劉建利，孫 敏，曹曉虹，張 琇，李靖宇

（北方民族大學生物科學與工程學院，發(fā)酵釀造工程生物技術國家民委重點實驗室，寧夏特殊生境微生物資源開發(fā)與利用重點實驗室，寧夏 銀川 750021）

面引子，又稱為酵子、起子、酵頭、面頭、老酵面、老面、面肥等，與國外面包制作中的酸面團類似，是我國傳統(tǒng)的饅頭、包子、餅、烤馕等面食制作中用到的發(fā)酵劑，可分為“酵子”型和“老面”型，其使用歷史最早可以追溯到漢代[1]，曾經(jīng)一段時間在面食制作中傳統(tǒng)面引子被商品酵母發(fā)酵劑取代，只有在我國北方的小部分農(nóng)村家庭仍被使用。近年來，隨著人們生活水平的提高和消費習慣轉型，采用傳統(tǒng)面引子制作的面食具有更加細致的質地、細膩的口感和更為豐富的風味重新受到消費者熱捧[2-4]。傳統(tǒng)面引子的優(yōu)勢在于其中有多種微生物，能引發(fā)的多個生化反應，混合協(xié)同發(fā)酵產(chǎn)生復雜的風味物質[5-8]。因此，利用現(xiàn)代生物技術闡明傳統(tǒng)面引子中的微生物種類及其作用機制成為研究熱點[9-12]。以前的研究大多集中于采用分離培養(yǎng)方法對其中的酵母菌和乳酸菌進行研究[13-16]，偶爾也有采用聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技術的報道[17-20]。

高通量測序是最近發(fā)展的新一代測序技術，由于其具有測序數(shù)據(jù)量大、可同時分析多個樣品的優(yōu)勢。近年來，已成為分析食品微生物多樣性、評價食品發(fā)酵和貯藏過程中微生物群落結構變化、監(jiān)測食源性病原菌動態(tài)特征以及控制食品質量等食品微生物分子生態(tài)學研究的首選方法，已成功應用于開菲爾、泡菜、奶酪、酸奶、啤酒、葡萄酒、發(fā)酵香腸、酸面包、發(fā)酵魚等食品中微生物群落結構的演替規(guī)律的研究[21-24]。陳星星[25]采用高通量測序技術分析了面引子中的細菌菌群結構，但鮮有用高通量測序研究面引子中真菌群落的報道，因此，本實驗擬采用高通量測序技術揭示來自不同地區(qū)民間傳統(tǒng)面引子中真菌菌群落結構，為保護傳統(tǒng)面引子和開發(fā)工業(yè)化面引子提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實驗的酵子樣品從我國北方的7 個省采集，18 個樣品分別來自于我國河北省、山東省、河南省、陜西省、山西省、甘肅省和吉林省，基質均為小麥，具體地區(qū)與樣品情況見表1。

表1 樣品信息Table 1 Information about the samples

Power Fecal?DNA Isolation Kit基因組DNA提取試劑盒美國MoBio公司；TransGen AP221-02 TransStart FastPfu DNA Polymerase 北京全式金生物技術有限公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒 美國Axygen公司；TruSeqTMDNA Sample Prep Kit 美國Illumina公司；引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2 儀器與設備

Nanodrop2000超微量分光光度計 美國Thermo Scientific公司；GeneAmp?9700型PCR儀 美國ABI公司；QuantiFluor?-ST藍色熒光定量系統(tǒng) 美國Promega公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA抽提

參照基因組DNA提取試劑盒說明提取樣品中總基因組DNA，超微量分光光度計檢測DNA純度和濃度；1%瓊脂糖凝膠，5 V/cm電壓，時間20 min檢測DNA完整性。

1.3.2 PCR擴增

20 μL反應體系：5×FastPfu Buffer 4 μL；2.5 mmol/L dNTPs 2 μL；Forward Primer（5 μmol/L）0.8 μL；Reverse Primer（5 μmol/L）0.8 μL；FastPfu Polymerase 0.4 μL；牛血清白蛋白0.2 μL；Template DNA 10 ng；補ddH2O至20 μL。PCR參數(shù)：1×（95 ℃、3 min），循環(huán)數(shù)×（95 ℃、30 s；55 ℃、30 s；72 ℃、45 s），72 ℃、10 min。引物序列見表2。

