王向陽，顧 雙，楊 玲

（浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310018）

橘霉素是真菌產(chǎn)生的一種次級代謝產(chǎn)物，主要由紅曲霉、青霉和部分曲霉產(chǎn)生[1]。橘霉素對腎臟具有強(qiáng)烈的毒性[2]，還具有細(xì)胞毒性[3-4]，能增加人體過敏反應(yīng)[5]，具有致畸性和胚胎毒性[6]，還能損害肝的代謝，有致癌性，可誘發(fā)突變等[7]。1991年，橘霉素被國際生命科學(xué)院自然毒素檢測委員會歐洲分會列為必須檢測的毒素之一；2012年3月歐洲食品安全局食物鏈污染物科學(xué)專家組認(rèn)為橘霉素是腎毒素，且橘霉素在果汁和蔬菜汁[8]、小麥[9]、紅曲米[10]和釀酒用曲[11]中均有發(fā)現(xiàn)。目前從青霉素中發(fā)現(xiàn)2 個橘霉素衍生物pencitrin和pencitrinol，其基團(tuán)和橘霉素差異較大，另外還有橘霉素的二聚體[12]。

高效液相色譜（h i g h p e r f o r m a n c e l i q u i d chromatography，HPLC）法是目前檢測橘霉素最普遍的方法，另外還有高液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[13]、超高液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜[14-15]和熒光比色法[16]。免疫親和層析常與高效液相色譜-熒光檢測器（high performance liquid chromatography with fluorescence detector，HPLC-FLD）聯(lián)用。GB/T 5009.222—2008《紅曲類產(chǎn)品中桔青霉素的測定》和SN/T 2916—2011《出口食品中桔霉素的測定方法 免疫親和柱凈化-高效液相色譜法》橘霉素的測定，都是采用免疫親和柱對樣品進(jìn)行去雜純化，再進(jìn)行HPLCFLD檢測[17-18]。美國維康公司等提供橘霉素免疫親和柱，價格昂貴、保存條件苛刻，且保質(zhì)期短，其制作方法未見報道。橘霉素能進(jìn)入環(huán)狀糊精內(nèi)部空間，增強(qiáng)穩(wěn)定性[19]，如果進(jìn)行較長時間浸泡，可能會吸附較多橘霉素，未來或可作為橘霉素的一種富集純化的手段。

陳福生等[20]用蛋清白蛋白-橘霉素連接物免疫小白鼠，制備單克隆抗體，建立酶聯(lián)免疫吸附實驗（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）法檢測紅曲樣品橘霉素含量。Duan Zhihui等[21]合成橘霉素人工抗原，免疫母雞，從雞蛋中提取和純化得到抗體，建立ELISA法檢測橘霉素。Abramson等[22]將橘霉素與匙孔血藍(lán)蛋白偶聯(lián)制備人工抗原免疫兔子，獲得多克隆抗體，建立ELISA測定大麥中的橘霉素。汪媛媛等[23]利用雙交聯(lián)法制備橘霉素-蛋白質(zhì)偶聯(lián)抗原免疫小鼠獲得多克隆抗體，建立ELISA檢測橘霉素。Kononenko等[24]制得葡萄糖氧化酶-橘霉素偶聯(lián)抗原和牛血清白蛋白-橘霉素抗原，得到兔抗血清，建立檢測橘霉素的ELISA方法。

前人大多研究用橘霉素人工抗原免疫小鼠、兔子等獲得抗體，但用牛蛙制備抗體用于免疫檢測或免疫親和實驗還鮮見報道。本研究前期實驗發(fā)現(xiàn)，橘霉素直接注射牛蛙肌肉蛋白對橘霉素的吸附量比對照僅提高5%～15%，而使用橘霉素人工抗原免疫牛蛙后，其肌肉蛋白對橘霉素的吸附量比對照提高100%以上。說明其具有很好的吸附作用，且牛蛙肌肉蛋白量遠(yuǎn)比血清多，也容易獲得。海藻酸鈉常被用作固定化酶的載體[25]，其與鈣離子形成凝膠微球，具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，被稱為“egg-box”結(jié)構(gòu)[26]，固定化可減少混入的蛋白酶對牛蛙肌肉蛋白的分解。本研究將牛蛙肌肉蛋白用海藻酸鈉包埋制粒后制柱，可用于樣品中橘霉素檢測的純化預(yù)處理，然后與HPLC-FLD相結(jié)合，用于食品中橘霉素的檢測，其成本遠(yuǎn)比市售免疫親和柱低。目前橘霉素標(biāo)準(zhǔn)品很貴，化學(xué)脫除橘霉素的方法對食品品質(zhì)影響較大，如果能夠使用牛蛙肌肉蛋白吸附橘霉素，未來可以用于標(biāo)準(zhǔn)品制備，以及液體食品中橘霉素的快速脫除。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅曲米和牛蛙購于杭州市下沙物美超市。

