陳 萍，劉 璐，李曉東*，曲秀偉，王海霞，張秀秀

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，乳品科學(xué)教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030）

近年來，高血壓、糖尿病、癌癥等疾病的發(fā)病率逐年升高，其原因是攝入較多的脂肪及體內(nèi)存在過多的自由基[1]。過多的自由基會導(dǎo)致膜脂質(zhì)、酶、蛋白質(zhì)和DNA的氧化損傷[2]。食源性天然抗氧化物質(zhì)與人工合成抗氧化物質(zhì)相比，具有安全、易消化、營養(yǎng)功能等特點。

契達干酪是世界上消費最多的一種干酪，在干酪成熟過程中伴隨著一系列復(fù)雜的生化反應(yīng)，產(chǎn)生了多種生物活性物質(zhì)，使其具有較高的營養(yǎng)價值[3]。乳源性抗氧化物質(zhì)具有阻止自由基生成、清除已形成自由基和活性氧的功能，從而防止這些物質(zhì)對機體大分子的損傷[4]。牛乳發(fā)酵可以進一步促進酪蛋白中抗氧化物質(zhì)的釋放，發(fā)酵產(chǎn)生的酪蛋白衍生物可清除自由基和提高人類淋巴細胞過氧化氫酶活性和谷胱甘肽水平，這使干酪的抗氧化活性遠高于液態(tài)乳[5]。益生菌作為一種微生物，除了能將周圍某些特定物質(zhì)分解成可利用的小分子物質(zhì)，自身還有很多益生功能[6]。Zhang Yong等[7]研究了40株益生菌，證明這些菌株都有一定的抗氧化能力，能夠有效清除氧自由基。Abadía-García等[8]將干酪乳桿菌加入到農(nóng)家干酪中，發(fā)現(xiàn)益生菌能提高農(nóng)家干酪的抗氧化性。

目前，關(guān)于干酪抗氧化物質(zhì)產(chǎn)生的原因眾說紛紜。Meira等[9]提取鑒定了巴西牛乳干酪中的生物活性物質(zhì)，證實其來源于αs1-酪蛋白。Timón等[10]研究了不同凝乳酶對Burgo干酪提取物自由基清除能力的影響，結(jié)果表明植物源凝乳酶干酪具有最高的抗氧化能力。馬玲等[11]認為干酪的抗氧化性與發(fā)酵菌種有關(guān)，其結(jié)果表明干酪提取液的抗氧化效果隨菌種、成熟時間的不同而不同。Abadía-García等[8]又猜測益生菌干酪中的生物活性物質(zhì)與干酪中的活菌數(shù)有關(guān)。

因此，本實驗在保證菌株的耐酸、耐鹽性良好，適用于干酪生產(chǎn)的前提下，以水解性和抗氧化活性為指標(biāo)，篩選出水解能力較強和抗氧化能力較強的益生菌，將其分別添加到契達干酪中，比較分析干酪在成熟過程中活菌數(shù)和抗氧化活性的變化，探究益生菌自身的抗氧化能力和水解能力對干酪抗氧化性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）1.0612、鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）1.0911、L. rhamnosus 1.0385、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）1.0320、L. rhamnosus 1.0205、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）1.0357、L. helveticus 1.0618、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus casei）1.0407、雙歧桿菌（Bifidobacterium bifidum）07-300B 9 株菌是從乳中或健康的成人腸道中分離得到，經(jīng)16S rDNA技術(shù)和序列分析比對鑒定，屬于聯(lián)合國糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織聯(lián)合專家委員會規(guī)定的益生菌的菌種，并對分離后的9 株菌進行活性測定，證實其具有益生功能，現(xiàn)保存于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品重點實驗室菌種庫。

商業(yè)發(fā)酵菌種Lactococcus lactis subsp. cremoris和Lactococcus lactis subsp. lactis混合菌種、凝乳酶Stamix 1150 北京科漢森公司；生牛乳 哈爾濱市香坊農(nóng)場完達山奶源基地；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 上海華藍化學(xué)科技有限公司；鐵氰化鉀、硫酸亞鐵 天津博迪化工股份有限公司；三氯化鐵 天津市巴斯夫化工有限公司；1,10-鄰二氮菲 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；雙氧水 天津市天力化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JD500-2電子天平 沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司；VD-1320超凈工作臺 哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)公司；SYQDSX-280B手提式蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；ULTRA-TURRAX T8均質(zhì)機 德國IKA公司；數(shù)顯恒溫水浴箱 上海比朗儀器有限公司；3k15離心機 德國Sigma公司；UT-1800紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的活化與保存

