhì)量用于BLI技術(shù)分析，得到不同熱加工花生蛋白與花生過(guò)敏患者血清IgE的結(jié)合能力情況（圖4A、B）。將BLI方法的檢測(cè)結(jié)果與間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA的檢測(cè)結(jié)果比對(duì)，BLI方法檢測(cè)各花生蛋白的IgE結(jié)合能力的大小順序?yàn)椋篩Z＞XX＞QH＞DH＞QZ＞DZ，間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)得到IgE結(jié)合能力的大小順序?yàn)椋篩Z＞XX＞QH＞QZ＞DH＞DZ（圖4C），兩者的檢測(cè)結(jié)果具有較高的匹配度，均表現(xiàn)為油炸鮮花生蛋白的IgE結(jié)合能力最強(qiáng)，帶殼水煮鮮花生蛋白的IgE結(jié)合能力最弱，去殼處理熱加工比帶殼處理熱加工花生的蛋白的IgE結(jié)合能力更強(qiáng)。用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA的測(cè)定結(jié)果IC50值作為縱坐標(biāo)，BLI技術(shù)檢測(cè)的KD值作為橫坐標(biāo)，由圖4D可以看出，兩種檢測(cè)方法的結(jié)果之間具有很好的相關(guān)性（R2=0.91），因此BLI技術(shù)在檢測(cè)不同熱加工花生蛋白與花生過(guò)敏患者血清IgE的結(jié)合能力方面具有較好的可行性，可應(yīng)用于評(píng)估花生過(guò)敏原蛋白的IgE結(jié)合能力。

相比于ELISA檢測(cè)方法，本研究得到的BLI技術(shù)操作簡(jiǎn)便，上機(jī)一個(gè)程序只需要62 min，在使用多通道進(jìn)樣設(shè)備，如OCTET RED384型號(hào)的設(shè)備時(shí)，可以同時(shí)檢測(cè)16個(gè)樣品，很容易實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)，縮短檢測(cè)時(shí)間，且有望更進(jìn)一步減少樣品需要量（最少40 μL/孔）。另外，BLI技術(shù)可以很大程度地減少人為誤差，且通過(guò)親和力常數(shù)可以更直接準(zhǔn)確地反映花生蛋白與過(guò)敏患者血清IgE的結(jié)合能力，計(jì)算簡(jiǎn)便。

2.3 熱加工對(duì)花生蛋白IgE結(jié)合能力的影響

根據(jù)人們的食用習(xí)慣，西方國(guó)家常常食用烘烤花生[5]，我國(guó)則較常食用水煮或油炸花生[26]，研究發(fā)現(xiàn)不同的加工方式會(huì)引起花生蛋白致敏性的不同[31]，故本研究將鮮花生進(jìn)行了不同的熱加工處理，包括帶殼水煮、去殼水煮、帶殼烘烤、去殼烘烤和油炸，檢測(cè)不同形式的熱加工對(duì)花生過(guò)敏原蛋白與花生過(guò)敏患者血清IgE結(jié)合能力的影響。

高溫加熱會(huì)導(dǎo)致過(guò)敏原蛋白結(jié)構(gòu)的改變主要是由于高級(jí)結(jié)構(gòu)的解聚或聚集，使過(guò)敏原蛋白失去構(gòu)象抗原表位、將表面抗原表位包埋或內(nèi)部抗原表位暴露，從而影響IgE結(jié)合活性，降低或增加其致敏性[32-33]。在水煮過(guò)程中，也可能是由于水煮時(shí)部分花生蛋白會(huì)浸出到水煮液中或加工導(dǎo)致過(guò)敏原蛋白結(jié)構(gòu)變化[34-35]，從而降低了提取得到的花生蛋白的IgE結(jié)合能力[36]。油炸花生同樣在較高溫度下制備而成，其花生蛋白的IgE結(jié)合能力升高可能與烘烤加工引起花生蛋白的IgE結(jié)合能力升高[36-37]原因相似，高溫加熱會(huì)導(dǎo)致聚合物[38]或美拉德反應(yīng)終產(chǎn)物的產(chǎn)生，也可能會(huì)導(dǎo)致新的過(guò)敏原表位的出現(xiàn)，從而提高花生蛋白的IgE結(jié)合能力[31,39]。但本研究結(jié)果均表明烘烤加工降低了花生蛋白的IgE結(jié)合能力，這可能是由于花生蛋白的提取條件會(huì)影響過(guò)敏原蛋白的提取效率[40]，影響其過(guò)敏原的含量[41]。本研究所用緩沖液在提取烘烤加工后花生脫脂粉中的高分子質(zhì)量聚合物時(shí)效果不顯著，從油炸花生中可以提取得到稍多的高于180 kDa的蛋白聚集體（圖3）。

在比較去殼水煮和帶殼烘烤兩組花生蛋白的IgE結(jié)合能力大小時(shí)，BLI方法檢測(cè)結(jié)果顯示去殼水煮較帶殼烘烤組略低，而ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示去殼水煮較帶殼烘烤組有較高的IgE結(jié)合能力，這可能與檢測(cè)方法的不同有關(guān)。在Mondoulet等[35]的研究中，采用酶標(biāo)記過(guò)敏原吸附實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定不同熱加工花生（生花生、水煮花生、烘烤花生）的IgE結(jié)合能力，發(fā)現(xiàn)水煮后花生的IgE結(jié)合能力僅為生花生的1/2，烘烤花生與生花生的IgE結(jié)合能力無(wú)明顯差別。而Maleki等[42]采用競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA法發(fā)現(xiàn)烘烤可以提高花生蛋白的IgE結(jié)合能力。由此可見(jiàn)不同的檢測(cè)方法對(duì)于花生蛋白結(jié)合IgE能力的判定存在一定的影響。

另外本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)去殼處理熱加工均比帶殼處理熱加工的花生蛋白IgE結(jié)合能力強(qiáng)，這可能是由于去殼加工與帶殼加工得到的花生結(jié)構(gòu)變化存在差異或者由于緩沖液對(duì)兩者的提取效率（圖3）不同而導(dǎo)致。

3 結(jié) 論

本研究利用BLI技術(shù)對(duì)花生蛋白與花生過(guò)敏患者血清IgE的結(jié)合能力進(jìn)行表征，優(yōu)化了檢測(cè)方法，優(yōu)化的檢測(cè)條件為抗體1∶100稀釋后固化20 min，血清1∶10稀釋后過(guò)夜結(jié)合，完成傳感器修飾。洗基線后，將1 mg/mL的花生蛋白與傳感器結(jié)合3 600 s，并解離120 s，監(jiān)測(cè)結(jié)合/解離曲線并計(jì)算親和力常數(shù)。研究顯示，BLI技術(shù)檢測(cè)結(jié)果與常用檢測(cè)方法ELISA具有較好的匹配性，二者結(jié)果的相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.91。BLI技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)過(guò)敏原蛋白與血清IgE結(jié)合能力的高通量檢測(cè)，縮減檢測(cè)時(shí)間，減少人為誤差。研究還發(fā)現(xiàn)，不同方式的熱加工會(huì)不同程度地影響花生蛋白的IgE結(jié)合能力，其中油炸鮮花生蛋白的IgE結(jié)合能力最強(qiáng)，而其他熱加工均可降低蛋白的IgE結(jié)合能力，去殼處理熱加工花生蛋白比帶殼處理熱加工花生蛋白的IgE結(jié)合能力更強(qiáng)。