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        超高壓處理對哈密瓜汁中酶活性與香氣的影響

        2018-11-28 06:52:16侯思涵裴龍英陳計巒
        食品科學 2018年22期

        侯思涵,裴龍英,陳計巒*

        (石河子大學食品學院,新疆 石河子 832003)

        哈密瓜作為新疆的特色瓜果,廣受國內外消費者喜愛。這不僅是因為哈密瓜味甘如蜜、口感細柔,更是因為哈密瓜有著獨特的清香氣味。哈密瓜特有的香氣與滋味搭配在一起,使哈密瓜有了“瓜中之王”的美譽[1-2]。

        哈密瓜香氣的形成是一個動態(tài)過程,大部分香氣產生于哈密瓜生長的后期階段。此階段哈密瓜的新陳代謝以分解為主,瓜內各種脂肪酸、氨基酸及碳水化合物作為香氣前體物質,在一些關鍵酶的作用下被催化形成不同的揮發(fā)性化合物,各種揮發(fā)物共同作用形成了哈密瓜特有的香氣[3-5]。根據前人研究[6],哈密瓜中的芳香物質主要有酯類、醇類、酮類及醛類化合物。芳香物質的形成與脂肪氧合酶(lipoxygenase,LOX)、醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase,ADH)、?;D移酶(acyltransferase,AAT)、氫過氧化物裂解酶(hydroperoxide lyase,HPL)、磷脂酶A1(phospholipase A1,PLA-1)和磷脂酶A2(PLA-2)有緊密聯(lián)系[7-10]。絕大多數(shù)水果中的香氣物質主要是由脂肪酸途徑形成的,亞油酸和亞麻酸在LOX的作用下形成氫過氧化物,再依次經HPL、ADH、AAT的作用生成對應的醛、醇、酯類物質[10-12]。所以關鍵酶活性不僅影響水果中各種物質之間的相互轉化,也會直接影響其種類和數(shù)量,進而對香味物質的形成產生影響。

        超高壓作為一種新型的非熱力殺菌技術在果蔬汁加工領域已有廣泛應用[13-15]。在達到殺菌效果的同時還能最大限度的保持果蔬原始的風味與營養(yǎng)[16-17]。本研究以哈密瓜為原料,榨汁后采用超高壓技術進行處理。利用頂空固相微萃?。╯olid-phase microextraction,SPME)、氣相色譜-質譜聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)技術測定不同超高壓條件下哈密瓜汁中香氣物質含量及關鍵酶活性[18],并結合主成分分析探究哈密瓜汁中酶活性與香氣物質之間的關系[19]。實驗可進一步明確酶活性與不同香氣物質間的作用效果,為揭示超高壓作用下香氣品質變化與酶活性之間的機制,探索超高壓在果蔬汁領域中的應用提供參考依據。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        哈密瓜(Cucumis melo var. saccharinus L.)西州蜜25號,成熟度良好且一致,于8月中旬在吐魯番采摘、石河子水果蔬菜批發(fā)市場購買。

        高錳酸鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、硼酸、乙醛、亞油酸、聚乙烯吡咯烷酮、丁醇、山梨醇、亞油酸鈉、二硫蘇糖醇、濃鹽酸、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、5,5-二硫代雙硝基苯甲酸、MgCl2、甘油、乙二胺四乙酸等試劑(均為分析純) 天津巴斯夫化學試劑公司。

        1.2 儀器與設備

        H P P.L.2-6 0 0/0.6超高壓處理設備(量程0~600 MPa,誤差±10 MPa) 天津市華泰森淼生物工程技術有限公司;普通型榨汁機 荷蘭Philips公司;DZ-400/2C抽真空包裝機 上海青浦食品包裝機械廠;Neofuge 15R臺式高速離心機 北京陽光思特生物技術有限公司:UV-Mini1240紫外-可見分光光度計 日本島津公司。

        1.3 方法

        1.3.1 哈密瓜汁的制備

        高錳酸鉀溶液清洗哈密瓜外皮,去皮、去籽,切成小塊,榨汁。8 層紗布過濾之后分裝于耐高壓塑料包裝袋內(20 mL/袋),抽真空后4 ℃冷藏備用[20]。

        1.3.2 哈密瓜汁超高壓處理

        依據課題組前期實驗結果與實驗設備的壓力范圍設定本實驗條件(350、400、450、500 MPa,10 min,45 ℃)[20,22]。將分裝好的哈密瓜汁置于壓力容器內即可進行實驗,超高壓處理完的樣品迅速在流動的自來水中冷卻并存放于4 ℃,在2 h內測定酶活性。