MRS培養(yǎng)基于121 ℃滅菌15 min，接種實驗菌株后37 ℃培養(yǎng)24 h，傳代至活菌數(shù)為1.0×109CFU/mL，將菌液與50%滅菌甘油1∶1混合，-20 ℃凍存?zhèn)溆?。再將益生菌按體積分數(shù)2%接種到60 mL質(zhì)量分數(shù)12%脫脂乳和MRS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至活菌數(shù)為1.0×109CFU/mL。

1.3.2 益生菌初篩

1.3.2.1 益生菌耐酸能力測定

20 mL活化后的菌懸液于4 ℃、6 000 r/min離心10 min，沉淀用pH 7.0磷酸鹽緩沖液洗滌，調(diào)整菌體濃度為1.0×109CFU/mL，加入20 mL滅菌的pH 3.0鹽酸，37 ℃水浴4 h，每隔1 h取樣做活菌計數(shù)。

1.3.2.2 耐鹽能力測定

向MRS培養(yǎng)基中添加NaCl，質(zhì)量濃度分別為0、2、4、6、8 g/100 mL，121 ℃滅菌30 min后，按2%接種益生菌，37 ℃培養(yǎng)24 h后測定620 nm波長處的吸光度（A），并按式（1）計算其存活率：

1.3.2.3 蛋白水解能力測定

采用鄰苯二甲醛法對蛋白水解能力進行測定[12]，以L-亮氨酸計（mmol/L）。

1.3.2.4 抗氧化能力測定

益生菌細胞懸浮液制備：菌液在4 ℃、8 000×g離心20 min獲得菌體沉淀，用滅菌的磷酸緩沖溶液（pH 7.2）洗滌后，重懸于磷酸鹽緩沖液中并調(diào)整細胞濃度為1.0×109CFU/mL，為完整細胞懸液[13]。

菌株DPPH自由基清除率測定參照Arasu等[14]方法。測定各組吸光度（A），DPPH與磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）混合作為空白，按式（2）計算益生菌DPPH自由基清除率：

羥自由基清除率參照Wong等[15]的方法進行測定。用去離子水替代菌懸液，表示為A空白，將H2O2換成同體積的去離子水，以同樣條件培養(yǎng)并檢測，為A對照，按照式（3）計算益生菌羥自由基清除率：

還原能力測定參照王曦等[16]的方法。

1.3.3 益生菌契達干酪的制作

原料乳→標(biāo)準(zhǔn)化→巴氏殺菌（63 ℃，30 min）→冷卻（32℃）→添加發(fā)酵劑和益生菌→發(fā)酵（32 ℃，60 min）→添加CaCl2和凝乳酶→凝乳（32 ℃，90 min）→切割（1 cm3）→攪拌升溫至42 ℃（每3～5 min升高1 ℃）→保溫攪拌（30 min）→靜置（30 min）→排乳清→凝塊堆砌（每15 min反轉(zhuǎn)堆積一次，反轉(zhuǎn)7 次）→破碎與加鹽→成型壓榨→包裝、8 ℃成熟

Batch-1：發(fā)酵劑添加量為0.01%（質(zhì)量分數(shù)，下同）；Batch-2：發(fā)酵劑添加量為0.005%，抗氧化活性較好的益生菌添加量為1.2%；Batch-3：發(fā)酵劑添加量為0.005%，水解能力較好的益生菌添加量為1.2%。

1.3.4 契達干酪成分分析

總蛋白質(zhì)的測定參照GB 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測定》；脂肪測定參照GB 5413.3—2010《嬰幼兒食品和乳品中脂肪的測定》；水分測定參照GB 5009.3—2010《食品中水分的測定》；氯化鈉測定參照GB/T 12457—2008《食品中氯化鈉的測定》；pH值測定：干酪與去離子水在無菌條件下以1∶2比例均勻混合，用pH計直接測定。

