夏 玙，羅惠波,2,*，周 平，黃 丹，鄧 波，沈才萍，鄔捷峰

（1.四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院，四川 自貢 643000；

2.釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 自貢 643000；3.勁牌有限公司，湖北 大冶 435100；4.瀘州老窖股份有限公司 國家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，四川 瀘州 646000）

作為白酒釀造的糖化發(fā)酵劑，大曲與白酒風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生、風(fēng)格的形成及質(zhì)量的變化密切相關(guān)[1]。由于其開放式的制作方式，大曲中的微生物類群十分豐富，包括霉菌、細(xì)菌及酵母菌等，這些微生物能夠產(chǎn)生各種酶和風(fēng)味物質(zhì)，因此，微生物群落是決定大曲品質(zhì)的核心因素之一[2-3]。大曲中數(shù)量巨大的微生物類群的準(zhǔn)確描述和定義、功能菌的精準(zhǔn)定位、微生物與白酒釀造調(diào)控技術(shù)等研究一直是白酒釀造領(lǐng)域的重大理論和技術(shù)問題[4-5]。在此前研究中，業(yè)內(nèi)學(xué)者將分子生物學(xué)的研究融合到中國大曲微生物群落構(gòu)成的探索性研究中，并取得了一定的成果。徐占成等[6]采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性凝膠梯度電泳技術(shù)研究中溫大曲真菌群落結(jié)構(gòu)及其多樣性。羅惠波等[7]利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）-單鏈構(gòu)象多態(tài)技術(shù)研究濃香型大曲，發(fā)現(xiàn)在大曲發(fā)酵過程中可能是受溫度變化的影響，真核微生物群落多樣性呈先升高后降低，然后又升高并且基本保持穩(wěn)定的特征?？梢姶笄婢惾旱淖兓虿煌陌l(fā)酵階段、工藝呈不同的特點(diǎn)。

大曲在培菌的過程中，特別是在降溫排潮期和貯存期，常會遭受曲蟲的侵害[8-9]。本課題組建立外源加熱的大曲熱風(fēng)干燥工藝，在有助排濕的同時又能有效地殺滅曲蟲。而大曲在生產(chǎn)應(yīng)用中往往要經(jīng)過3～6個月貯存成為陳曲，一般地，在曲庫內(nèi)進(jìn)行貯存也未免于曲蟲的侵害。因此，另尋大曲貯存環(huán)境也是大曲制作的關(guān)注點(diǎn)，若在沒有曲蟲存在的自然條件下貯存可行，則可設(shè)置特定環(huán)境進(jìn)行貯存。

為探究外源熱風(fēng)干燥對大曲在貯存期帶來的相關(guān)影響，本研究采用實(shí)時熒光定量PCR和高通量測序技術(shù)，對排潮降溫期大曲進(jìn)行熱風(fēng)、自然干燥處理后，對比實(shí)驗(yàn)室貯存、曲庫貯存以及自然干燥后曲庫貯存不同處理方式下大曲的真菌微生物群落差異，以期為進(jìn)一步優(yōu)化大曲干燥工藝提供技術(shù)依據(jù)，為指導(dǎo)大曲熱風(fēng)干燥工業(yè)化應(yīng)用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大曲采集于四川瀘州市懷玉制曲生態(tài)園，于秋季10月采樣，環(huán)境溫度21 ℃。

蛋白酶K、溶菌酶、十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS） 美國Sigma公司；P7589熒光定量染料 美國Invitrogen公司；AceQ?qPCR SYBR?Green Master Mix Q112-02 南京諾唯贊生物科技有限公司；RNA、DNA檢測試劑 美國Agilent公司；MiSeq測序試劑盒 美國Illumina公司。

1.2 儀器及設(shè)備

84Y-3型風(fēng)速可控干燥箱 和成儀器儀表（昆山）有限公司；PICO 17臺式高速離心機(jī)、ABI2700 PCR儀、ABI Step-One Plus實(shí)時熒光定量PCR系統(tǒng) 上海派森諾生物科技有限公司；Tanon 2500凝膠成像系統(tǒng) 上海天能科技有限公司；TGL-16臺式高速冷凍離心機(jī) 長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；DYY-6C型電泳儀 北京六一儀器廠；2720型PCR擴(kuò)增儀 美國ABI公司；Illumina MiSeq高通量測序平臺 美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集及處理

