邱 斌，孫文佳，劉 瑋，徐同成，劉麗娜，宗愛珍，賈 敏，杜方嶺*

（山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所，山東省農(nóng)產(chǎn)品精深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部新食品資源加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250100）

反式脂肪酸是油脂或含油脂的加工食品中比較常見的一種脂肪酸組分。反式脂肪酸中一般以主要反油酸（C18:19t）為主，約占20%～50%。目前已經(jīng)有很多關(guān)于反式脂肪酸和人類健康關(guān)系的研究報(bào)道[1-4]。Slattery等[5]研究發(fā)現(xiàn)，高含量的反式脂肪酸攝入與女性結(jié)腸癌的風(fēng)險(xiǎn)具有顯著相關(guān)性（其中相對(duì)危險(xiǎn)度精確估計(jì)值1.5）。另外，還有研究發(fā)現(xiàn)反式脂肪酸與心血管疾病的發(fā)生呈正相關(guān)的關(guān)系[6-8]。反式脂肪酸所造成的血漿總膽固醇、甘油三酯水平、載脂蛋白B（apoB）水平的升高和血液黏稠度的增加都與冠心病、血栓和動(dòng)脈粥樣硬化的形成密切相關(guān)[9]。Mozaffarian等[10]通過對(duì)心臟病患者細(xì)胞膜水平的脂肪酸含量的分析發(fā)現(xiàn)，攝入反式脂肪酸的生物標(biāo)志物IL-6、TNF受體等都與炎癥密切相關(guān)。

前期已經(jīng)研究報(bào)道C18:19t能通過caspase、Fas/FasL、p53等信號(hào)通路誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷和凋亡[11-13]。但是，反式脂肪酸誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞是一個(gè)十分復(fù)雜的生物學(xué)過程，其中涉及大量基因的差異表達(dá)以及轉(zhuǎn)錄因子和miRNA等多種生物因子的調(diào)控作用。轉(zhuǎn)錄組學(xué)作為一個(gè)在綜合水平上研究生物在某一生理進(jìn)程中所有基因轉(zhuǎn)錄及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律的手段，為研究反式脂肪酸誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞后相關(guān)基因變化提供了技術(shù)保障。目前，尚無(wú)針對(duì)反式脂肪酸對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)的相關(guān)報(bào)道。本研究通過反式脂肪酸中的C18:19t單體誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞后，通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)篩選差異基因，結(jié)合生物信息學(xué)分析，探尋反式脂肪酸誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)基因功能和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，為研究反式脂肪酸對(duì)基因表達(dá)、信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVECs由山東大學(xué)提供。

試劑總RNA提取試劑盒、TBS380 Picogreen試劑盒美國(guó)Invitrogen公司；TruSeqTMRNA sample prep Kit試劑盒、cBot TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS試劑盒、HiSeq-TruSeq SBS Kit（300cycles）試劑盒 美國(guó)Illumina公司；Certified Low Range Ultra Agarose 美國(guó)Bio-Rad公司；低糖DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶 美國(guó)Hycolne公司；胎牛血清 杭州四季青生物工程材料有限公司；C18:19t美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Eppendorf AG CO2培養(yǎng)箱 美國(guó)Sheldon公司；1×70-81FZ倒置顯微鏡 日本Olympus公司；2K15型冷凍離心機(jī) 美國(guó)Sigma公司；cBoT簇生成系統(tǒng)、HiSeq2500測(cè)序儀 美國(guó)Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及樣品處理

將細(xì)胞以1×105個(gè)/mL接種于培養(yǎng)瓶，待細(xì)胞長(zhǎng)至融合，收集細(xì)胞并用總RNA提取試劑處理，該組作為對(duì)照組。反式脂肪酸實(shí)驗(yàn)組同時(shí)分別加入C18:19t，使其終濃度分別為200 μmol/L，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞24 h后，用總RNA提取試劑處理并收集細(xì)胞留作轉(zhuǎn)錄組學(xué)檢測(cè)，對(duì)照組和C18:19t組分別重復(fù)3 次。