1.3.5 契達干酪活菌數(shù)的測定

將10 g干酪溶于90 mL蛋白胨水中，20 000 r/min勻漿1 min，稀釋后平板計數(shù)。

1.3.6 益生菌契達干酪抗氧化活性分析

根據(jù)Gómez-Ruiz等[17]的方法制備干酪水溶性提取物。50 mg凍干樣品溶于1 mL去離子水用于DPPH自由基和羥自由基清除能力分析，15 mg樣品溶于1 mL去離子水用于還原能力測定。

DPPH自由基清除能力的測定：0.1 mL（50 mg/mL）水溶性提取物與3.9 mL新制備的60 μmol/L DPPH-甲醇溶液混合，室溫避光45 min后用在517 nm波長處測吸光度，并用去離子水代替樣品作空白[18]。羥自由基清除能力的測定：根據(jù)Liu Jun等[19]的方法。還原能力的測定：根據(jù)Duh等[20]的方法。

1.3.7 質(zhì)構(gòu)分析

參照Liu等[21]的方法進行測定。

1.3.8 感官評價

根據(jù)Ahmed等[22]的方法進行感官評價，評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 契達干酪感官評價細則Table 1 Criteria for sensory evaluation of Cheddar cheese

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 益生菌的初篩

2.1.1 益生菌耐酸實驗結(jié)果

酸是益生菌最大的脅迫之一，在干酪制作過程中，益生菌要克服低pH值環(huán)境，同時也要保證菌株在胃液中的存活率。耐酸能力的強弱可直接影響益生菌最終的成活率和功效，因此耐酸能力是評價益生菌的關(guān)鍵指標(biāo)之一。益生菌在酸性環(huán)境下的存活率如表2所示，9 株益生菌均有一定的耐酸能力，當(dāng)作用1 h 后，L. casei 1.0407、L. helveticus 1.0612和L. rhamnosus 1.0911的存活率在50%以上，作用4 h 后，這3 株均的存活率仍在10%以上。

表2 益生菌在pH 3.0的稀鹽酸中作用不同時間后的存活率Table 2 Survival rates of probiotics in HCl (pH 3.0) at different time points

2.1.2 益生菌耐鹽實驗結(jié)果

契達干酪的含鹽度較高，對益生菌的生長存在抑制作用。篩選出耐鹽益生菌性好的菌株對其在干酪中的存活率起關(guān)鍵作用。益生菌在不同NaCl質(zhì)量濃度MRS培養(yǎng)基中的存活率如表3所示，當(dāng)NaCl質(zhì)量濃度為2 g/100 mL時，除L. helveticus 1.0618外，其他菌株存活率均在90%以上，且無顯著差異。NaCl質(zhì)量濃度為8 g/100 mL時，B. bifidum 07-300B的存活率最高，L. acidophilus 1.0357、L. casei 1.0407、L. helveticus 1.0612和L. rhamnosus 1.0911這4 株菌的存活率無顯著差異（P＞0.05），具有良好的耐鹽性[23]。

表3 益生菌在不同NaCl質(zhì)量濃度MRS培養(yǎng)基中的存活率Table 3 Survival rates of probiotics in MRS at various concentrations of NaCl

2.1.3 益生菌蛋白水解能力分析

由表4可知，9 株菌中蛋白水解能力最好的4 株菌依次為L. helveticus 1.0612、L. plantarum 1.0320、L. rhamnosus 1.0385和L. acidophilus 1.0357。

表4 益生菌的蛋白水解能力分析Table 4 Analysis of protein hydrolysis degree by probiotics

2.1.4 益生菌抗氧化能力分析

表5 益生菌的抗氧化能力Table 5 Antioxidant capacities of probiotics

由表5可知，DPPH自由基清除率最高的4 株菌依次為L. casei 1.0407、L. rhamnosus 1.0911、L. plantarum 1.0320和L. acidophilus 1.0357，還原能力最好的4 株菌依次為L. rhamnosus 1.0911、L. rhamnosus 1.0205、B. bifidum 07-300B和L. casei 1.0407。

綜上所述，最終確定將水解能力較好的L. helveticus 1.0612和抗氧化性較好的L. rhamnosus 1.0911添加到契達干酪中。

2.2 契達干酪成分分析

表6 契達干酪成分分析Table 6 Analysis of chemical composition of Cheddar cheese

標(biāo)準(zhǔn)契達干酪組成成分為：蛋白質(zhì)20%～30%，脂肪20%～34%，鹽1%～3%，pH 4.7～5.3。由表6可知，3 組干酪的成分含量均在標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)，實驗組契達干酪鹽含量顯著高于空白組（P＜0.05），可能是由于實驗室規(guī)模制作干酪存在著參數(shù)的不可控性。除鹽分外其他成分均無顯著性差異，但鹽含量也在標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)。由此而知添加益生菌對干酪組成成分沒有顯著影響（P＞0.05），可進行下一步研究。