取培菌第8天排潮降溫期的大曲進(jìn)行最佳熱風(fēng)干燥處理，同時與同一曲庫、同一存放地點(diǎn)的自然干燥大曲進(jìn)行對比。熱風(fēng)干燥分兩階段進(jìn)行，第1階段溫度為48 ℃，轉(zhuǎn)換點(diǎn)含水率為15.5%，第2階段溫度為45 ℃。自然干燥環(huán)境與曲房溫度一致，自熱排潮降溫。

曲庫中曲蟲滋生較多，與實(shí)驗(yàn)室貯存（幾乎無曲蟲）作對比。在實(shí)驗(yàn)室貯存和曲庫中貯存均在自然溫度下進(jìn)行的，溫度與環(huán)境溫度一致。將進(jìn)行熱風(fēng)干燥處理后的大曲分成2 批：一批大曲在熱風(fēng)干燥處理后直接在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行貯存，另一批大曲熱風(fēng)干燥后放回曲庫中繼續(xù)貯存。研究這3 種處理方式和3 種貯存方式的大曲在干燥前后、貯存1 個月、貯存2 個月時的差異。將干燥前的大曲批次（原曲）標(biāo)記為RG1，將進(jìn)行熱風(fēng)干燥處理后的大曲批次標(biāo)記為FK1，將在曲庫進(jìn)行自然干燥的大曲批次（與熱風(fēng)干燥同時間的大曲）標(biāo)記為ZR1；將熱風(fēng)干燥處理的大曲FK1直接在實(shí)驗(yàn)室條件下貯存1、2 個月后的大曲批次分別標(biāo)記為RG2、RG3，將熱風(fēng)干燥處理的大曲FK1在曲庫貯存1、2 個月后的大曲批次分別標(biāo)記為FK2、FK3；將大曲ZR1直接在曲庫貯存1、2 個月后的大曲批次分別標(biāo)記為ZR2、ZR3。曲樣均于-20 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 實(shí)時熒光定量PCR體系及程序

引物：18s_F（5’-ACTCAACACGGGAAAACTC-3’）和18s_R（5’-CGGAATGAACCAGACAAATC-3’），由上海派森諾生物科技股份有限公司提供。每個樣品設(shè)3 個復(fù)孔，采用20 孔，體系：0.4 μL PCR特異引物F（10 μmol/L）、0.4 μL PCR特異引物R（10 μmol/L），10 μL 2×SYBR real-time PCR premixture，1 μL DNA模板，加水至總體積20 μL。反應(yīng)程序：95 ℃、5 min，95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，共40 個循環(huán)。10 倍梯度稀釋為模板制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 目標(biāo)片段PCR擴(kuò)增及高通量測序

大曲總D N A提取采用改良的C T A B法，借助酶、反復(fù)凍融、酚-氯仿-異戊醇（體積比25∶24∶1）抽提等操作，形成復(fù)合優(yōu)化的手提方法提取大曲中微生物的總DNA[10]。用引物ITS1F（5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’）和2043R（5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’）[11]擴(kuò)增真菌的ITS1序列。PCR體系（25 μL）包括以下試劑：5 μL 5×reaction buffer，5 μL 5×GC buffer，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs，1 μL Forward Primer（10 μmol/L），1 μL Reverse Primer（10 μmol/L），2 μL Template DNA，0.25 μL Q5 DNA Polymerase和8.75 μL ddH2O。PCR條件：1）98 ℃預(yù)變性2 min；2）98 ℃變性15 s，55 s退火30 s，72 s延伸30 s，29 個循環(huán)；3）72 ℃延伸5 min，10 ℃到取出為止。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，并對目標(biāo)片段進(jìn)行切膠回收。

基因文庫測序由上海派森諾生物科技股份有限公司提供服務(wù)，用Illumina MiSeq平臺進(jìn)行高通量測序。

1.3.4 微生物信息分析

對有效序列的質(zhì)量作進(jìn)一步的評估，用于后續(xù)分析的序列[12]。將相似性大于97%的序列聚類成一個操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）[13]，并進(jìn)行物種注釋。與NCBI的GenBank進(jìn)行BLAST比對，確定真菌序列的分類信息，獲得門和屬水平下的種類及相對豐度[14]。