海藻酸鈉 杭州禾德化工有限公司；免疫親和柱、橘霉素標(biāo)準(zhǔn)品 北京泰樂祺科技有限公司；弗氏完全佐劑 杭州邦易化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC 20-A HPLC儀、RF-20A熒光檢測器 日本島津公司；高速冷凍離心機(jī) 北京五洲東方科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 橘霉素人工抗原免疫牛蛙肌肉蛋白制備

免疫用人工抗原的制備[27]：50 μg橘霉素溶解于500 μL甲醇中，加入1 mL 0.1 mol/L NaHCO3溶液，再加入40 μL 37%的甲醛溶液，混勻后，滴入1 mL 5 mg/mL牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）溶液中，37 ℃振搖反應(yīng)24 h后，移入透析袋中，置0.01 mol/L磷酸緩沖液（phosphatic buffer solution，PBS）4 ℃透析，每3 h換一次透析液，透析12 h，透析完成后冷凍干燥。再將干燥后的橘霉素-BSA人工抗原用0.65%生理鹽水溶解，使橘霉素-BSA質(zhì)量濃度為10 μg/mL，取0.5 mL橘霉素-BSA溶液與1.5 mL弗氏完全佐劑混合乳化。

免疫實驗[28]：前期實驗發(fā)現(xiàn)用橘霉素人工抗原注射牛蛙后，飼養(yǎng)16 d時，牛蛙大腿的可溶性蛋白質(zhì)含量最高，該蛋白對橘霉素的吸附量也最高。因此，采用大腿肌肉注射，注射2.5 μg/mL的橘霉素人工抗原-佐劑，注射劑量為每只牛蛙0.1 mL，并養(yǎng)殖16 d。

肌肉蛋白提?。喝∨Ｍ艽笸燃∪?.0 g，剪碎，放入50 mL離心管中，加入10 mL PBS（0.01 mol/L pH 7.4，含1 mmol/L EDTA、1 mmol/L焦磷酸鈉、1% Tween-20），超聲破碎，10 000 r/min離心20 min后取上清液，即為肌肉組織總蛋白提取液，4 ℃冰箱密封保存。蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)比色法測定。

1.3.2 處理牛蛙肌肉蛋白與橘霉素的結(jié)合能力測定

將2.5 μg/mL橘霉素人工抗原-佐劑和2.5 μg/mL橘霉素分別注射牛蛙，注射劑量為每只牛蛙0.1 mL，飼養(yǎng)16 d和24 d，提取牛蛙肌肉蛋白。之后將肌肉蛋白提取液1 mL放于10 mL玻璃管中，加入1 mL 1.5 μg/mL的橘霉素標(biāo)準(zhǔn)品，旋渦振蕩器混勻，4 ℃條件下3 h，液體裝入透析袋，放于50 mL離心管中，加入20 mL 0.01 mol/L pH 7.4的PBS作為透析液，放于4 ℃透析12 h，取透析袋外液體1 mL，HPLC-FLD法測定橘霉素含量，計算如式（1）所示：

式中：Y為肌肉蛋白結(jié)合橘霉素量/（μg/mg）；m為添加的橘霉素質(zhì)量/μg；c為透析液中橘霉素質(zhì)量濃度/（μg/mL）；V為透析液體積/mL；n為添加的蛋白質(zhì)量/mg。

1.3.3 牛蛙肌肉蛋白與海藻酸鈉制備微球工藝

0.40 g海藻酸鈉加入10 mL 0.64 mg/mL牛蛙肌肉蛋白溶液，磁力攪拌器混合均勻，用5 mL注射器（滴頭為醫(yī)用7號針頭）將混合好的溶液逐滴滴入100 mL質(zhì)量濃度3 g/100 mL的氯化鈣溶液中，4 ℃固定2 h，用100 mL蒸餾水洗滌。測定3 g/100 mL氯化鈣溶液中的蛋白質(zhì)量濃度，計算蛋白質(zhì)的包埋率見式（2）。并隨機(jī)取出10 粒微球拍照，用Image-Pro Plus 6.0軟件分析顆粒的大小。