1.3.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

以5 μg total RNA起始量建庫(kù)；磁珠法分離mRNA后，離子打斷mRNA（TruSeqTMRNA sample prep Kit）；雙鏈cDNA合成、補(bǔ)平、3’端加A、連接index接頭（TruSeqTMRNA sample prep Kit）；文庫(kù)富集，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增15個(gè)cycles；2%瓊脂糖膠回收目的條帶（Certified Low Range Ultra Agarose）；TBS380（Picogreen）定量，按數(shù)據(jù)比例混合上機(jī)；cBot上進(jìn)行橋式PCR擴(kuò)增，生成clusters；Illumina HiSeq測(cè)序平臺(tái)，進(jìn)行2×150 bp測(cè)序。

1.3.3 基因差異表達(dá)分析

由轉(zhuǎn)錄組測(cè)序所得的數(shù)據(jù)稱為原始讀段（raw reads），首先對(duì)raw reads進(jìn)行質(zhì)控，確定測(cè)序數(shù)據(jù)是否適用于后續(xù)分析。

在RNA測(cè)序分析中，主要通過對(duì)定位到基因組區(qū)域的測(cè)序序列（clean reads）的數(shù)量來估計(jì)基因的表達(dá)水平。依據(jù)所有樣本與參考基因組比對(duì)的結(jié)果，計(jì)算每個(gè)基因/轉(zhuǎn)錄本在樣本中的百萬(wàn)外顯子的堿基片段值（fragments per kilobase million，F(xiàn)PKM），以該值作為基因/轉(zhuǎn)錄本在樣本中的表達(dá)量。最終對(duì)所有基因/轉(zhuǎn)錄本在各組樣本中的表達(dá)進(jìn)行差異顯著性分析，找出相對(duì)差異表達(dá)的基因/轉(zhuǎn)錄本，并對(duì)其進(jìn)行可視化分析。衡量基因表達(dá)水平的標(biāo)準(zhǔn)為FPKM值，即每1×106條序列中，每個(gè)基因以1 000 個(gè)堿基為單位，比對(duì)上的reads個(gè)數(shù)。由于各基因堿基長(zhǎng)度不同，在分析其特定表達(dá)量時(shí)，會(huì)將比對(duì)上的測(cè)序條數(shù)和其基因長(zhǎng)度關(guān)聯(lián)分析，具體公式如下：

同實(shí)驗(yàn)條件下的基因差異表達(dá)分析使用Cuffdiff軟件。差異蛋白篩選標(biāo)準(zhǔn)：倍數(shù)變化值≥2，P＜0.05。對(duì)3次重復(fù)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，P值小于0.05為差異顯著，滿足以上要求的基因即被列出。

1.3.4 生物信息學(xué)分析

采用OmicsBean（http://www.omicsbean.com:88/）軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析，利用該軟件每個(gè)差異表達(dá)基因的基因本體（geneontology，GO）富集分析、KEGG通路分析、蛋白質(zhì)互作（protein-protein interaction，PPI）分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因表達(dá)分析結(jié)果

基因在不同表達(dá)水平的轉(zhuǎn)錄本，被有效檢測(cè)時(shí)對(duì)數(shù)據(jù)量的要求不同。因此，高表達(dá)量的基因測(cè)序時(shí)需要較少的數(shù)據(jù)量就可趨近于飽和；低表達(dá)量的基因則需要較大的數(shù)據(jù)量要求才能保證檢測(cè)的準(zhǔn)確性。飽和度曲線可以描述不同測(cè)序量的條件下各基因的表達(dá)檢測(cè)是否準(zhǔn)確。

圖1 測(cè)序飽和度曲線Fig. 1 Sequencing saturation curves

如圖1所示，待測(cè)樣本（包括對(duì)照組和C18:19t組）測(cè)序飽和度較高，大部分中等以上表達(dá)量的基因（即FPKM值在3.5以上的基因）在測(cè)序reads的40%比對(duì)上時(shí)已經(jīng)接近飽和（縱軸數(shù)值趨近于1），說明飽和度總體質(zhì)量較高，該測(cè)序量能夠覆蓋絕大多數(shù)的表達(dá)基因。

結(jié)果顯示：C18:19t作用于內(nèi)皮細(xì)胞后，與對(duì)照組相比，共檢測(cè)到95 條基因顯著變化，其中31 條基因上調(diào)，64 條基因下調(diào)。具體基因ID及其信息詳見表1。

表1 C18:1 9t誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)有顯著差異的基因Table 1 Elaidic acid induced differential gene expression in endothelial cells