表2 引物序列Table 2 Sequences of primers used for PCR

為保證后續(xù)數(shù)據(jù)分析的準確性及可靠性，需要兩個條件，首先是盡可能使用低循環(huán)數(shù)擴增；其次保證每個樣品擴增的循環(huán)數(shù)統(tǒng)一。每個樣本3 個重復，將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后取3 μL上樣2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。使用凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris-HCl洗脫；2%瓊脂糖電泳檢測。

1.3.3 熒光定量

參照電泳初步定量結果，將P C R產(chǎn)物用QuantiFluor?-ST藍色熒光定量系統(tǒng)進行檢測定量，之后按照每個樣本的測序量要求，進行相應比例的混合。

1.3.4 文庫構建與MiSeq測序

由安諾優(yōu)達基因科技（北京）有限公司測序服務完成。

1.3.5 生物信息學分析

MiSeq測序得到的PE reads首先根據(jù)overlap關系進行拼接，對序列質量進行質控和過濾，導入交互式微生物多樣性云分析平臺（http://www.i-sanger.com/，上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司），區(qū)分樣本后進行操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類分析和物種分類學分析，基于OTU信息可以進行多種多樣性指數(shù)分析，基于分類學信息，可以在各個分類水平上進行群落結構的統(tǒng)計分析。在上述分析的基礎上，可以對多樣本的群落組成和系統(tǒng)發(fā)育信息進行多元分析和差異顯著性檢驗等一系列深入的統(tǒng)計學和可視化分析。參數(shù)設置如下：相似度為97%，按最小樣品序列數(shù)抽平樣本序列；選擇比對數(shù)據(jù)庫UNITE（Release 6.0 http://unite.ut.ee/index.php）的真菌數(shù)據(jù)庫[27]，置信度閾值為0.7；合并低于0.000 5%的OTU；物種、樣本層級聚類方式用average，分組的樣本豐度計算用均值；多重檢驗校正fdr，后檢驗Tukey；多組比較策略one-against-all。

2 結果與分析

2.1 測序樣本數(shù)據(jù)統(tǒng)計

對18 個面引子樣品的真菌ITS1區(qū)測序，質控后獲得677 306 條序列，序列平均長度為388 bp，按照97%相似度分類，共產(chǎn)生101 個OTU。

2.2 Alpha多樣性分析

Alpha多樣性指數(shù)用于研究環(huán)境中微生物的多樣性。樣品中真菌Alpha多樣性指數(shù)如表3所示，樣品中OTU的數(shù)目在30～70之間，OTU數(shù)目最低的是樣品JT1，只有30 個OTU，最高的是樣品JT17、JT15和JT8，OTU數(shù)目分別是68、67、66。

表3 樣品真菌多樣性指數(shù)Table 3 Diversity index of fungi in samples

Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)是綜合衡量物種多樣性的指數(shù)，Shannon指數(shù)值越高，Simpson指數(shù)值越低，物種多樣性越豐富，反之物種多樣性越少。18個樣品中，Shannon指數(shù)最高、Simpson指數(shù)最低的樣品為JT14和JT18，反映出樣品JT14和JT18中真菌OTU的多樣性較高，但這2個樣品的OTU數(shù)目卻不是最多，Shannon指數(shù)最低、Simpson指數(shù)最高的樣品為JT1、JT5和JT19，反映出這3 個樣品中真菌多樣性較低，但這3 個樣品的OTU數(shù)目卻不是最少，因此，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)的高低和樣品中OTU數(shù)目并不相關；總體來看，大多數(shù)酵子型面引子的Shannon指數(shù)較低，Simpson指數(shù)較高，樣品真菌OTU多樣性也較低，而大多數(shù)老面型面引子的Shannon指數(shù)較高，Simpson指數(shù)較低，樣品中OTU多樣性都較高，推測可能因為酵子型面引子樣品呈現(xiàn)較干的塊狀，存放時間較長，里面的真菌較少，或者干塊狀造成樣品DNA提取得率較低，而老面型面引是濕樣品，可能更適合微生物生長并保存。

Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)主要用于衡量樣本中的物種種類豐富度。Chao1指數(shù)主要利用只含有1條序列的OTU數(shù)目（singleton）和只含有2條序列的OTU數(shù)目（doubleton）判斷群落的物種豐富度，它對單個物種的變化更為敏感，它的數(shù)值越大，表示物種種類越多；ACE指數(shù)是通過singleton和稀有物種（出現(xiàn)次數(shù)≤10次）估算還有多少沒被發(fā)現(xiàn)的物種，當測序中singleton的比例越大，ACE值越大，樣本的真實物種種類越多。Chao1指數(shù)最高的樣品為JT8、JT15 和JT17，這3 個樣品的OTU數(shù)目也最多，Chao1指數(shù)最低的樣品為JT1，其OTU數(shù)目也最少，可以看出，與Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)不同，大多數(shù)樣品的Chao1指數(shù)大小和OTU數(shù)目正相關；ACE指數(shù)最高的樣品為JT4和JT14，ACE指數(shù)最低的樣品為JT11，其ACE指數(shù)為0，樣品JT1的ACE指數(shù)也較低，和Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)相似，ACE指數(shù)大小和樣品中OTU數(shù)目也不相關。結果中還出現(xiàn)Chao1指數(shù)最高最低的樣品和ACE指數(shù)最高最低的樣品不一致的現(xiàn)象，以及同一樣品Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)大小表現(xiàn)不一致的現(xiàn)象，可能是因為樣品總OTU中singleton、doubleton以及稀有物種在總OTU中的比例不同造成。

Shannoneven指數(shù)和Simpsoneven指數(shù)反映樣本中物種數(shù)量分布的均勻程度。Shannoneven指數(shù)最高的樣品為JT14和JT18，Shannoneven指數(shù)最低的樣品為JT1、JT5、JT9和JT19，與其Shannon指數(shù)表現(xiàn)一致。但Simpsoneven指數(shù)卻與其Simpson指數(shù)表現(xiàn)并不一致，雖然樣品JT14和JT18的Simpsoneven指數(shù)最高，但其余樣品的Simpsoneven指數(shù)均很低?？傮w看，只有樣品JT1的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)都顯示其真菌多樣性較低，2個豐富度指數(shù)Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)都顯示其真菌豐富度較低，2 個均勻度指數(shù)Shannoneven指數(shù)和Simpsoneven指數(shù)都顯示其真菌均勻度也較低，其余樣品的多樣性綜合指數(shù)、2 個豐富度指數(shù)、2 個均勻度指數(shù)表現(xiàn)并不完全一致，說明這些樣品中真菌種類和數(shù)量分布上有不同。

Coverage是指各樣本中低豐度OTU的覆蓋情況，其數(shù)值越高，則樣本中序列被測出的概率越高，而沒有被測出的概率越低，所有樣品真菌的Coverage值都為1，說明測序已經(jīng)較高覆蓋低豐度OTU，表明本次測序結果代表了樣本中真菌的真實情況。

2.3 物種組成

本實驗18 個樣品中出現(xiàn)的101 個OTU，屬于真菌界4 個門、9 個綱、15 個目、25 個科、38 個屬、56 個種。

圖1 門水平各樣品中真菌相對分布柱形圖Fig. 1 Relative abundances of fungi at the phylum level

在樣品中門水平分布如圖1所示，樣品中共出現(xiàn)4 個門，包括3 個已知門：子囊菌門（Ascomycota）、接合菌門（Zygomycota）和擔子菌門（Basidiomycota），1 個未鑒定（unclassified_k__Fungi）。所有樣品中子囊菌門都占優(yōu)勢，在樣品JT6中最高，占97.37%，在樣品JT18中最低，占75.1%；unclassified_k__Fungi在所有樣品中占豐度第2高；樣品JT17中還有極低比例的接合菌門和擔子菌門。