式中：C1為包埋反應(yīng)前蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V1為包埋反應(yīng)前蛋白體積/mL；C2為固定化后氯化鈣溶液中蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V2為固定化后氯化鈣溶液體積/mL。

1.3.4 微球制備工藝優(yōu)化

1.3.4.1 海藻酸鈉質(zhì)量濃度的選擇

分別取海藻酸鈉加牛蛙肌肉蛋白溶液混勻，質(zhì)量濃度1、2、3、4 g/100 mL，滴入100 mL質(zhì)量濃度3 g/100 mL的氯化鈣溶液中，測定包埋率和顆粒大小。

1.3.4.2 氯化鈣質(zhì)量濃度的選擇

0.40 g海藻酸鈉4 份，加10 mL牛蛙肌肉蛋白溶液混勻，滴入100 mL質(zhì)量濃度1、3、5、7 g/100 mL的氯化鈣溶液中，測定包埋率和顆粒大小。

1.3.4.3 戊二醛體積分?jǐn)?shù)對免疫球蛋白活性的影響

0.40 g海藻酸鈉5 份，加10 mL牛蛙肌肉蛋白溶液混勻，滴入100 mL質(zhì)量濃度3 g/100 mL氯化鈣溶液中。分別加入30 mL體積分?jǐn)?shù)為0.1%、0.2%、0.4%、0.8%、1.0%的戊二醛溶液，4 ℃交聯(lián)反應(yīng)4 h，再用100 mL蒸餾水洗滌微球。將洗滌后的2 g微球裝入固相小柱，取0.1 μg/mL的橘霉素標(biāo)準(zhǔn)液2 mL，過柱后收集液體，2 mL定容，HPLC-FLD檢測橘霉素。

1.3.4.4 交聯(lián)時間對免疫球蛋白活性的影響

0.40 g海藻酸鈉5 份，加10 mL牛蛙肌肉蛋白溶液混勻，滴入100 mL質(zhì)量濃度3 g/100 mL氯化鈣溶液中。用體積分?jǐn)?shù)0.2%的戊二醛在4 ℃交聯(lián)反應(yīng)0.5、1、2、3、4 h，再用100 mL蒸餾水洗滌微球。將洗滌后的2 g微球裝入固相小柱，取0.1 μg/mL的橘霉素標(biāo)準(zhǔn)液2 mL，過柱后收集液體，2 mL定容，HPLC-FLD檢測橘霉素。

1.3.5 橘霉素測定

使用島津HPLC儀，島津ODS柱（Hypersil ODS2，250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈（色譜純）-三氟乙酸（pH 2.5）體積比60∶40；流速0.8 mL/min；進(jìn)樣量40 μL；柱溫28 ℃；檢測器為RF-20A熒光檢測器，檢測波長：λex=331 nm，λem=500 nm。將橘霉素標(biāo)準(zhǔn)液依次稀釋，使其質(zhì)量濃度為1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.01 μg/mL，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。橘霉素吸附率計算如式（3）所示：

式中：C1為過柱前橘霉素標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度/（μg/mL）；C2為過柱后橘霉素標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度/（μg/mL）；V為橘霉素標(biāo)準(zhǔn)液體積/mL。

1.3.6 吸附柱及上樣液的制備

在經(jīng)上述條件優(yōu)化后制備的海藻酸鈣凝膠微球中加入30 mL體積分?jǐn)?shù)0.2%的戊二醛溶液，4 ℃處理2 h。用100 mL蒸餾水洗滌，于0.05 mol/L pH 7.4的Tris-HCl緩沖液中保存。

微球小柱的制備：微球2.0 g裝于5 mL注射器，底部用脫脂棉封口后裝填，均勻壓實，用10 mL 0.05 mol/L p H 7.4的T r i s-H C l緩沖液平衡小柱后，再加入3 mL 0.05 mol/L pH 7.4的Tris-HCl緩沖液作為保護(hù)液。

上樣液準(zhǔn)備：紅曲米10.0 g，加50 mL 70%甲醇溶液，超聲提取20 min，攪拌10 min，過濾，收集濾液。取5 mL濾液，用醋酸鹽緩沖液（0.05 mol/L，pH 6.0）50 mL定容，混勻后玻璃纖維濾紙過濾。