續(xù)表1

2.2 生物信息學(xué)匯總分析

對(duì)該所有差異基因GO富集（生物進(jìn)程、細(xì)胞組成、分子功能）和KEGG通路富集結(jié)果總數(shù)以及顯著（P＜0.05）數(shù)目進(jìn)行匯總，并通過柱形圖（圖2）形式進(jìn)行直觀展示。

圖2 生物信息分析匯總圖Fig. 2 Summary of bioinformatics analysis

一個(gè)基因通常會(huì)參與很多的功能或者通路，所以一般GO富集和KEGG通路富集結(jié)果總數(shù)會(huì)遠(yuǎn)大于差異表達(dá)基因數(shù)目，顯著性功能或者通路是指富集到的該功能或者通路是差異顯著的，即置信度比較高，P值越小，置信度越高。通過生物信息學(xué)匯總分析，圖2顯示其中生物進(jìn)程共富集到2 078 條，顯著性富集基因共772 條，關(guān)于細(xì)胞組成的基因共富集到223 條，其中顯著性富集基因共46 條，關(guān)于分子功能的基因共富集到394條，其中顯著性富集基因共122 條。C18:19t作用于內(nèi)皮細(xì)胞后，與對(duì)照組相比，共檢測(cè)到93條信號(hào)通路，其中顯著變化的有11 條。

2.3 GO分析

圖3 GO注釋分析圖Fig. 3 GO annotation analysis

GO是基因本體聯(lián)合會(huì)（Gene Ontology Consortium）所建立的數(shù)據(jù)庫(kù)。GO總共有3 個(gè)本體：生物進(jìn)程描述分子功能的有序組合；細(xì)胞組分描述亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、位置和大分子復(fù)合物；分子功能描述基因及基因產(chǎn)物個(gè)體的功能，達(dá)成更廣泛的生物功能。本實(shí)驗(yàn)GO富集分析基于主流的數(shù)據(jù)庫(kù)David 6.7（http://david.abcc.ncifcrf.gov/）和QuickGO（http://www.ebi.ac.uk/QuickGO/）對(duì)篩選的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO分類注釋和富集分析。

圖3展示了生物進(jìn)程、細(xì)胞組成和分子功能3 種類別富集分析顯著性排名前20的條目，在生物進(jìn)程中，包括膽固醇生物合成、膽固醇代謝、脂質(zhì)代謝、磷酸代謝等與脂質(zhì)合成代謝相關(guān)生物過程占據(jù)一半以上，說明反式脂肪酸作用于內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞后，參與了細(xì)胞的脂質(zhì)相關(guān)生物過程并對(duì)其產(chǎn)生了顯著影響。細(xì)胞組成分析結(jié)果顯示，其中涉及細(xì)胞外區(qū)域及膠原蛋白錨定的生物過程共8 條，以bcl3-10基因相關(guān)復(fù)合物為主的細(xì)胞內(nèi)生物進(jìn)程2 條，脂質(zhì)復(fù)合物相關(guān)生物進(jìn)程3 條，細(xì)胞質(zhì)相關(guān)區(qū)域生物進(jìn)程2 條。細(xì)胞定位揭示了反式脂肪酸從內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞膜外到細(xì)胞質(zhì)的不同作用位點(diǎn)，為研究反式脂肪酸在內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)等生物進(jìn)程提供了依據(jù)。分子功能富集分析結(jié)果顯示，其中參與蛋白、前體蛋白等綁定功能4 條，NADPH還原酶、脂酰胺酶、異戊烯轉(zhuǎn)移酶、氧化還原酶等參與的與脂肪酸合成、代謝相關(guān)功能共16 條，分子功能富集結(jié)果與生物進(jìn)程結(jié)果一致。

2.4 KEGG通路分析

KEGG（http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html）是一個(gè)整合了基因組、化學(xué)和系統(tǒng)功能信息的數(shù)據(jù)庫(kù)。把差異表達(dá)基因信息映射到KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，可以獲得其富集到的KEGG通路。

圖4 KEGG通路富集分析圖Fig. 4 KEGG pathway enrichment analysis

KEGG通路富集分析的結(jié)果（圖4）顯示：最顯著的通路為萜類骨架生物合成通路和類固醇生物合成通路，其中類固醇生物合成通路是調(diào)控膽固醇從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入線粒體的關(guān)鍵通路[14]。這兩條通路涉及反式脂肪酸誘導(dǎo)的脂肪酸、萜類及其膽固醇等的代謝，在代謝過程中涉及多種酶、輔酶及底物[15]。