        1.3.3 酶活性測定

        1.3.3.1 LOX

        2 mL哈密瓜汁與6 mL LOX抽提緩沖液(pH 6.8 磷酸緩沖液)于離心管內浸提30 min后12 000×g離心30 min,上清液即為粗酶液。將2.88 mL硼酸緩沖液(pH 9.0)、0.10 mL亞油酸溶液和0.02 mL酶液均勻混合后,在波長234 nm處測定OD值,記錄3 min內OD值的變化[21-22]。

        1.3.3.2 ADH

        2 m L哈密瓜汁和6 m L A D H抽提緩沖液(p H 6.5,2-嗎啉乙磺酸-三羥甲基氨基甲烷(2-morpholinoethanesulfonic acid-tris (hydroxymethyl)aminomethane,MES-Tris緩沖液))于離心管內充分混勻浸提30 min后12 000×g離心30 min,上清液為ADH粗酶液。測定2.4 mL MES-Tris緩沖液、0.15 mL煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NADH)、0.15 mL乙醛和0.3 mL粗酶液于340 nm波長處OD值,記錄1 min內OD值變化[24]。

        1.3.3.3 HPL

        將2.00 mL哈密瓜汁和6.00 mL HPL抽提緩沖液(pH 8.5,4-羥乙基哌嗪乙磺酸(N-(2-hydroxyethyl)piperazine-N’-(2-ethanesulfonic acid),HEPES-OH緩沖液))于離心管內充分浸提30 min后15 000×g離心30 min,上清液為粗酶液。2 mL HEPES-OH緩沖液、0.75 mL反應底物液(100 mL蒸餾水、2 mL亞油酸鈉、4 mL LOX酶液)、0.15 mL NADH、0.1 mL ADH酶液、0.5 mL粗酶液反應15 s后于340 nm波長處測定OD值,記錄1 min內OD值變化情況[24]。

        1.3.3.4 AAT

        取2 mL瓜汁和6 mL磷酸緩沖液(pH 7.0)于離心管內充分浸提20 min后15 000×g離心30 min即得粗酶液。2.4 mL Tris-HCl緩沖液(pH 7.0)和0.6 mL酶液在35 ℃反應15 min后加入150 μL 5,5-二硫代雙硝基苯甲酸,室溫放置10 min在412 nm波長處測定OD值[24]。4 種酶活性以殘存酶活性計算:

        1.3.3.5 PLA-1、PLA-2

        PLA-1與PLA-2利用酶聯(lián)免疫吸附劑(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測試劑盒測定。

        1.3.4 SPME方法

        取8 mL經超高壓處理后的瓜汁加入到20 mL的頂空瓶中。添加2.1 g NaCl,在40 ℃加熱臺上平衡10 min,萃取針插入頂空瓶,保持距瓜汁液面1.5 cm,40 ℃加熱條件下萃取30 min,磁力攪拌速率100 r/min。纖維萃取頭在GC-MS聯(lián)機條件下解吸30 min[6]。

        1.3.5 GC-MS方法

        纖維頭在插孔上保持5 min以去除雜質,通過流速為40 cm/s的氦氣1 min。按5 ℃/min升至100 ℃,再按10 ℃/min升至250 ℃,保持9 min。HP5973四極桿GC-MS儀采用70 eV電子離子化模式,離子源溫度200 ℃,四極桿溫度106 ℃,連續(xù)掃描范圍m/z 33~350。數(shù)據收集用HP化學工作站軟件對照NIST庫進行,成分經過譜庫初步鑒定,再結合標樣的保留時間、質譜、實際成分和保留指數(shù)等對檢測成分進行定性分析。采用相對含量歸一化法進行定量分析[25]。

        1.4 數(shù)據處理和分析

        采用Excel 2010軟件統(tǒng)計數(shù)據,以Origin 7.5繪圖,采用SPSS 22.0軟件進行主成分分析。

        2 結果與分析

        2.1 哈密瓜汁香氣成分分析

        圖1 不同超高壓條件下哈密瓜汁中香氣物質含量的變化Fig. 1 Changes in contents of aroma compounds in Hami melon juice under different UHP conditions