1.3.7 使用條件的優(yōu)化

1.3.7.1 洗雜液的選擇

上樣液2 mL加入小柱，作用30 min，去底蓋，加壓去液體，用20 mL超純水、20 mL PBS（0.01 mol/L，pH 7.4）作為洗雜液對未被結(jié)合的橘霉素和雜質(zhì)進(jìn)行洗脫，洗脫完成后，用5 mL 70%乙腈-三氟乙酸溶液作為洗脫液洗脫橘霉素，HPLC-FLD檢測。

1.3.7.2 洗脫液的選擇

上樣標(biāo)準(zhǔn)液的配制：取1 μg/mL的橘霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，用醋酸鹽緩沖液（0.05 mol/L，pH 6.0）定容至20 mL。上樣標(biāo)準(zhǔn)液2 mL加入小柱，底蓋封口，作用30 min ，去底蓋，加壓去液體，加20 mL超純水洗雜，用5 mL 50%～90%甲醇-三氟乙酸溶液和50%～70%乙腈-三氟乙酸溶液作為洗脫液洗脫橘霉素，收集液體，定容至5 mL，HPLC-FLD檢測，按式（4）計算橘霉素回收率：

式中：X1為上樣標(biāo)準(zhǔn)液中橘霉素質(zhì)量濃度/（μg/mL）；V1為上樣標(biāo)準(zhǔn)液的體積/mL；X2為洗脫液中橘霉素質(zhì)量濃度/（μg/mL）；V2為洗脫液的體積/mL。

1.3.7.3 洗脫液用量的確定

取上樣標(biāo)準(zhǔn)液1 mL上樣，連續(xù)加入6 mL 70%乙腈-三氟乙酸作為洗脫液，每1 mL收集一管，HPLC-FLD法測橘霉素含量，計算回收率。

1.3.8 柱容量的測定

取橘霉素質(zhì)量濃度為0.05 μg/mL上樣標(biāo)準(zhǔn)液連續(xù)進(jìn)樣5 mL，每1 mL收集一管，HPLC-FLD測橘霉素含量。柱容量計算如式（5）所示：

式中：M1為上樣液中橘霉素質(zhì)量/μg；M2為過柱吸附后橘霉素質(zhì)量/μg；m為凝膠微球質(zhì)量/g。

1.3.9 回收率的比較

上述紅曲米提取液2 mL，加0.04、0.08、0.16 μg橘霉素標(biāo)準(zhǔn)品后過柱。另取2 mL未添加橘霉素標(biāo)準(zhǔn)品濾液過柱?；厥章视嬎闳缡剑?）所示：

式中：X1為樣品未加標(biāo)時橘霉素質(zhì)量/μg；X2為樣品加標(biāo)后的橘霉素質(zhì)量/μg；m為橘霉素標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量/μg。

1.3.10 方法平行性精密度實驗及檢測限測定

取紅曲米4 份，每份10 g。前處理按照1.3.6節(jié)和1.3.7節(jié)中優(yōu)化的牛蛙肌肉蛋白柱純化方法，將紅曲米樣品經(jīng)過制備好的牛蛙肌肉蛋白柱純化后，采用HPLC-FLD檢測橘霉素，對所得的4次峰面積進(jìn)行統(tǒng)計分析。取初始質(zhì)量濃度為0.2 μg/mL橘霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次做2 倍比稀釋并對各質(zhì)量濃度進(jìn)行HPLC-FLD檢測分析，取信噪比為3時的質(zhì)量濃度作為其檢測限。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛蛙肌肉蛋白對橘霉素的親和能力

表1 注射橘霉素及其人工抗原牛蛙肌肉蛋白結(jié)合橘霉素的能力Table 1 Citrinin binding ability of bullfrog muscle protein after injection of citrinin-BSA conjugate and citrinin

如表1所示，在16 d和24 d，橘霉素人工抗原誘導(dǎo)的牛蛙肌肉蛋白結(jié)合橘霉素量分別比橘霉素直接誘導(dǎo)增加102.1%和117.1%，說明橘霉素人工抗原誘導(dǎo)牛蛙后，其肌肉中產(chǎn)生了親和橘霉素的蛋白。