結(jié)合GO分析中生物進(jìn)程中細(xì)胞定位富集結(jié)果，NADPH、脂酰胺酶等多種酶參與了上述通路。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎通路涉及細(xì)胞自身免疫等功能，作為該通路的標(biāo)志蛋白-脂聯(lián)素與脂質(zhì)代謝、動(dòng)脈粥樣硬化等密切相關(guān)[16]。研究報(bào)道n-3脂肪酸能夠刺激生長(zhǎng)并在心血管疾病[17]和炎癥反應(yīng)（類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和潰瘍性結(jié)腸炎）中起到保護(hù)作用[18-19]。相反本研究中發(fā)現(xiàn)C18:19t誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞后，類風(fēng)濕相關(guān)炎癥因子表達(dá)上調(diào)，說明C18:19t誘導(dǎo)了內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)生物進(jìn)程的發(fā)展。反式脂肪酸誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞后，同時(shí)參與的還有包括脂肪酸代謝、不飽和脂肪酸合成通路等代謝通路。其中值得關(guān)注的兩條通路是JAK-STAT信號(hào)通路和腫瘤壞死因子通路。近來有研究發(fā)現(xiàn)JAK-STAT信號(hào)通路的激活對(duì)促進(jìn)脂肪酸的分解有著重要的調(diào)節(jié)作用[20]。JAK-STAT信號(hào)通路中激活的STATs轉(zhuǎn)運(yùn)到核內(nèi)，調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄，如編碼線粒體解偶聯(lián)蛋白2基因和編碼過氧化體增殖物激活型受體γ（peroxisome proliferatoractivated receptor-gamma，PPARγ），進(jìn)而通過PPARγ對(duì)脂肪組織中甘油三酯水解的限速酶激素敏感脂酶進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)[21]。γ-亞麻酸能通過小鼠胃腸黏膜系統(tǒng)和血液系統(tǒng)傳遞信號(hào)，通過NF-κB、P38/JNK/MAPK、JAKSTAT等途徑調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫[22]。研究發(fā)現(xiàn)，二十二碳六烯酸（docosahexenoic acid，DHA）、二十碳五烯酸（eicosapentenoic acid，EPA）等歐米伽多不飽和脂肪酸（ω-3-polyunsaturated fatty acid，ω-3 PUFA）具有下調(diào)炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6表達(dá)的功能[23]，已有研究報(bào)道C18:19t能夠?qū)е聝?nèi)皮細(xì)胞TNF-α分泌升高[8]，而本研究發(fā)現(xiàn)結(jié)果與之相反。但本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)MMP-1表達(dá)上調(diào)，在病理情況下如創(chuàng)傷愈合、修復(fù)或重塑過程中，MMP-1表達(dá)量增加[24]。而本研究發(fā)現(xiàn)與炎癥相關(guān)的STAT4卻表達(dá)升高，相對(duì)于實(shí)時(shí)定量PCR，轉(zhuǎn)錄組學(xué)對(duì)于某個(gè)基因的表達(dá)定性可能會(huì)出現(xiàn)誤差或者表達(dá)上調(diào)分類劃分不準(zhǔn)確，后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要對(duì)TNF通路進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證。

2.5 PPI基因互作分析

基因互作基于string數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析，string數(shù)據(jù)庫(kù)是蛋白質(zhì)間預(yù)測(cè)的功能相關(guān)性的一個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)，可以搜尋已知蛋白質(zhì)/基因之間和預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)/基因之間相互作用的系統(tǒng)。這種相互作用既包括蛋白質(zhì)/基因之間直接的物理的相互作用，也包括蛋白質(zhì)/基因之間間接功能的相關(guān)性。它除了包含有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、從PubMed摘要中文本挖掘的結(jié)果和綜合其他數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)外，還有利用生物信息學(xué)的方法預(yù)測(cè)的結(jié)果。

根據(jù)PPI通路圖分析（圖5），反式脂肪酸誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞生物進(jìn)程主要分為兩大類，一類是以脂肪酸代謝等為主的脂質(zhì)代謝進(jìn)程，另一類是包括類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎通路和腫瘤壞死因子通路等與炎癥和凋亡相關(guān)的生物進(jìn)程。在互作圖里面，有些基因不僅僅參與了一條信號(hào)通路，可能同時(shí)參與調(diào)控多條信號(hào)通路。這些基因?yàn)榱私夥词街舅嵴{(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞生物進(jìn)程機(jī)制提供了重要靶點(diǎn)。