圖2 綱水平各樣品中真菌相對分布柱形圖Fig. 2 Relative abundance of fungi at the class level

在綱水平分布見圖2，樣品中共出現(xiàn)的9 個綱，包括6 個已知的綱：酵母菌綱（Saccharomycetes）、座囊菌綱（Dothideomycetes）、散囊菌綱（Eurotiomycetes）、糞殼菌綱（S o r d a r i o m y c e t e s）、銀耳綱 （Tremellomycetes）和錘舌菌綱（Leotiomycetes），2個分類不明：分類不明的接合菌（norank_p__Zygomycota）和分類不明的擔子菌（norank_p__Basidiomycota），1 個未鑒定出的真菌（unclassified_k__Fungi）。酵母菌綱在所有樣品中占優(yōu)勢，unclassified_k__Fungi依然占豐度第2高，樣品JT17、JT14、JT10和JT8中豐度第3的是座囊菌綱，樣品JT2、JT6、JT15、JT6和JT18中豐度第3的是散囊菌綱，樣品JT3、JT9和JT12中豐度第3的是糞殼菌綱；樣品JT8和JT12中豐度第4是糞殼菌綱，樣品JT15中豐度第4的是座囊菌綱，樣品JT17中豐度第4的是散囊菌綱，第5是糞殼菌綱；另外，在一些樣品中發(fā)現(xiàn)銀耳綱和錘舌菌綱。

圖3 目水平各樣品中真菌相對分布柱形圖Fig. 3 Relative abundance of fungi at the order level

在目水平分布見圖3，樣品中共出現(xiàn)的15 個目，包括13 個已知的目：酵母目（Saccharomycetales）、肉座菌目（Hypocreales）、格孢腔菌目（Pleosporales）、散囊菌目（Eurotiales）、煤炱目（Capnodiales）、座囊菌目（Dothideales）、白粉菌目（Erysiphales）、毛霉目（Mucorales）、馬拉色菌目（Malasseziales）、糞殼菌目（Sordariales）、銀耳目（Tremellales）、柔膜菌目（Helotiales）、假毛球殼目（Trichosphaeriales），2個未鑒定出：未鑒定出的真菌（unclassified_k__Fungi）和未鑒定出的座囊菌（unclassified_c__Dothideomycetes）。酵母目和unclassified_k__Fungi分別是所有樣品中占優(yōu)勢和豐度第2高的目；樣品JT3、JT9和JT12中豐度第3是肉座菌目，樣品JT6、JT14、JT16、JT17和JT18中豐度第3的是格孢腔菌目，樣品JT2和JT15中豐度第3是散囊菌目，樣品JT8的豐度第3是煤炱目，樣品JT10豐度第3是座囊菌目；另外，白粉菌目、毛霉目、馬拉色菌目、糞殼菌目、銀耳目、柔膜菌目和假毛球殼目在部分樣品中也有很低比例。

圖4 科水平各樣品中真菌相對分布柱形圖Fig. 4 Relative abundance of fungi at the family level

在科水平分布如圖4所示，樣品中共出現(xiàn)的25 個科包括17 個已知的科：酵母菌科（Saccharomycetaceae）、發(fā)菌科（T r i c h o c o m a c e a e）、假球殼科（Pleosporaceae）、小戴衛(wèi)霉科（Davidiellaceae）、隱囊菌科（Dothioraceae）、叢赤殼科（Nectriaceae）、復膜孢酵母科（Saccharomycopsidaceae）、肉座菌科（Hypocreaceae）、Trichomonascaceae、白粉菌科（E r y s i p h a c e a e）、畢赤酵母菌科（Pichiaceae）、根霉科（Rhizopodaceae）、馬拉色菌科（Malasseziaceae）、毛殼菌科（Chaetomiaceae）、德巴列酵母科（Debaryomycetaceae）、球腔菌科（Mycosphaerellaceae）和毛霉科（Mucoraceae），5 個分類不明：分類不明的肉座菌（norank_o__Hypocreales）、分類不明的銀耳菌（norank_o__Tremellales）、分類不明的酵母（norank_o__Saccharomycetales）、分類不明的柔膜菌（norank_o__Helotiales）和分類不明的假毛球殼（norank_o__Trichosphaeriales）和3 個未鑒定出：未鑒定出的真菌（unclassified_k__Fungi）、未鑒定出的酵母菌（unclassified_o__Saccharomycetales）和未鑒定出的座囊（unclassified_c__Dothideomycetes）。酵母菌科和unclassified_k__Fungi占優(yōu)勢和豐度第2；樣品JT3、JT9、JT10、JT14和JT18中豐度第3的是norank_o__Saccharomycetales，樣品JT2、JT15和JT16中豐度第3的是發(fā)菌科，樣品JT3豐度第3和第4的分別是norank_o__Hypocreales和發(fā)菌科，樣品JT6和JT17豐度第3的是假球殼科，樣品JT8中豐度第3和第4的分別是小戴衛(wèi)霉科和假球殼科，樣品JT9中豐度第4的是norank_o__Hypocreales，樣品JT10中豐度第4和第5的分別是假球殼科和隱囊菌科，樣品JT12中豐度第3的是叢赤殼科，樣品JT14中豐度第4的是假球殼科，樣品JT15中豐度第4的是復膜孢酵母科，樣品JT17中豐度第4、第5的分別是發(fā)菌科和叢赤殼科，樣品JT18中豐度第4的是假球殼科。另外，肉座菌科、Trichomonascaceae、白粉菌科、畢赤酵母菌科、根霉科、馬拉色菌科、毛殼菌科、德巴列酵母科、球腔菌科和毛霉科也被發(fā)現(xiàn)占較低比例。