稀疏曲線可評判當(dāng)前測序深度是否足以反映該群落樣本所包含的微生物多樣性[15]。Alpha多樣性用Chao1、ACE、Shannon和Simpson指數(shù)計(jì)算，以評價大曲曲樣中真菌群落的生物多樣性。Beta多樣性分析，采用主成分分析（principal component analysis，PCA）方法，通過線性變換，將原始的高維數(shù)據(jù)降維、簡化結(jié)構(gòu)，從而量化樣本間的差異和相似度，從中發(fā)現(xiàn)不同樣品或樣品組間的差異[16]。

1.4 數(shù)據(jù)處理及圖像處理

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用Origin、Excel作圖，SPSS 20進(jìn)行方差分析，多重比較采用Duncans新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性的分析，以P＜0.05為差異顯著。GraPhlAn軟件構(gòu)建大曲樣本總體分類等級樹，R軟件作生物組成熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果分析

以4.287×108copies/μL為起始濃度，設(shè)置5 組10 倍稀釋濃度的標(biāo)品，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y＝-3.144 3X+45.654，R2＝0.997 3，擴(kuò)增效率為107.992%，表明不同稀釋梯度定量模板的對數(shù)值和Ct值之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線能夠準(zhǔn)確地反映目的產(chǎn)物的擴(kuò)增，且由樣品的Ct值就可算出樣品中的真菌數(shù)量。

依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算每克大曲樣品中真菌18S rRNA基因拷貝數(shù)。如圖1所示，不同處理方式大曲中的真菌18S rRNA基因拷貝數(shù)在1×1011～4.5×1011copies/g之間；ZR3拷貝數(shù)最大為4.5×1011copies/g。

圖1 不同處理方式大曲中真菌18S rRNA基因拷貝數(shù)Fig. 1 Number 18S rRNA gene copies of fungal communities in different samples

2.2 不同處理的大曲真菌Alpha多樣性

為獲取更多大曲真菌群落多樣性信息，利用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)對真菌ITS1進(jìn)行擴(kuò)增和序列比對后進(jìn)行種群多樣性分析和結(jié)構(gòu)組成。經(jīng)質(zhì)量篩選后，9 個大曲樣本真菌有效序列數(shù)總計(jì)有1 077 323 條，滿足基本分析要求，可用于進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析。

圖2 大曲樣品真菌稀釋曲線Fig. 2 Rarefaction curves of fungal communities in Daqu samples

根據(jù)序列數(shù)及其代表的OTU數(shù)繪制樣品多樣性稀釋曲線，由圖2可以看出，隨著樣品序列數(shù)的增加，可觀測物種數(shù)逐漸趨于平緩，Shannon指數(shù)值也逐漸趨于飽和，這表明測序深度合理，測序結(jié)果已足夠反映當(dāng)前大曲樣本絕大多數(shù)真菌微生物的物種信息。

不同處理方式大曲樣本的真菌群類多樣性結(jié)果見表1。97%水平下共得到OTU數(shù)為844，每個大曲樣品的OTU數(shù)都在80以上。分析被注釋到不同分類水平的真菌類群發(fā)現(xiàn)，大曲RG3的Chao1豐富度指數(shù)較高，Shannon和Simpson多樣性指數(shù)分析表明大曲RG2、RG3、ZR3的微生物多樣性較高。從工藝處理角度通過動態(tài)比較分析大曲的多樣性指數(shù)發(fā)現(xiàn)，相比RG1，不論是通過熱風(fēng)干燥工藝還是自然干燥工藝對大曲進(jìn)行處理后，大曲FK1與ZR1中真菌的豐富度指數(shù)均有所下降。通過比較ZR1、ZR2、ZR3的OTU、Chao1豐富度指數(shù)，發(fā)現(xiàn)呈先下降后上升的趨勢；而進(jìn)行熱風(fēng)干燥后的大曲，相比FK1，進(jìn)行曲庫貯存后的大曲FK2、FK3的多樣性指數(shù)均有呈先下降后上升的趨勢；進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室貯存后的大曲RG2、RG3的多樣性指數(shù)均有上升的趨勢，且比其他處理大曲的多樣性高。因此，熱風(fēng)干燥工藝對實(shí)驗(yàn)室貯存期大曲的真菌群落多樣性有一定促進(jìn)影響。