2.3 契達干酪活菌數(shù)的測定結(jié)果

圖1 契達干酪成熟過程中的活菌數(shù)Fig. 1 Viable counts of Cheddar cheese during ripening period

由圖1可知，3 組干酪在成熟過程中活菌數(shù)均呈下降趨勢，下降率分別為47.40%、22.18%和21.91%，但益生菌干酪的活菌數(shù)顯著高于空白組（P＜0.05），且在成熟末期，兩組益生菌干酪活菌數(shù)均高于7.0（lg（CFU/g）），達到益生菌食品的菌數(shù)要求，具有益生功能[24]。結(jié)果表明選實驗添加的L. helveticus 1.0612和L. rhamnosus 1.0911在干酪中均有良好的存活率。除第0和第3個月外，兩組益生菌干酪間的活菌數(shù)均無顯著差異，因此，可排除益生菌菌數(shù)對干酪抗氧化性的影響。

2.4 水溶性提取物抗氧化性的測定結(jié)果

2.4.1 DPPH自由基清除能力

圖2 契達干酪成熟過程中水溶性提取物的DPPH自由基的清除能力Fig. 2 Scavenging capacity against DPPH radical of water soluble extract (WSE) from Cheddar cheese during ripening period

由圖2可知，3 組干酪在成熟過程中，DPPH自由基的清除能力均先增大再減小，最后趨于平穩(wěn)，并在第4個月時達到最大，分別為44.38%、47.30%和51.05%，且三者間存在顯著差異（P＜0.05）。從成熟的0～4 個月內(nèi)，3 組干酪DPPH自由基清除率均顯著升高，并在第5個月呈顯著下降趨勢（P＜0.05），而在后3 個月中，每組的DPPH自由基清除率變化不顯著，但添加L. helveticus 1.0612干酪的DPPH自由基清除率顯著高于添加L. rhamnosus 1.0911干酪和空白組（P＜0.05）。這是因為L. helveticus 1.0612的水解能力強，增加了酪蛋白的降解，產(chǎn)生了更多具有抗氧化性的肽類或氨基酸[25]。Ong等[26]的實驗也表明，乳制品中的生物活性肽含量與種類受乳源種類、生產(chǎn)技術(shù)和發(fā)酵劑種類等因素的影響，因此，干酪的抗氧化性一定程度上取決于蛋白的水解程度和所用的發(fā)酵劑種類。干酪成熟期較長，在這一過程中，蛋白質(zhì)不斷降解，生成具有抗氧化性的短肽，提高了干酪的抗氧化性，而4 個月后，蛋白降解速度減慢，這些抗氧化肽又被分解成不具有抗氧化性的氨基酸，干酪抗氧化性降低。第7個月后，小肽的進一步生成和水解達到消長平衡狀態(tài)，使干酪的抗氧化性趨于穩(wěn)定。

2.4.2 羥自由基清除能力

圖3 契達干酪成熟過程中水溶性提取物的羥自由基清除率Fig. 3 Scavenging capacity against hydroxyl radical of WSE from Cheddar cheese during ripening period

如圖 3 所示，在前4 個月的成熟過程中，3 組契達干酪的羥自由基清除能力均隨時間的延長而顯著增加，在第5、6個月內(nèi)顯著下降（P＜0.05），在后3 個月內(nèi)無顯著變化。3 組干酪在第4個月時羥自由基清除能力達到最大，分別為43.86%、46.19%和49.97%。在第5～7個月內(nèi)，添加L. helveticus 1.0612干酪的羥自由基清除率顯著高于其他兩組（P＜0.05），這是因為益生菌加入后，可作為抗氧化劑與羥自由基發(fā)生反應(yīng)，阻止其與蛋白質(zhì)的結(jié)合，增加蛋白質(zhì)降解生成具有抗氧化性質(zhì)短肽的幾率，從而增加干酪的抗氧化性[27]。