圖5 屬水平各樣品中真菌相對分布柱形圖Fig. 5 Relative abundance of fungi at the genus level

在屬水平分布如圖5所示，樣品中共出現(xiàn)的38 個屬包括31 個已知的屬：酵母屬（Saccharomyces）、哈薩克酵母屬（Kazachstania）、假絲酵母屬（Candida）、有孢圓酵母屬（Torulaspora）、曲霉屬（Aspergillus）鐮刀菌屬（Fusarium）、交鏈格孢屬（Alternaria）、克魯維氏酵母屬（Kluyveromyces）、威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）、帚枝霉屬（Sarocladium）、短梗霉屬（Aureobasidium）、赤霉屬（Gibberella）、復膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）、毛霉屬（Mucor）、木霉屬（Trichoderma）、毛紅曲霉屬（Trichomonascus）、布氏白粉菌屬（Blumeria）、平臍蠕孢屬（Bipolaris）、絲孢畢赤氏酵母屬（H y p h o p i c h i a）、根霉屬（Rhizopus）、馬拉色菌屬（Malassezia）、腐質霉屬（Humicola）、布勒擔孢酵母屬（Bulleromyces）、青霉屬（Penicillium）、裸節(jié)菌屬（Talaromyces）、粉粒座孢屬（Trimmatostroma）、隱球酵母屬（Cryptococcus）、核腔菌屬（Pyrenophora）、短梗霉屬（Aureobasidium）、季也蒙畢赤酵母（Meyerozyma）和球腔菌屬（Mycosphaerella），6個未鑒定出：未鑒定出的真菌（unclassified_k__Fungi）、未鑒定出的酵母菌（unclassified_o__Saccharomycetales）、未鑒定出的小戴衛(wèi)霉（unclassified_f__Davidiellaceae）、未鑒定出的座囊菌（unclassified_c__Dothideomycetes）、未鑒定出的肉座菌（unclassified_f__norank_o__Hypocreales）和未鑒定出的肉座菌（unclassified_f__Hypocreaceae），以及其他（Others）。除樣品JT11外，酵母屬在其余所有樣品中都是優(yōu)勢屬，而樣品JT11優(yōu)勢屬是哈薩克酵母屬，占88.97%，酵母屬只是豐度其第2高的屬（7.83%）。即使優(yōu)勢屬一致的樣品，豐度第2的屬也有很大差異，樣品JT3豐度第2是假絲酵母屬（11.31%），樣品JT6豐度第2是有孢圓酵母屬（5.31%），樣品JT16中豐度第2是哈薩克酵母屬（6.72%），其余樣品中豐度第2的屬都是unclassified_k__Fungi，但在JT11、JT6、JT3、JT16這4個例外樣品中豐度第3卻是unclassified_k__Fungi；樣品JT2豐度第3的是曲霉屬（0.20%），樣品JT3豐度第4的是曲霉屬（0.19%），豐度第5的是鐮刀菌屬（0.08%），樣品JT8豐度第3和第4的屬分別是交鏈格孢屬（0.44%）和克魯維氏酵母屬（0.09%），樣品JT9中豐度第3和第4的屬分別是威克漢姆酵母屬（0.68%）和帚枝霉屬（0.15%），樣品JT10中豐度第3、第4和第5的屬分別是威克漢姆酵母屬（2%）、假絲酵母屬（0.28%）和短梗霉屬（0.12%），樣品JT12中豐度第3和第4的屬分別是赤霉屬（0.11%）和假絲酵母屬（0.02%），樣品JT14中豐度第3和第4的屬分別是假絲酵母屬（20.01%）和交鏈格孢屬（0.30%），樣品JT15中豐度第3和第4的屬分別是曲霉屬（1%）和復膜孢酵母屬（0.16%），樣品JT16豐度第4的屬是曲霉屬（0.11%），樣品JT17中豐度第3、第4、第5和第6的屬分別是交鏈格孢屬（1.92%）、曲霉屬（1.02%）、unclassified_f__Davidiellaceae（0.36%）和毛霉屬（0.12%），樣品JT18中豐度第3和第4的屬分別是假絲酵母屬（18.04%）和交鏈格孢屬（0.08%）；另外，木霉屬、毛紅曲霉屬、布氏白粉菌屬、平臍蠕孢屬、絲孢畢赤氏酵母屬、根霉屬、馬拉色菌屬、腐質霉屬、布勒擔孢酵母屬、青霉屬、裸節(jié)菌屬、粉粒座孢屬、隱球酵母屬、核腔菌屬、短梗霉屬、季也蒙畢赤酵母、球腔菌屬在部分樣品中也少量出現(xiàn)。

