劉曉靜，朱 靜，楚 敏，唐琦勇，顧美英，王 博，朱 璇*，張志東,*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆農(nóng)業(yè)科學院微生物應用研究所，新疆 烏魯木齊 830091）

庫車小白杏，薔薇科，李亞科，因盛產(chǎn)于新疆阿克蘇地區(qū)庫車縣而得名[1]。庫車小白杏汁多味鮮、風味濃郁，果肉富含豐富的胡蘿卜素和VC，且含糖高，是優(yōu)良的鮮食水果[2-3]。同時，其果肉還可以加工為果醋，其仁可加工成高附加值的油脂，其種子被用來治療皮膚病以及咳嗽、哮喘、便秘，已成為本地重要經(jīng)濟林果之一[4-8]。

由于庫車小白杏鮮果成熟期集中，貯存期短，易腐敗變質(zhì)，一般鮮果銷售期僅為3～5 d，嚴重制約了庫車小白杏的生產(chǎn)和銷售。研究表明，庫車小白杏是典型的呼吸躍變型果實，采后果肉和果皮易褐變，果實易軟化、腐爛和霉變。即使在0 ℃冷藏，庫車小白杏也會發(fā)生后熟，冷藏18～27 d果實轉(zhuǎn)為完熟期，之后進入衰老期，果實出現(xiàn)軟腐，進而產(chǎn)生霉變[9]。目前，有關(guān)庫車小白杏的研究主要集中于其采后生理變化和保鮮、貯存等方面[10-12]，而有關(guān)庫車小白杏內(nèi)生菌的研究尚鮮見報道。作為多種途徑參與植物代謝、發(fā)育的內(nèi)生菌，其與宿主植物在長期的系統(tǒng)演化過程中形成了協(xié)同進化關(guān)系[13-14]。目前，國內(nèi)已對枸杞、棗、柑橘、葡萄、芒果、哈密瓜等果實內(nèi)生菌進行了研究，發(fā)現(xiàn)其中存在豐富的內(nèi)生菌，呈現(xiàn)出一定的寄主偏好性，且蘊藏著寶貴的天然產(chǎn)物產(chǎn)生菌和病原拮抗菌。胡美姣等[15]對采后芒果果實的研究發(fā)現(xiàn)，大多病原菌具有潛伏侵染的特性，如可可球二孢菌在果實未成熟時就會浸染，導致果實在貯運及銷售過程中發(fā)生快速且嚴重的腐爛。

本研究以庫車小白杏為實驗材料，通過Biolog生態(tài)板法和高通量測序法，對采后不同時期其內(nèi)生細菌群落碳源代謝特征及結(jié)構(gòu)組成變化進行研究，以期從內(nèi)生細菌的角度闡明庫車小白杏易腐變質(zhì)的機制，為進一步的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

青熟小白杏采自庫車縣烏恰鎮(zhèn)小白杏果園中，其表皮青澀，果實硬度較高，無機械傷痕，無病變；完熟小白杏為采摘的青熟小白杏于室溫、避光條件下放置7 d，至其表皮為橘色，果實較軟，無機械傷痕，無病變。

1.2 儀器與設(shè)備

生態(tài)板、自動微生物鑒定系統(tǒng) 美國Biolog公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的預處理

分別取青熟和完熟小白杏各20 顆，稱質(zhì)量后經(jīng)自來水流水沖洗10 min，無菌紙吸干水分，75%無水乙醇處理4 min，經(jīng)無菌水洗滌后，用3% H2O2浸泡3 min，再用無菌水沖洗3～4 次，最后一遍無菌水洗滌液經(jīng)涂板檢測無菌后，于無菌條件下進行庫車小白杏的去核、破碎、勻漿等操作。

1.3.2 內(nèi)生菌群落碳源代謝利用分析

采用Biolog生態(tài)板法進行。庫車小白杏經(jīng)表面完全消毒后，無菌條件下稱取20 g果肉，以無菌水-果肉比9∶1的比例再次進行勻漿，靜置30 min后，每孔取上清液150 μL接種至生態(tài)板，每個處理3 個重復。于28 ℃恒溫培養(yǎng)，每隔24 h分別讀數(shù)，連續(xù)培養(yǎng)7 d。