2.2 牛蛙肌肉蛋白海藻酸鈉凝膠微球制備條件

圖1 海藻酸鈉質(zhì)量濃度（a）、氯化鈣質(zhì)量濃度（b）、戊二醛體積分?jǐn)?shù)（c）、交聯(lián)時間（d）分別對蛋白包埋率和活性的影響Fig. 1 Effects of sodium alginate concentration (a), calcium chloride concentration (b) and glutaraldehyde concentration (c), and crosslinking time (d) on embedding efficiency and citrinin binding capacity

海藻酸鈉質(zhì)量濃度1 g/100 mL不能形成球狀，2～4 g/100 mL均能形成直徑為2.32～2.57 mm的球狀顆粒。隨著海藻酸鈉質(zhì)量濃度增加，凝膠微球的直徑隨著增大，對蛋白質(zhì)的包埋率也隨之升高。質(zhì)量濃度大于4 g/100 mL時，黏稠度太高，手工滴制困難，因此選擇4 g/100 mL的海藻酸鈉，其對蛋白質(zhì)的包埋率為79.6%（圖1a）。

1～7 g/100 mL的氯化鈣均能制備海藻酸鈣凝膠微球，直徑為2.29～2.47 mm。隨著氯化鈣質(zhì)量濃度的增加，微球直徑逐漸減小，但對蛋白質(zhì)的包埋率增大。形成“egg-box”結(jié)構(gòu)的速度也隨之增大，能夠使蛋白質(zhì)更迅速地被包埋在凝膠微球中，提高包埋率，脹大效應(yīng)減小，從而使微球直徑減小[29]。當(dāng)氯化鈣質(zhì)量濃度為7 g/100 mL時，已成型的凝膠微球浮于氯化鈣溶液表面，難以繼續(xù)滴制，因此選擇5 g/100 mL的氯化鈣，對蛋白質(zhì)包埋率可達(dá)到89.5%（圖1b）。

隨著戊二醛體積分?jǐn)?shù)從0.1%增加到1.0%，微球?qū)﹂倜顾氐奈铰式档?。使用體積分?jǐn)?shù)為0.1%的戊二醛交聯(lián)時，洗滌液在280 nm波長處有吸收峰，說明蛋白質(zhì)結(jié)合不牢固，在洗滌過程中被洗脫下來。選擇體積分?jǐn)?shù)0.2%的戊二醛作為交聯(lián)劑，對橘霉素的吸附率為92.7%（圖1c）。

包埋后的凝膠微球與體積分?jǐn)?shù)0.2%的戊二醛交聯(lián)0.5～4 h，在交聯(lián)時間為0.5～2 h時，微球?qū)﹂倜顾氐奈铰手饾u增大，2 h時達(dá)到最大值86.4%，隨后繼續(xù)延長與戊二醛的交聯(lián)時間，微球?qū)﹂倜顾氐奈侥芰Ψ炊档停钸m交聯(lián)時間為2 h（圖1d）。

2.3 牛蛙肌肉蛋白柱使用條件及柱容量測定結(jié)果

圖2 3 種不同柱的柱容量比較Fig. 2 Comparison of the column capacities of three different columns

如圖2所示，紅曲米樣品的橘霉素提取液過自制蛋白柱，用超純水洗雜效果良好，用PBS洗雜導(dǎo)致橘霉素峰信號被掩蓋。馬萍等[30]研究表明海藻酸鈣凝膠微球在酸性介質(zhì)和蒸餾水中均不溶脹，在pH 6.8的PBS中，很快就會發(fā)生溶脹，微球結(jié)構(gòu)被破壞，所以導(dǎo)致無法準(zhǔn)確檢測橘霉素的色譜峰。而市售免疫親和柱的材料不同，用PBS作為雜質(zhì)洗脫液，效果良好。橘霉素提取液經(jīng)市售免疫親和柱凈化，與超純水洗雜后經(jīng)自制柱凈化的兩者橘霉素出峰保留時間分別為6.264 min和6.297 min，兩者基本一致，測得紅曲米樣品橘霉素的含量分別為0.043 μg/g和0.037 μg/g，自制柱對橘霉素的吸附效率為進(jìn)口免疫親和柱的86.05%。

表2 不同洗脫液洗脫后的橘霉素回收率比較Table 2 Recoveries of citrinin with different eluents

如表2所示，隨著甲醇和乙腈體積分?jǐn)?shù)的增加，橘霉素回收率逐漸增大，但是甲醇體積分?jǐn)?shù)為90%時，橘霉素回收率僅為64.3%，乙腈體積分?jǐn)?shù)為60%時，回收率已經(jīng)達(dá)到80%，故選擇70%乙腈-三氟乙酸作為橘霉素洗脫液。