圖6 種水平各樣本菌群分布熱圖Fig. 6 Heatmap of fungi at the species level

在種水平分布見圖6，樣品中共出現(xiàn)的5 6 個種，包括4 1 個已知的種：釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、Kazachstania bulder、光滑假絲酵母菌（Candida glabrata）、戴爾凱氏有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）、清酒假絲酵母（Candida sake）、異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）、薩氏曲霉（Aspergillus sydowii）、玉蜀黍帚枝霉（Sarocladium zeae）、某種交鏈格孢菌（Alternaria sp.）、近平滑假絲酵母（Candida parapsilosis）、錯綜赤霉（Gibberella intricans）、出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）、帚狀曲霉（Aspergillus penicillioides）、伯頓絲孢畢赤氏酵母（Hyphopichia burtonii）、扣囊復膜孢酵母（Saccharomycopsis fi buligera）、玉蜀黍赤霉（Gibberella zeae）、侵染交鏈格孢（Alternaria infectoria）、橘青霉（Penicillium citrinum）、近平滑假絲酵母（Candida parapsilosis）、大隱球酵母（Cryptococcus magnus）、矮小假絲酵母（Candida humili）、康寧木霉（Trichoderma koningiopsis）、交織帚枝孢霉（Sarocladium implicatum）、光滑假絲酵母菌（Candida glabrata）、阿曲霉（Aspergillus amstelodami）、Trichomonascus ciferrii、禾布氏白粉菌（Blumeria graminis）、少根根霉（Rhizopus arrhizus）、赤曲霉（Aspergillus ruber）、限制性馬拉色菌（Malassezia restricta）、Bulleromyces albus、馬克思克魯維氏酵母（Kluyveromyces marxianus）、黃曲霉（Aspergillus flavus）、黑曲霉（Aspergillus niger）、Trimmatostroma cordae、小麥褐斑長蠕孢霉（Pyrenophora tritici-repentis）、季也蒙畢赤酵母（Meyerozyma guilliermondii）、塔森球腔菌（Mycosphaerella tassiana）、凍土毛霉（Mucor hiemalis）、發(fā)酵畢赤酵母（Pichia fermentans）、緊密帚枝霉（Sarocladium strictum）、Aspergillus halophilicu，14 個未鑒定出：未鑒定出的真菌（unclassified_k__Fungi）、某個種真菌（Fungi sp.）