        如圖1所示,未經超高壓處理的哈密瓜汁中,檢測出了36 種香氣成分,酯類14 種:乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、苯甲酸甲酯、丁酸乙酯、乙酸苯甲酯、苯甲酸乙酯、乙酸丁酯、甲酸戊酯、乙酸己酯、苯甲酸己酯、2-甲基丙酸己酯、丁酸-1-甲基丙酯、丙酸乙酯;醛類9 種:苯乙醛、反-2-庚烯醛、(反,反)-2,4庚二烯醛、順-6-壬烯醛、(反,順)-2,6壬二烯醛、反-2-壬烯醛、正癸醛、2,6,6-三甲基-1-1環(huán)己稀醛、3,7-二甲基-2,6辛二烯醛;醇類6 種:2-乙基-1-己醇、順-2-辛烯-1-醇、4-甲基-1-(1-甲基乙基)-3-環(huán)己稀醇、(6順)-1-壬烯醇、2,6-二甲基環(huán)己醇、3,5-二甲基環(huán)己醇;酮類3 種:3-壬酮、2,2,6-三甲基環(huán)己酮、十一烷酮;其他類4 種:二甲基巰基乙酸、6-甲基-5-庚烯、萘、1-甲基萘。經由超高壓(350、400、450、500 MPa)處理的哈密瓜汁與未處理瓜汁相比酯類物質減少,其相對含量分別為16.3%、14.1%、12.9%、11.3%;醛類、醇類物質有所增加,相對含量分別為43.8%、42.3%、37.9%、35.1%和8.68%、7.98%、7.01%、6.68%;酮類物質無明顯變化,相對含量分別為0.55%、0.51%、0.44%、0.48%。說明超高壓處理過后的哈密瓜汁,在香氣組成上會發(fā)生改變。

        壓力在400~500 MPa之間,醇類物質的含量隨著壓力的增加呈下降趨勢,且低于新鮮瓜汁。一方面可能是由醇酸的酯化反應引起的,另一方面可能是因為超高壓有利于增加醇-水締合程度[26]。酯類物質均隨著壓力的升高呈現(xiàn)下降趨勢,這可能是超高壓作用使壓力釜內溫度隨著壓強的升高而增加,進而影響了醇類物質的生成或轉化[27]。350~450 MPa處理后的醛類物質含量均高于未處理條件,可能是由于超高壓作用破壞了糖苷鍵,使醛類物質得到了釋放[28]。

        2.2 關鍵酶活性分析

        表1 不同超高壓下哈密瓜汁中6 種酶活性變化Table 1 Enzymatic activity in Hami melon juice under different UHP conditions

        如表1所示,哈密瓜汁中關鍵酶活性隨著壓力的上升大體呈下降趨勢。與350 MPa相比,500 MPa條件下LOX、ADH、AAT、HPL、PLA-1、PLA-2活性分別下降79%、0%、2.8%、43%、100%、50%。這與李汴生等[29]對荔枝汁中的多酚氧化酶活性研究結果基本一致,多酚氧化酶活性隨著壓力的升高而下降。哈密瓜汁中ADH、AAT與PLA-2活性在壓力為400、450 MPa時被激活,酶活性上升。柳青等[30]的研究表明200 MPa與300 MPa條件下草莓汁中果膠甲酯酶、多酚氧化酶活性出現(xiàn)不同程度的激活。這可能是因為處理壓力及溫度使酶結構組分達到了一個相對穩(wěn)定的狀態(tài),從而抵消了壓力的作用[31],也有可能是各種同工酶對壓力耐受性引起的[32]。與此同時哈密瓜汁中醛、酯、醇類物質含量的改變也會對瓜汁中AAT活性產生影響[33-34]。結合圖1可看出,隨著壓力增大,酶活性整體下降的同時香氣物質也隨之減少,酯、醛、酮、醇相對含量在500 MPa比350 MPa分別減少4%、10.7%、3%、0.27%。這種現(xiàn)象說明在超高壓條件下香氣物質與關鍵酶活性的變化有關,酶活性與香氣物質的生成具有一定的相關性。