圖5 信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)基因互作圖Fig. 5 Gene-gene interaction in signaling pathway network

在脂質(zhì)代謝過程中，共6 條基因同時(shí)參與了至少2 條代謝相關(guān)通路，具體如下：1）本研究發(fā)現(xiàn)脂肪酸合成酶（fatty acid synthetase，F(xiàn)ASN）基因同時(shí)參與代謝途徑和脂肪酸代謝兩條信號(hào)通路。FASN是一種多功能的復(fù)合酶，是合成脂肪酸的關(guān)鍵酶。FASN的激活被證實(shí)與脂肪生成途徑誘導(dǎo)的缺氧和脂肪酸缺乏呈正相關(guān)[25]。Vizio等[26]發(fā)現(xiàn)脂筏上存在cav-1和FASN相互作用的作用位點(diǎn)。Clarke等[27]發(fā)現(xiàn)日糧中多不飽和脂肪酸顯著降低肝臟中的FASN mRNA水平，魚油比紅花油更有效，而軟脂酸甘油酯和三油酸甘油酯對(duì)FASN mRNA無(wú)影響。通過上述研究，說明C18:19t能通過激活FASN從而干預(yù)脂肪酸在體內(nèi)代謝，最終導(dǎo)致相關(guān)基本的發(fā)生和發(fā)展。2）同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)IDI1基因同時(shí)參與代謝途徑和萜類骨架生物合成通路；3）FDFT1、DHCR7同時(shí)參與了代謝途徑和甾族化合物生物合成通路；4）ELOVL6、SCD基因同時(shí)參與了脂肪酸代謝信號(hào)通路和不飽和脂肪酸生物合成通路。

在炎癥和凋亡相關(guān)的生物進(jìn)程中，共4 條基因同時(shí)參與了至少2條相關(guān)信號(hào)通路，具體如下：1）FOS基因同時(shí)參與破骨細(xì)胞分化通路、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎通路和腫瘤壞死因子通路；2）CTSK基因參與破骨細(xì)胞分化通路和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎通路；3）CSF2同時(shí)參與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路、腫瘤壞死因子通路和JAKSTAT信號(hào)通路；4）SOCS1同時(shí)參與了JAK-STAT信號(hào)通路和破骨細(xì)胞分化通路。JAK-STAT通路涉及多條基因的顯著表達(dá)，包括CSF2、SOCS1、STAT4和IL23。STATs是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族，它們對(duì)于細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)具有至關(guān)重要的作用，因此可以作為細(xì)胞滲透小分子吸引靶蛋白，它們的活化均依賴分子內(nèi)Tyr殘基的磷酸化。STAT4是機(jī)體自身免疫過程中，調(diào)控炎癥的核心。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)在人內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)，STAT4的磷酸化與JAK1和Tyk2密切相關(guān)[28]。IL-23是IL-12細(xì)胞因子家族中新的一員，主要由活化的巨噬細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生。IL-23在感染、炎癥、自身免疫性疾病及腫瘤免疫中發(fā)揮重要的作用。本研究通過PPI互作發(fā)現(xiàn)：STAT4轉(zhuǎn)錄因子被激活，表達(dá)上調(diào)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)IL-23下調(diào)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)可以STAT4和IL-23為靶點(diǎn)，重點(diǎn)研究JAK-STAT在反式脂肪酸誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞中的調(diào)控作用。

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)，對(duì)反式脂肪酸誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞后，差異表達(dá)基因及其相關(guān)生物信息學(xué)進(jìn)行了分析。其中共檢測(cè)到95 條基因顯著變化，并對(duì)顯著表達(dá)基因所涉及生物進(jìn)程進(jìn)行分類。根據(jù)基因互作通路分析，發(fā)現(xiàn)反式脂肪酸誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞生物進(jìn)程主要分為以脂肪酸代謝等為主的脂質(zhì)代謝進(jìn)程和腫瘤壞死因子通路等與炎癥和凋亡相關(guān)的生物進(jìn)程。后續(xù)可根據(jù)生物信息學(xué)分析，進(jìn)行相關(guān)通路驗(yàn)證研究。