、未鑒定出的平臍蠕孢（unclassified_g__Bipolari）、未鑒定出的酵母（unclassified_o__Saccharomycetales）、未鑒定出的鐮刀菌（unclassified_g__Fusarium）、未鑒定出的赤霉（unclassified_g__Gibberella）、未鑒定出的座囊菌（unclassified_c__Dothideomycetes）、未鑒定出的小戴衛(wèi)霉（unclassified_f__Davidiellaceae）、未鑒定的腐質霉（unclassified_g__Humicola）、未鑒定出的肉座菌（unclassified_f__norank_o__Hypocreales）、未鑒定出的肉座菌（unclassified_f__Hypocreaceae）、未鑒定出的木霉（unclassified_g__Trichoderma）、未鑒定出的裸節(jié)菌（unclassified_g__Talaromyces）、分類地位未定（Incertae_sedis_sp_g__unclassified）、未鑒定出的青霉（unclassified_g__Penicillium）、未鑒定出的假絲酵母（unclassified_g__Candida）和其他（others）。除樣品JT11外，釀酒酵母是其余所有樣品中優(yōu)勢種，在樣品JT1中最高，達96.7%，在樣品JT14和JT18中較低。而在樣品JT11的優(yōu)勢種是K. bulder，釀酒酵母屬只是其豐度第2高的種。即使優(yōu)勢種都是釀酒酵母的樣品，在豐度第2的種上有很大差異，樣品JT3中豐度第2的種是光滑假絲酵母菌，樣品JT6中豐度第2的種是戴爾凱氏有孢圓酵母，樣品JT14中豐度第2是清酒假絲酵母，樣品JT16中豐度第2的是K. bulder，其余樣品中豐度第2種都是Fungi sp.；但Fungi sp.是JT3、JT6、JT11、JT14、JT16這5 個例外樣品中豐度第3的種，樣品JT18中豐度第3的是矮小假絲酵母，其余樣品豐度第3的種是unclassified_k__Fungi；在隨后的豐度第4、第5和第6的種分布上，unclassified_k__Fungi、異常威克漢姆酵母、Alternaria sp.和帚狀曲霉出現(xiàn)的頻率較高。釀酒酵母、Fungi sp.、unclassified_k__Fungi這3個種在所有樣品中都存在，而且數(shù)量也較大；K. bulder、戴爾凱氏有孢圓酵母、矮小假絲酵母、光滑假絲酵母菌、清酒假絲酵母這5 種數(shù)量較大，但只在單個樣品中出現(xiàn)；異常威克漢姆酵母、Alternaria sp.和帚狀曲霉數(shù)量相對多一些，出現(xiàn)頻率較高，在絕大多數(shù)樣品中都有分布。

2.4 樣本比較和物種差異分析

圖7 基于非加權UniFrac距離算法的NMDS圖Fig. 7 NMDS based on unweighted UniFrac distance

非度量多維尺度分析（non-metric multi-dimensional scaling，NMDS）是一種將多維空間的研究對象（樣本或變量）簡化到低維空間進行定位、分析和歸類，同時又保留對象間原始關系的數(shù)據(jù)分析方法。其特點是根據(jù)樣本中包含的物種信息，以點的形式反映在多維空間上，而對不同樣本間的差異程度，則是通過點與點間的距離體現(xiàn)的，最終獲得樣本的空間定位點圖。7 個地區(qū)、2 種類型共18 個樣品基于非加權UniFrac距離算法層級聚類圖如圖7所示，各樣品之間距離較遠，但它們之間距離關系趨勢和非加權樣本層級聚類圖很類似?？梢钥闯?，與加權UniFrac距離算法相比，非加權UniFrac距離算法聚類較松散，因此，樣品之間距離關系被稍作放大，但趨勢依然未變，依然也和樣本菌群分布bar圖和熱圖結果高度一致。再次印證了樣本層級聚類圖顯示樣品中真菌群落結構較相似，與類型和地理分布無關。