        2.3 6 種酶活性與香氣物質的主成分分析

        為進一步探究酶活性與香氣物質之間的關系,以6 種酶活性及酮、醛、酯、醇類物質相對含量為原始變量,利用SPSS軟件進行主成分分析后得出10 個獨立的主成分及其特征值,如表2所示。主成分的特征值越大,代表此主成分所反映的原始變量信息越多。根據此標準提取F1和F2主成分,這2 個主成分累計貢獻率達97.39%,且兩個主成分的特征值均大于1??梢娺@兩個主成分幾乎可以反映全部原始數(shù)據的變化趨勢,因此可以利用主成分F1和F2代表所有原始信息進行分析。

        表2 主成分及其特征值Table 2 Principal components and their eigenvalues

        表3 酶與香氣物質的主成分載荷矩陣Table 3 Principal component loading matrix

        由表2和表3可知,第1主成分的貢獻率為75.56%,反映的指標主要有醛、酮、醇、酯及LOX與PLA-1活性。第2主成分貢獻率為21.83%,主要體現(xiàn)了ADH、HPL、AAT與PLA-2活性的作用。根據2 個主成分的特征值與載荷值計算出第1、2主成分值,以第1主成分值為橫坐標、第2主成分值為縱坐標作散點圖,如圖2所示。

        圖2 超高壓處理在主成分1和主成分2上的散點圖Fig. 2 Scatter plot of PC1 versus PC2 for key enzyme activities and aroma compounds in ultrahigh pressure treated Hami melon juice

        由圖2可知,10 種指標均分布在第1象限。LOX、PLA-1與4 種香氣物質聚在一起且對主成分1的正端貢獻較大,ADH、AAT、HPL、PLA-2與香氣物質距離較遠。這說明LOX、PLA-1與香氣物質有很強的正相關性,其他4 種酶與香氣物質的產生之間正相關較弱,但這并不代表它們與香氣物質的合成無關或者單純起促進或者抑制作用。這可能是因為酶與香氣物質、酶與酶、香氣物質之間互相影響、過程復雜。同理,主成分1與主成分2是兩個互不干擾、互不影響的成分。在主成分2中10 個指標根據距離遠近分為兩個區(qū)域,分類結果與主成分1一致。進一步證明了酶與香氣物質之間的“相似性”和“差異性”,它們是相互作用、相互影響的。主成分分析結果與脂肪酸代謝過程基本吻合,LOX作用于香氣前體物質后形成了酯、醛等物質,ADH、HPL等酶依次作用最終生成香氣物質。

        表4 主成分得分Table 4 Scores of the fi rst two principal components

        由于主成分1的累計貢獻率達75%以上,分別對4 種超高壓條件進行主成分得分分析,并做3 次平行實驗,根據表4可以看出,350 MPa組在主成分1中得分最高,位列第1位。但在主成分2中得分偏低。說明這種處理在香氣物質和LOX、PLA-1上的優(yōu)勢較大,而在其余4 種酶上的優(yōu)勢偏小。400 MPa組在主成分2中得分最高,說明此時ADH、HPL、AAT、PLA-2的優(yōu)勢大,酶活性高。450、500 MPa組在主成分1、2上的得分均靠后,說明處理過程中對香氣物質及關鍵酶活性都產生相對了不良的影響,香氣物質損失多、酶活性降低明顯,這與前文對香氣物質及酶活性的分析一致。

        3 結 論

        本研究采用SPME-GC-MS測定不同超高壓條件下哈密瓜汁中香氣物質含量的變化。結果表明超高壓會對哈密瓜汁中香氣物質含量產生影響,與未處理的哈密瓜汁相比,酯類物質有所減少,醛類物質增加,醇、酮類物質含量變化不大。6 種酶活性隨著壓力的升高大體呈現(xiàn)下降趨勢,其中ADH、AAT與PLA-2在一定條件下被激活。通過主成分分析,主成分1的貢獻率為75.56%,主成分2的貢獻率為21.83%,累計貢獻率為97.39%,2 個主成分可以代表超高壓處理下哈密瓜汁中香氣物質含量與酶活性的變化趨勢。所有原始信息在主成分中大體聚為兩類,LOX、PLA-1與香氣物質緊密結合,ADH、AAT、HPL與PLA-2聚為一類。同時,由于ADH可與醇類物質相互轉化,因而ADH和香氣物質之間的相關性最弱。表明超高壓處理對哈密瓜汁香氣物質含量及酶活性有一定影響,且不同的香氣物質和酶所受到的影響也不一樣。

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