以微平板孔平均顏色變化率（average well color development，AWCD）（吸光度表示）進行庫車小白杏采后內(nèi)生細菌群落代謝活性的分析，采用DPS v9.50版軟件進行內(nèi)生菌群落碳源利用率及多樣性分析[16]。

1.3.3 內(nèi)生菌總DNA的提取

經(jīng)表面消毒的庫車小白杏，采用十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）法對樣本的基因組DNA進行大量提取[17]，經(jīng)凝膠電泳檢測后，DNA濃度及純度合格后作為聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增模板使用。

1.3.4 16S rDNA序列V4可變區(qū)的PCR擴增

以前述內(nèi)生菌DNA為模板，采用引物為515F和806R，擴增16S rDNA序列的V4可變區(qū)，PCR條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30 個循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴增PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測切膠回收，并檢測濃度調(diào)至一致后，樣品送至北京諾禾致源生物信息科技有限公司進行高通量測序。

1.3.5 數(shù)據(jù)預處理

所得的測序數(shù)據(jù)經(jīng)去除冗余和無效序列后，對有效序列Tags聚類，以同源性大于97%聚為一個操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU），作為一個假定的分類單元。選取代表性序列，通過RDP classifier軟件進行物種分類，確定OTU之間的分類地位。

1.3.6 Alpha多樣性分析

Alpha多樣性分析采用DPS v9.50版軟件，分別采用覆蓋率、物種豐富度、物種多樣性等方面信息評價。其中，覆蓋率用來反映測序深度；OTU用來分析群落種群豐富度，香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)用來估算微生物群落的多樣性[18-19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生細菌群落代謝特征分析

2.1.1 AWCD分析

樣品經(jīng)7 d連續(xù)培養(yǎng)和測定，數(shù)據(jù)經(jīng)分析并求得平均吸光度后作圖，由圖1可以看出，青熟和完熟小白杏各處理的平均吸光度有明顯區(qū)別，完熟小白杏處理在培養(yǎng)48～120 h內(nèi)，表現(xiàn)出快速增長的趨勢，其后趨于緩慢，其最大吸光度為0.543；而青熟小白杏處理在24～96 h間略有增加后，便不再增加，其最大吸光度為0.003 8。結(jié)果表明，完熟庫車小白杏內(nèi)生菌群落代謝活性遠高于青熟小白杏，約為青熟小白杏的143 倍。

圖1 完熟（A）和青熟（B）庫車小白杏內(nèi)生細菌群落AWCD變化Fig. 1 Changes in AWCD of endophytic bacteria in fully ripe (A) and green ripe (B) apricots

2.1.2 內(nèi)生菌群落碳源利用分析

根據(jù)AWCD變化情況，研究選擇培養(yǎng)96 h時內(nèi)生菌群落對31 種底物利用情況，并將其歸類為6 類碳源，以分析各樣品的碳源利用情況。由圖2可以看出，庫車小白杏青熟和完熟兩個階段內(nèi)生細菌群落對于6 大碳源種類的利用存在明顯差異。在青熟小白杏中，碳水化合物類和胺類為其內(nèi)生菌群落主要利用碳源類型，分別占總體的60%和14%；而在完熟小白杏中，碳水化合物類和羧酸為群落主要利用類型，分別占總體的30%和22%。比較分析發(fā)現(xiàn)，隨著成熟度的增加，小白杏內(nèi)生菌群落利用碳水化合物類、酚酸類和胺類內(nèi)生菌群落比例明顯降低，而利用氨基酸類、羧酸類、多聚物類內(nèi)生細菌群落比例升高。

圖2 青熟和完熟庫車小白杏內(nèi)生細菌群落對不同類型碳源利用Fig. 2 Carbon source utilization profiles of endophytic bacterial communities in fully ripe and green ripe apricots

圖3 青熟（A）和完熟（B）小白杏內(nèi)生細菌群落主要利用的8 種碳源Fig. 3 Utilization rates of 8 major carbon sources by endophytic bacterial communities in green ripe (A) and fully ripe (B) apricots