3 結論與討論

本實驗采用高通量測序技術從我國不同地區(qū)的收集18 個民間面引子樣品中發(fā)現(xiàn)101 個OTU，屬于真菌界4 個門、9 個綱、15 個目、25 個科、38 個屬、56 個種；釀酒酵母是大多數(shù)樣品中的優(yōu)勢菌；釀酒酵母、Fungi sp.、unclassified_k__Fungi這3 個種在所有樣品中都存在，而且數(shù)量也較大；K. bulder、戴爾凱氏有孢圓酵母、矮小假絲酵母、光滑假絲酵母菌、清酒假絲酵母這5個種數(shù)量較大，但只在單個樣品中出現(xiàn)；異常威克漢姆酵母、Alternaria sp.和帚狀曲霉數(shù)量相對多一些，出現(xiàn)頻率較高，在絕大多數(shù)樣品中都有分布。各樣品真菌群落結構相差不大，而且在類型和地理分布差異也不明顯。

免培養(yǎng)法以環(huán)境中的宏基因組或RNA為靶標，采用PCR結合測序技術揭示環(huán)境中的微生物多樣性，避免了傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法依賴培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件的限制，其結果能更真實地反映樣品中國微生物群落結構。PCR-DGGE是早期研究環(huán)境中微生物多樣性常用的免培養(yǎng)方法之一，張國華[28]基于真菌的ITS區(qū)通用引物28S1與5.8S引物采用PCR-DGGE法研究我國小麥主產(chǎn)區(qū)甘肅省蘭州市、安徽省合肥市、黑龍江省哈爾濱市及山西省臨汾市、河南省南陽市的面食發(fā)酵劑中真菌菌群結構，共發(fā)現(xiàn)杰丁畢赤酵母（Pichia jadinii）、異常畢赤酵母、釀酒酵母、熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）、德爾布孢圓酵母、矮小假絲酵母6 種酵母菌和一種霉菌（米根霉菌（Rhzopus oryzae）），釀酒酵母是優(yōu)勢菌種；吳斯日古冷[29]基于真菌26S rDNA D1區(qū)特異引物采用PCR-DGGE法研究內蒙古西部地區(qū)7 盟市28 份酸面團中真菌菌群結構，只檢測到6 種酵母菌，可能和擴增區(qū)域有關。高通量測序是目前最常用的研究環(huán)境中微生物多樣性的方法，本實驗通過高通量測序發(fā)現(xiàn)18 份面引子中有56 種真菌，發(fā)現(xiàn)的酵母種類比PCR-DGGE更豐富，這也是兩種方法的原理所致，但兩種方法結果都顯示釀酒酵母是大多數(shù)樣品中的優(yōu)勢菌，說明PCR-DGGE法可以主要用于優(yōu)勢菌和豐度較高的菌研究。

由于Illumina MiSeq測序長度只能在300 bp以內，本實驗選取特異性擴增真菌ITS1區(qū)測序，長度較普通真菌鑒定用的ITS全長要短的多，再加上分類參考數(shù)據(jù)庫是UNITE數(shù)據(jù)庫，其參考序列較少，因此就會出現(xiàn)本實驗結果某個種真菌（Fungi sp.）、未鑒定出的真菌（unclassified_k__Fungi）在所有樣品中都存在，而且數(shù)量也較大的現(xiàn)象，這些未鑒定到具體種的OTU，有可能是新種，也有可能由于上述技術原因，未比對出結果。

本實驗結果發(fā)現(xiàn)矮小假絲酵母、光滑假絲酵母菌、清酒假絲酵母在單個樣品中出現(xiàn)數(shù)量較大，這些菌有些是條件致病菌；Alternaria sp.和帚狀曲霉在絕大多數(shù)樣品中都有分布，數(shù)量相對多一些，出現(xiàn)頻率較高，這兩種真菌都有可能產(chǎn)生毒素；這些具有潛在危險性的菌在面引子中的安全性需要進一步研究。另外，本實驗還發(fā)現(xiàn)曲霉的其他種、木霉、赤霉、青霉等常見的腐生真菌也少量存在，有可能是污染造成。

本實驗用的樣品高通量測序結果顯示酵母菌群落結構相差不大，而且在類型和地理分布差異不明顯，表明面引子中酵母菌群落趨同明顯，下一步可以選擇更多地區(qū)的更多樣品分析，進一步印證此結論。