表1 不同處理方式大曲真菌多樣性指數(shù)Table 1 Diversity index of fungal communities from Daqu samples

2.3 不同處理大曲的群落組成結(jié)構(gòu)

圖3 大曲樣品中真菌在門分級水平上的種類和相對豐度Fig. 3 Relative abundance of fungal communities at phylum level

根據(jù)物種注釋結(jié)果，選取大曲在門分類水平上最大豐度排名靠前的物種，生成物種相對豐度柱形累加圖，便于直觀查看不同處理方式的大曲相對豐度較高的物種及其比例。由圖3可見，在門的分級水平上，所有大曲中共檢測出了子囊菌門（Ascomycota）和接合菌門（Zygomycota）2大門類，其相對豐度較高，占到相應(yīng)樣品總類群的99.9%以上，且在各處理后大曲中的含量不盡相同。子囊菌門在FK1和ZR1的豐度分別比RG1多11.2%、7.2%，說明在大曲干燥的過程子囊菌門的比例逐漸增加；大曲在貯存1、2個月后，子囊菌門類比例大小為ZR2＞FK2＞RG2和ZR3＞RG3＞FK3，可見在貯存期，自然干燥大曲有利于子囊菌門類生長，而熱風(fēng)干燥對其成長和繁殖存在阻礙作用。從大曲中接合菌門類相對豐度來看，接合菌門比例大小是RG1＞ZR1＞FK1，說明大曲干燥的過程接合菌門所占比例在逐漸較少，而熱風(fēng)干燥對其比例減少的可能性更大；大曲在貯存1、2個月后，接合菌門類在RG2和FK2中的相對豐度比ZR2大，在RG3和FK3中的豐度比ZR3的豐度大，說明熱風(fēng)干燥的大曲在貯存時期有利于接合菌門微生物的生長和繁殖。

構(gòu)建基于GraPhlAn的大曲樣本總體分類等級樹，從復(fù)雜的群落數(shù)據(jù)中，快速發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢微生物類群[17]。如圖4所示為從門到屬（從外圈到內(nèi)圈依次排列）所有分類單元（以節(jié)點(diǎn)表示）的等級關(guān)系，節(jié)點(diǎn)大小對應(yīng)于該分類單元的平均相對豐度。

圖4 基于GraPhlAn的大曲樣本總體分類等級樹圖Fig. 4 Overall classification based on GraPhlAn of Daqu samples

結(jié)果顯示：所有大曲樣品里，真菌微生物屬水平上有4 種相對高豐度的微生物，平均相對豐度最高的是嗜熱子囊菌屬（Thermoascus），其次是根毛霉屬（Rhizomucor）、曲霉菌屬（Aspergillus），相對較低的是假絲酵母屬（Candida）。

圖5 大曲樣品中真菌在屬分級水平上的種類和相對豐度Fig. 5 Relative abundance of fungal communities at genus level

如圖5所示，在屬的分級水平上，共檢測到19 種真菌類群，優(yōu)勢類群包括有：嗜熱子囊菌屬、嗜熱霉菌屬（Thermomyces）、根毛霉屬、曲霉菌屬、假絲酵母屬，其相對豐度占全部真菌群落的92.3%以上，其中最優(yōu)勢菌屬是嗜熱子囊菌屬，約占40.2%。

至今，嗜熱子囊菌相關(guān)研究已較成熟。它能產(chǎn)生具有高熱穩(wěn)定性和活力的纖維素酶、蛋白酶等，特別是其所產(chǎn)的過氧化氫酶是迄今為止已報道過的熱、堿穩(wěn)定性最好的[18]。張婕等[19]從嗜熱子囊菌原變種中克隆了一個幾丁質(zhì)酶同源基因，并在畢赤酵母中得到高效表達(dá)。嗜熱子囊菌能降解糖類和蛋白質(zhì)等并具有良好的熱穩(wěn)定性，有利于大曲產(chǎn)酒生香作用[20]。結(jié)果分析顯示嗜熱子囊菌屬在大曲RG2、RG3中的相對豐度為31.2%、23.9%，相比于FK2和FK3，同比低了13.6%、20.5%，相對豐度下降明顯，說明實(shí)驗(yàn)室貯存條件相比曲庫貯存會一定程度地抑制嗜熱子囊菌的生長；但在其他不同處理大曲中的生長穩(wěn)定，基本恒定，且相對豐度比例較其他真菌微生物大，說明嗜熱子囊菌在大曲真菌群落中具有較明顯的優(yōu)勢，而要保持其的優(yōu)勢，需提供曲庫的貯存條件。該結(jié)果為今后研究嗜熱子囊菌在熱風(fēng)干燥大曲中的應(yīng)用提供支持。