進一步對31種碳源的具體利用情況分析表明，完熟小白杏內(nèi)生菌群落利用碳源數(shù)量明顯高于青熟小白杏，其中完熟小白杏所利用的11 種碳源未在青熟小白杏處理中發(fā)現(xiàn)。各碳源利用所占比例分析表明，D-半乳糖酸-γ-內(nèi)脂、腐胺、D-木糖、α-D-乳糖、D-甘露醇、γ-羥丁酸、2-羥基苯甲酸、4-羥基苯甲酸為青熟小白杏內(nèi)生菌群落主要利用碳源（圖3A）；而丙酮酸甲酯、α-丁酮酸、吐溫40、吐溫80、苯乙胺、L-精氨酸、D-纖維二糖、衣康酸為完熟小白杏主要利用碳源（圖3B）。綜上證明，青熟和完熟庫車小白杏采后內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化。

2.2 內(nèi)生細菌群落組成分析

2.2.1 高通量測序數(shù)據(jù)預處理

通過各樣品中內(nèi)生細菌的16S rDNA V4區(qū)測序，2組樣品總計測得原始序列106 317 條，過濾掉低質(zhì)量序列后，總數(shù)為104 286 條。所得序列經(jīng)聚類比對，以相似度低于97%以聚類為1 個OTU，并去除植物體內(nèi)的線粒體、葉綠體相關(guān)序列后，共獲得47 個OTU，各樣品測序信息見表1。

表1 青熟和完熟庫車小白杏微生物菌株測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計Table 1 Statistics of sequencing data for microbial strains in fully ripe and green ripe apricots

2.2.2 樣品間Alpha多樣性分析

通過覆蓋率、物種豐富度、物種多樣性等方面信息對各樣品間Alpha多樣性進行了描述，見表2。結(jié)果表明，各樣品所得序列覆蓋了全部內(nèi)生菌的99%，所得數(shù)據(jù)能夠準確地反映出庫車小白杏采后內(nèi)生菌群落的組成；OTU分析表明，庫車小白杏采后內(nèi)生菌群落的組成單元變化不大；但完熟小白杏內(nèi)生菌群落香農(nóng)指數(shù)及辛普森指數(shù)較青熟小白杏略有降低，說明群落的均一性發(fā)生變化，完熟小白杏內(nèi)生菌群落的有一定的分化。

表2 不同成熟度庫車小白杏微生物多樣性統(tǒng)計Table 2 Bacterial diversity in fully ripe and green ripe apricots

2.2.3 內(nèi)生菌群落分布特征分析

利用RDP classifie對各樣品中OTU依次進行門、綱、目、科、屬分類信息分析，進一步挖掘樣品的群落組成。結(jié)果表明，庫車小白杏采后內(nèi)生細菌群落共涉及8 個門，12 個綱，15 個目，23 個科，33 個屬。

圖4 目水平上主要的庫車小白杏內(nèi)生細菌群落組成Fig. 4 Major bacterial orders in fully ripe and green ripe apricots apricot

通過對樣品中主要目的分析發(fā)現(xiàn)，青熟和完熟小白杏采后內(nèi)生細菌群落的分布比例存在明顯差異。如圖4所示，青熟小白杏內(nèi)生細菌群落的主要組成為黃桿菌目（Flavobacteriales）、擬桿菌目（Bacteroidales），分別占總體的41%、28%，其在完熟小白杏中比例明顯下降；紅螺菌目（Rhodospirillales）、腸桿菌目（Enterobacteriales）為完熟小白杏內(nèi)生細菌群落的主要組成，分別占總體的60%、15%，其較青熟小白杏內(nèi)生細菌群落中所占比例上升明顯；梭菌目在采后小白杏內(nèi)生菌中比例變化不大，僅由青熟中的10%提高至完熟的14%。而其他菌如如氣單胞菌目（Aeromonadales）、螺旋體目（Spirochaetales）等非優(yōu)勢菌群均隨著小白杏的成熟度的增加有所下降。

表3 屬水平上主要的庫車小白杏內(nèi)生細菌群落組成Table 3 Major bacterial genera in fully ripe and green ripe apricots apricota