同一干酪水溶提取物對不同自由基清除能力表現(xiàn)不同，是因為自由基結(jié)構(gòu)不同，與抗氧化物質(zhì)反應(yīng)方式也不同。但兩種方法都表明添加L. helveticus 1.0612和L. rhamnosus 1.0911能增強契達干酪的自由基清除力。因此，添加益生菌可以增加契達干酪的抗氧化性，相比于益生菌自身抗氧化性而言，菌株的水解能力對干酪的抗氧化活性影響較大。

2.4.3 還原能力

圖4 契達干酪成熟過程中水溶性提取物的還原能力Fig. 4 Reducing power of WSE from Cheddar cheese during ripening period

由圖4可知，3 組干酪還原能力在前5 個月均顯著增加，在第6、7個月內(nèi)顯著下降（P＜0.05），在最后3 個月內(nèi)無顯著變化，并在第5個月時達到最大值。在整個成熟過程中，添加益生菌的契達干酪還原能力顯著高于空白組（0.46）（P＜0.05），其中Batch-3（0.66）又顯著高于Batch-2（0.56）（P＜0.05），這是因為干酪隨著成熟期的延長，蛋白質(zhì)逐漸降解生成小分子肽和氨基酸等。Farvin等[28]研究結(jié)果表明，大于10 kDa的大分子片段還原能力明顯低于抗壞血酸，而小于3 kDa的低分子物質(zhì)還原能力要高于抗壞血酸，所以分子質(zhì)量越低，還原能力越強。因此，水解能力好的L. helveticus 1.0612能將酪蛋白降解為分子質(zhì)量更小的肽和氨基酸，使得契達干酪的還原能力提高。

2.5 質(zhì)構(gòu)分析結(jié)果

表7 契達干酪成熟9 個月后的質(zhì)構(gòu)分析Table 7 Texture properties of Cheddar cheese after 9 months of ripening

由表7可知，空白干酪硬度顯著高于益生菌干酪（P＜0.05），這可能是因為L. helveticus 1.0612和L. rhamnosus 1.0911的加入增加了蛋白的水解程度，使干酪在成熟過程中產(chǎn)生大量水溶性物質(zhì)，酪蛋白原來的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)被破壞，干酪結(jié)構(gòu)變得松散，硬度下降[29]。3 組契達干酪的膠黏性和咀嚼性無顯著差異。加入L. rhamnosus 1.0911干酪的彈性與空白組無顯著差異，但加入L. helveticus 1.0612干酪的彈性顯著高于空白組（P＜0.05），這可能是由于菌株特殊的胞內(nèi)酶作用，使干酪原有的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)被破壞[30]，分解產(chǎn)生的小物質(zhì)間形成更多的連接鍵，形成更多小的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，有利于保持干酪的彈性[31]。

2.6 感官評價結(jié)果

表8 契達干酪成熟9 個月后的感官評分Table 8 Sensory evaluation of Cheddar cheese after 9 months of ripening

由表8可知，添加L. helveticus 1.0612的干酪苦味評分顯著低于其他兩組（P＜0.05），可能是因為添加L. helveticus 1.0612后增強了酪蛋白的水解程度，產(chǎn)生了具有苦味的氨基酸或短肽，苦味肽的分子質(zhì)量一般較小，且具有疏水性[32]，因此苦味肽一定程度上也具有抗氧化性，所以添加L. helveticus 1.0612能增加契達干酪的抗氧化性，而控制該菌所引起的成熟契達干酪苦味增強這一問題，還有待進一步解決。

3 結(jié) 論

契達干酪成熟過程中，3 組干酪抗氧化能力均先升高、再降低、最后趨于平緩，其中DPPH自由基和羥自由基清除能力均在第4個月時達到最大，還原能力在第5個月時達到最大。L. helveticus 1.0612和L. rhamnosus 1.0911的添加可顯著提高契達干酪的抗氧化活性（P＜0.05），在契達干酪中添加水解能力較強的菌株，相比于添加本身具有良好抗氧化活性的菌株，可能會加劇干酪的蛋白水解，生成具有抗氧化能力的短肽和氨基酸，從而提高干酪的抗氧化活性。通過對益生菌干酪質(zhì)構(gòu)、感官的分析得出L. helveticus 1.0612和L. rhamnosus 1.0911的加入對契達干酪的品質(zhì)無顯著影響，但L. helveticus 1.0612的添加在增加干酪抗氧化活性的同時，會加劇酪蛋白水解，增加干酪的苦味感。