隨著洗脫液用量的增大，橘霉素更多的被洗脫下來，回收率升高，當(dāng)洗脫液洗脫至6 mL時，僅有0.001 μg橘霉素被洗脫下來，因此選擇5 mL洗脫液進(jìn)行洗脫（表3）。

表3 洗脫液用量的選擇Table 3 Selection of optimal eluent volume

在連續(xù)上樣5 mL時，測得前4 mL過柱吸附后的流出液中基本沒有橘霉素，說明上樣液中98%以上的橘霉素被吸附，而在5 mL過柱吸附后的流出液中則有92%的橘霉素流出，并沒有被吸附，說明此時柱對橘霉素的結(jié)合量已達(dá)到飽和。柱容量為0.101 μg/g（表4）。

表4 柱容量測定Table 4 Determination of column capacity

2.4 牛蛙肌肉蛋白柱檢測橘霉素回收率

如表5所示，在橘霉素添加量為0.04 μg時，市售免疫親和柱的回收率較高達(dá)到94.61%，而自制牛蛙柱回收率為83.93%；當(dāng)橘霉素添加量為0.08 μg時，自制牛蛙肌肉蛋白柱回收率為78.7%，僅比市售免疫親和柱低1.59%；當(dāng)橘霉素添加量為0.16 μg，自制牛蛙肌肉蛋白柱回收率反而稍高于市售免疫親和柱。

表5 市售免疫親和柱與自制牛蛙肌肉蛋白柱的回收率比較Table 5 Recoveries of immunoaffinity column and the column developed in this study

2.5 牛蛙肌肉蛋白柱檢測橘霉素的精密度和檢測限

紅曲米樣品過自制蛋白柱，HPLC-FLD檢測橘霉素，對所得的峰面積進(jìn)行統(tǒng)計分析。該方法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）值為1.81%，符合中國藥典中關(guān)于精密度實驗RSD應(yīng)小于3%的規(guī)定，因此，該方法具有良好的精密度。取初始質(zhì)量濃度為0.2 μg/mL橘霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次做2 倍比稀釋并對各濃度進(jìn)HPLC-FLD檢測分析，取信噪比為3時的質(zhì)量濃度作為其檢測限，測得橘霉素的檢測限為0.004 μg/mL（表6）。

表6 方法精密度實驗Table 6 Precision of the method proposed in this study

3 結(jié) 論

將橘霉素人工抗原免疫牛蛙肌肉蛋白質(zhì)用海藻酸鈉進(jìn)行包埋，制備海藻酸鈣凝膠顆粒。經(jīng)過包埋率測試，最佳條件為橘霉素人工抗原免疫牛蛙肌肉蛋白質(zhì)6.4 mg，選擇質(zhì)量濃度4 g/100 mL的海藻酸鈉、質(zhì)量濃度5 g/100 mL的氯化鈣、體積分?jǐn)?shù)0.2%的戊二醛交聯(lián)2 h制備海藻酸鈣凝膠微球。

用2 g海藻酸鈣凝膠微球裝填成固相小柱，紅曲米樣品橘霉素提取液2 mL作為上樣液，20 mL超純水洗脫雜質(zhì)和未被結(jié)合的橘霉素，其純化效果與免疫親和柱類似，均沒有雜質(zhì)干擾峰。使用70%的乙腈-三氟乙酸作為洗脫液，洗脫劑用量為5 mL時，橘霉素回收率可達(dá)到86.7%。橘霉素加標(biāo)回收率實驗表明，雖然自制牛蛙肌肉蛋白柱總體回收率稍低于市售免疫親和柱，但在橘霉素添加量為0.04 μg時，回收率仍可達(dá)到83.93%，柱容量測定值為0.101 μg/g；取信噪比為3時的質(zhì)量濃度作為其檢測限，測得橘霉素檢測限為0.004 μg/mL，方法精密度實驗RSD為1.8%，符合《中國藥典》中關(guān)于精密度實驗RSD應(yīng)小于3%的規(guī)定，說明該方法具有良好的精密度。在紅曲米的橘霉素含量檢測中，采用自制的牛蛙免疫蛋白柱和市售免疫親和柱測得橘霉素含量分別為0.037 μg/g和0.043 μg/g。未來將完善自制牛蛙免疫蛋白顆粒的制作，進(jìn)一步提高產(chǎn)品性能。