進一步分析發(fā)現(xiàn)，庫車小白杏采后內(nèi)生細菌群落共涉及33 個屬，其中相對含量大于0.01%的菌屬，青熟小白杏涉及14 個，完熟小白杏涉及12 個，表明隨著小白杏成熟度的增加，其內(nèi)生菌群的均勻度下降，這一結(jié)果與Biolog生態(tài)板法分析結(jié)果一致。通過對樣品中主要菌屬分析發(fā)現(xiàn)（表3），青熟小白杏的主要內(nèi)生菌群由蟑螂桿狀體科未分類屬、普氏菌屬和瘤胃球菌科NK4A214類群微生物組成，分別占總體的50.60%、9.64%和6.42%，約占總體的67%，但隨著小白杏成熟度的增加，其群落所占比例明顯下降，僅占完熟小白杏內(nèi)生細菌的1.39%、3.65%、2.09%；葡糖桿菌屬為完熟小白杏的絕對優(yōu)勢菌群，占總體的74.09%，其次為泛菌屬、克里斯滕森菌科R-7類群、普氏菌屬，分別占總體的4.17%、3.83%、3.65%。隨著小白杏成熟度的增加，葡糖桿菌屬所占比例增加了近17.5 倍，泛菌屬增加了約416 倍，而蟑螂桿狀體科未分類屬降低了約97.25%，普氏菌屬和瘤胃球菌科NK4A214菌群降低了約67.45%。

由上述可見，采后完熟庫車小白杏的內(nèi)生細菌群落組成明顯有別于青熟小白杏，且隨著采后成熟度的增加，其菌群組成結(jié)構(gòu)存在著明顯的更替。

3 討 論

植物內(nèi)生菌種類繁多，可廣泛分布于不同植物的不同部位，能產(chǎn)生多種活性代謝產(chǎn)物，如具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、殺蟲、免疫抑制、抗氧化和降糖等活性功能[20-24]，已成為重要的活性功能產(chǎn)物的來源。同時，內(nèi)生菌也可通過多種途徑參與植物的代謝、發(fā)育和成熟，是研究微生物與植物協(xié)同進化的重要研究材料。此前，國內(nèi)外對植物果實內(nèi)生菌的研究較少，特別是對新疆特色水果內(nèi)生菌的研究尚鮮見報道。本研究利用Biolog生態(tài)板法及高通量測序法，對庫車小白杏采后內(nèi)生細菌群落變化進行分析。研究表明，庫車小白杏采后內(nèi)生細菌群落代謝活性發(fā)生了明顯變化，完熟庫車小白杏內(nèi)生菌群落代謝活性遠高于青熟小白杏，約為青熟小白杏的143 倍。進一步分析表明，隨著庫車小白杏成熟度的增加，利用碳水化合物類、酚酸類和胺類內(nèi)生菌群落比例明顯降低，而利用氨基酸類、羧酸類、多聚物類內(nèi)生細菌群落比例升高。上述結(jié)果，可能與庫車小白杏屬于呼吸躍變型果實有關(guān)。

同時，對其采后內(nèi)生細菌群落組成變化分析表明，小白杏內(nèi)生細菌共包括47 個OTU，涉及15 個目，33 個屬。在青熟和完熟小白杏中，其兩者內(nèi)生細菌群落結(jié)構(gòu)差異明顯。在目一級的分類水平上，黃桿菌目、擬桿菌目和梭菌目菌株是青熟小白杏內(nèi)生細菌群落主要組成，占總菌群種類的83%；而完熟小白杏內(nèi)生細菌群落主要由紅螺菌目、腸桿菌目和梭菌目菌群組成，占總體的86%。隨著小白杏采后成熟度的增加，黃桿菌目、擬桿菌目菌群所占比例逐漸下降，而紅螺菌目、腸桿菌目菌群所占比例逐漸上升，梭菌目菌群變化不大。在屬一級的分類水平上分析表明，隨著小白杏成熟度的增加，其內(nèi)生菌群的均勻度下降，這一結(jié)果與Biolog生態(tài)板法分析結(jié)果相比分別提高了17.5 倍和416 倍，而蟑螂桿狀體科未分類屬所占比例下降最為明顯，差異約達97.25%；另外，普氏菌屬和瘤胃球菌科NK4A214菌群也降低了約67.45%。由上述可見，采后完熟庫車小白杏的內(nèi)生細菌群落組成明顯有別于青熟小白杏，且隨著采后成熟度的增加，其菌群組成結(jié)構(gòu)存在著明顯的更替。