霉菌主要產(chǎn)糖化酶，被視為大曲糖化降解動力的主要來源[3,21]。近年有報道[22]分析了各釀造環(huán)境中曲霉的生態(tài)結(jié)構(gòu)分布。與降溫期大曲相比，曲霉菌在貯存期間表現(xiàn)出良好的生長態(tài)勢，與已報道霉菌在貯存階段活躍相一致[23]。曲霉菌在RG2、RG3中的相對豐度分別為25.5%、37.6%，相比于FK2、FK3，同比增加了11.2%、13%，隨著貯存時間的延長，曲霉菌生長越旺盛。分析可能是實(shí)驗(yàn)室貯存環(huán)境里幾乎沒有曲蟲的存在（除大曲自身所帶曲蟲外），而曲庫中曲蟲滋生，隨貯存時間延長曲蟲數(shù)量上升，曲蟲能吃掉大曲，影響了曲霉菌類的生長，并使得曲塊糖化力、液化力下降[24]。說明實(shí)驗(yàn)室的貯存環(huán)境相比于曲庫更有利于曲霉菌的生長。

假絲酵母屬是大曲發(fā)酵過程重要的真菌之一，主要產(chǎn)酒精和脂類物質(zhì)[25]。在進(jìn)行干燥排潮后的大曲，假絲酵母屬在FK1、ZR1的相對豐度分別為22.3%、17.7%，均遠(yuǎn)大于在RG1中的豐度，表明當(dāng)溫度降到45℃左右時，酵母菌類活動明顯，數(shù)量增加，說明干燥工藝后的環(huán)境更利于假絲酵母生長，與已報道降溫期酵母的數(shù)量有所上升一致[26]；在貯存1、2個月后，其豐度大小為FK2＞FK3、ZR2＞ZR3，隨貯存時間的延長而減少，可能是受到其他微生物競爭抑制的影響。

2.4 大曲真菌在屬水平上的微生物組成熱圖

根據(jù)屬水平上的物種注釋及豐度信息，選取豐度排名靠前的真菌屬及其在每個樣品中的豐度信息，從物種和曲樣兩個層面進(jìn)行聚類，繪制成熱圖。根據(jù)顏色梯度反映不同大曲的真菌群落相似差異性及物種聚類關(guān)系。不同處理的大曲真菌在屬水平上的微生物組成熱圖如圖6所示，反映了不同處理大曲樣品的相同性和差異性。

圖6 不同處理大曲真菌在屬水平上的微生物組成熱圖Fig. 6 Heat map showing fungal composition from Daqu samples with different treatments

由圖6上端的樣本間聚類看出，所有樣品大致分為4 組。大曲RG3根據(jù)豐度信息單獨(dú)聚類為一大組；其他8 種大曲聚類為一大組，表明了8種大曲之間類似的群落結(jié)構(gòu)，其中，ZR2的真菌群落獨(dú)立為一組，大曲RG2和ZR3近似，F(xiàn)K1、FK3、RG1、ZR1、FK2聚類成一組。

另外，從圖6左端物種聚類可以看出，根霉菌屬（Rhizopus）、嗜熱子囊菌屬、根毛霉屬在大曲RG1、ZR1中的比例很高。但相對于RG1，經(jīng)過自然干燥后的大曲ZR1，柯達(dá)酵母屬（Kodamaea）、生絲畢赤酵母屬（Hyphopichia）、假絲酵母屬的比例均有所增加，說明自然排潮降溫，曲房中的濕度和溫度的調(diào)節(jié)后，酵母群類微生物生長旺盛；但人為的熱風(fēng)干燥處理不利于大多數(shù)真菌微生物的生長，只有假絲酵母屬的數(shù)量有所增加。從貯存方式來看，相比于大曲ZR1，大曲ZR2中的擬青霉屬（Paecilomyces）、支頂孢屬（Acremonium）增加明顯；大曲ZR3中嗜熱子囊菌屬、Rasamsonia、生絲畢赤酵母屬（Hyphopichia）成為優(yōu)勢菌群。值得注意的是，耐鹽真菌（Wallemia）、絲衣霉菌屬（Byssochlamys）、青霉菌屬（Penicillium）、曲霉屬是大曲RG3中的主要真菌群類，其比例也遠(yuǎn)大于其他大曲。

2.5 PCA結(jié)果

按干燥和貯存處理的不同，將9 個大曲樣品分成3 個組，分別是RG1、FK1和ZR1為組A，RG2、FK2和ZR2為組B，RG3、FK3和ZR3為組C。

圖7 不同處理方式大曲中真菌微生物群落組成PCAFig. 7 Principal component analysis of fungal communities from Daqu samples with different treatments

由圖7可以看出，運(yùn)用PCA方法比較不同處理方式的大曲，可獲得兩個主成分，主成分1的貢獻(xiàn)率為77.16%，主成分2的貢獻(xiàn)率為12.04%，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到89.2%，因此主成分1和主成分2基本可以全面反映研究區(qū)域真菌微生物群落情況并將不同處理方式的大曲真菌群落區(qū)分開來。大曲樣品RG1和ZR1聚集，F(xiàn)K1雖落點(diǎn)較遠(yuǎn)，但根據(jù)主成分1（貢獻(xiàn)率達(dá)到77.16%）可以將FK1與RG1、FK1聚成一類，說明熱風(fēng)干燥工藝對大曲的真菌微生物群落有一定影響但影響較小；FK3、ZR3聚集，說明基于熱風(fēng)干燥工藝并返回曲庫貯存這一處理方式的大曲與自然干燥自然貯存的大曲差異不明顯；而RG3落點(diǎn)相對較遠(yuǎn)，說明熱風(fēng)干燥后經(jīng)實(shí)驗(yàn)室貯存2 個月的大曲真菌群落有較大的變化。

3 結(jié) 論

通過燈光誘捕、使用藥劑等處理大曲制作環(huán)境，治理效果顯著[27-29]，其中外源熱風(fēng)干燥工藝可以完全殺滅曲蟲，考慮到此工藝以及曲塊在不同貯存環(huán)境（是否避開存在曲蟲的曲房貯存）可能會對大曲中真菌群落產(chǎn)生影響，因此本研究對不同處理方式的大曲的真菌群落進(jìn)行了探索。采用熒光定量PCR和Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)，研究排潮降溫期大曲通過熱風(fēng)、自然干燥處理，對比實(shí)驗(yàn)室貯存、曲庫貯存9種不同處理方式的大曲在真菌群落之間的差異。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同處理方式大曲中的真菌18S rRNA基因拷貝數(shù)在1×1011～4.5×1011copies/g之間；ZR3拷貝數(shù)最大為4.5×1011copies/g?；诖笄恼婢鄻有灾笖?shù)分析，大曲RG2、RG3、ZR3的多樣性較高。屬水平上相對豐度的解析中，不同處理大曲的優(yōu)勢真菌類群均為嗜熱子囊菌屬、根毛霉屬、曲霉菌屬、假絲酵母屬。其中嗜熱子囊菌屬在大曲真菌群落中具有明顯的優(yōu)勢，若要保持其優(yōu)勢，需提供曲庫的貯存條件；而實(shí)驗(yàn)室貯存環(huán)境相比于曲庫更有利于曲霉菌屬類的生長；干燥工藝后的環(huán)境更利于假絲酵母屬類生長。

PCA可看出基于熱風(fēng)干燥工藝并返回曲庫貯存這一處理方式的大曲與自然干燥自然貯存的大曲差異不明顯；而大曲RG3落點(diǎn)相對較遠(yuǎn)，再結(jié)合微生物組成熱圖可分析大曲RG3中耐鹽真菌、絲衣霉菌屬、青霉菌屬、曲霉屬在大曲RG3中的比例遠(yuǎn)大于其他大曲，是大曲RG3區(qū)別于其他大曲的主要真菌群類，說明熱風(fēng)干燥工藝以及熱風(fēng)干燥后經(jīng)過2 個月實(shí)驗(yàn)室貯存的大曲中真菌群落有較大的變化，差異性明顯，故此類大曲有進(jìn)一步研究的價值，為后續(xù)研究提供參考。