現(xiàn)有研究表明，植物內(nèi)生菌結(jié)構(gòu)組成易受寄主生長發(fā)育而變化。鄭惠文等[24]對新疆杏果實發(fā)育過程中可溶性糖和有機酸變化的研究發(fā)現(xiàn)，杏果實中更易被細菌所利用的葡萄糖明顯下降，而蔗糖的含量明顯增加，這可能與完熟小白杏內(nèi)生細菌中利用碳水化合物菌群所占比例下降的有關(guān)。而隨著杏果實的成熟度的增加，果實中總酸下降，有機酸由蘋果酸積累型向蘋果酸、奎寧酸和檸檬酸共積累的模式轉(zhuǎn)變，造成果實中pH值上升，有機酸種類的增加[25-26]，可能刺激了利用羧酸類細菌的增長。同時，隨著成熟度的增加，果肉中果膠、可溶性淀粉等易分解多聚物類化合物的增加，以及營養(yǎng)成分中氨基酸的增加及溶出，均可能導致多聚物類、氨基酸類內(nèi)生細菌群落比例升高。而胡美姣[14]對采后芒果果實的研究發(fā)現(xiàn)，大多病原菌具有潛伏侵染的特性，會導致果實在采后貯運及銷售過程中發(fā)生快速腐爛。本研究發(fā)現(xiàn)，小白杏內(nèi)生細菌中葡糖桿菌屬、泛菌屬等相關(guān)植物軟腐病原菌在完熟期含量明顯上升，可能與庫車小白杏采后的軟化腐敗有關(guān)[26-30]，相關(guān)驗證工作正在開展。

另外，中國自古以來就有“杏傷人”的說法，即過多食用杏子對身體不利。通過對菌群分析發(fā)現(xiàn)，小白杏果肉內(nèi)生細菌中存在著多種與腸胃代謝相關(guān)菌群。如擬桿菌、克氏桿菌、理研菌科、瘤胃菌科、普雷沃氏菌屬等菌群，雖廣泛存在健康人群的口腔或腸道中，但當機體免疫功能紊亂或菌群失調(diào)時，如擬桿菌、普雷沃氏菌等能導致內(nèi)源性感染；而氣單胞菌屬和密螺旋體屬的菌群，可引起人體腹瀉等多種感染，在國外作為腹瀉病原菌進行檢測[31-37]。

另一方面，杏有降氣止咳平喘、潤腸通便的功效。本研究表明，庫車小白杏內(nèi)生菌中也存在多種相關(guān)有益菌群，如葡糖桿菌，可促進VC的合成，是合成降血糖藥物-米格列醇的關(guān)鍵中間體[34-35]；庫車小白杏內(nèi)生菌中存在著多種克里斯滕森菌、擬桿菌、瘤胃桿菌及理研菌等，其均與人體肥胖呈負相關(guān)[26,38]。有研究[39-40]發(fā)現(xiàn)，克里斯滕森菌科菌群可有效改變?nèi)撕屠鲜蟮人拗鞔x的方式，從而降低動物個體的體重指數(shù)。劉璨[34]研究發(fā)現(xiàn)擬桿菌菌群豐度與肥胖指數(shù)呈反比，其在健康人體中的含量明顯高于肥胖患者；通過對實驗小鼠進行飼喂擬桿菌菌液，可對肥胖大鼠有一定的減肥作用。相關(guān)研究[41-43]表明瘤胃菌科與脂肪因子水平具有明顯的相關(guān)性，在能量代謝中占主導地位。由此可見，杏的多種功能和功效可能與其內(nèi)生細菌群落有關(guān)，相關(guān)論點仍需更多的杏品種內(nèi)生菌研究的驗證。

上述研究結(jié)果不僅為庫車小白杏采后腐敗變質(zhì)內(nèi)在機理提供了基礎(chǔ)，為其貯存、保鮮提供了科學借鑒，也為闡釋小白杏營養(yǎng)學和醫(yī)學中功能的研究提供了理論依據(jù)。