嚴(yán)海嬌，贠建民*，白 杰，郭 娟，鄧展瑞，李多佳

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

粉紅單端孢（Trichothecium roseum）是一種在植物病害中不容忽視的病原真菌，易造成多種果蔬發(fā)生紅粉病，此外，粉紅單端孢還會產(chǎn)生對人和動物有害的霉菌毒素——單端孢霉烯族毒素[1-2]。目前，主要是采取化學(xué)抑菌劑控制病害，但是化學(xué)抑菌劑所帶來的殺菌劑毒性、病原物產(chǎn)生抗藥性等因素潛在危害人類健康及環(huán)境[3-5]。因此，亟需尋找一種新的、安全無害的抑菌方式來控制植物病害。

抗菌肽又稱抗微生物肽、宿主防御肽、抗生素肽，是生物體自身防御系統(tǒng)（如非特異性免疫）的重要組成部分[6-7]，具有抗細(xì)菌、真菌、病毒，抑殺癌細(xì)胞等多種生物活性，且不易產(chǎn)生抗藥性[8]?？咕牡倪@些特性使其能夠代替化學(xué)殺菌劑達(dá)到控制植物病害的目的。

芽孢桿菌是廣泛分布在自然界中的一種細(xì)菌，利用其產(chǎn)生的抗菌肽來防治植物病害已得到了多方面的應(yīng)用。一些由芽孢桿菌屬（Bacillus）產(chǎn)生的抗菌肽已經(jīng)實(shí)現(xiàn)商業(yè)化使用，如蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）產(chǎn)生的kanosamine、zwittermycin A[9-10]。國內(nèi)陳德鑫等[11]發(fā)現(xiàn)一株短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）MK21具有高效降低煙堿含量的功能，通過MK21處理后的煙葉樣品，達(dá)到刺激性降低、掩蓋雜氣和改善卷煙吸味的效果。王靜等[12]發(fā)現(xiàn)一株短小芽孢桿菌AR03對煙草黑脛病菌（Phytophthora parasitica var. nicotianae）具有拮抗活性，且AR03固體發(fā)酵菌劑對煙草黑脛病、煙草青枯?。≧ostonia solanacearum）混合發(fā)生病害有良好的田間防治效果。

本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中從腐敗的濕粉條中分離得到了1 株對粉紅單端孢有抑菌作用的短小芽孢桿菌HN-10菌株（由16S rRNA序列鑒定，登錄號：KT003271.1）。研究以短小芽孢桿菌HN-10發(fā)酵液為供試材料，通過多種層析方法對發(fā)酵液中活性物質(zhì)進(jìn)行分離純化并進(jìn)行抑菌活性鑒定。對經(jīng)鑒定得到的抗菌肽進(jìn)行氨基酸測序，最后通過生物信息學(xué)方法對此序列進(jìn)行同源性對比，確定其是否為新型抗菌肽，以期為開發(fā)新型生防制劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試菌

短小芽孢桿菌HN-10分離自甘肅省武山綠源貿(mào)易有限公司的腐敗濕粉條。

大腸埃希氏菌（Escherichia coli）CGMCC 1.8732、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CGMCC 1.8721、沙門菌（Salmonella）CGMCC 1.10754、粉紅單端孢（Trichothecium roseum）CGMCC 3.4509、鮮綠青霉（Penicillium visidicatum）CGMCC 3.5933、黑曲霉（Aspergillus niger）CGMCC 3.3928和傘枝犁頭霉（Absidia corymbifera）CGMCC 3.3535均由中國普通微生物菌種保藏管理中心提供；互隔交鏈孢（Alternaria alternata）由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，瓊脂15 g，水1 000 mL，pH 7.0，用于培養(yǎng)短小芽孢桿菌HN-10。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，水1 000 mL，用于培養(yǎng)粉紅單端孢。

1.1.3 試劑

AB-8大孔吸附樹脂 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；Sephadex G-100 上海玉博生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SCIENTZ-10ND冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；2992高效液相色譜儀 日本島津公司；Q Exactive質(zhì)譜儀 美國Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 抗菌活性的測定

短小芽孢桿菌HN-10抗細(xì)菌活性的測定采用瓊脂孔徑擴(kuò)散法[13]。將HN-10菌種接種于LB瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)48 h，刮取菌苔至LB液體培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)至1×109CFU/mL，吸取5 mL菌液平鋪于LB培養(yǎng)基平皿上。表層鋪滿后迅速吸干，用直徑5 mm的打孔器在上述培養(yǎng)基上打4 個(gè)孔，于孔徑中添加30 μL被測物質(zhì)，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，觀察結(jié)果并測量抑菌圈直徑。

短小芽孢桿菌HN-10抗真菌活性的測定采用瓊脂孔徑擴(kuò)散法。將直徑0.5 cm的病原真菌塊放置在PDA平板中央，在距菌塊2 cm處打4 個(gè)直徑為0.5 cm的孔，于孔徑中添加30 μL被測物質(zhì)，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，記錄抑菌直徑，以抑菌直徑評價(jià)抑菌效果大小，實(shí)驗(yàn)設(shè)3 個(gè)重復(fù)[14]。

最小抑菌濃度測定：采用連續(xù)稀釋法，對純化后的抗菌肽做2 倍遞減質(zhì)量濃度稀釋，分別為1.25、0.625、0.312 5、0.156 2、0.078 1、0.039、0.019 5、0.009 7、0.004 9、0.002 4、0.000 1 mg/mL，對粉紅單端孢做抑菌實(shí)驗(yàn)，測量抑菌圈直徑，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次[15]。

1.3.2 抗真菌肽的分離純化

1.3.2.1 抗菌物質(zhì)的粗提

取1 環(huán)短小芽孢桿菌HN-10接種至LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)3 d；將培養(yǎng)好后的菌液于4 ℃、10 000 r/min條件下離心20 min，收集上清液，然后向無菌的上清液中加入(NH4)2SO4至70%飽和度，4 ℃靜置，沉淀過夜；將沉淀后的菌液于4 ℃、10 000 r/min離心20 min，去除上清液，加入20 mmol/L pH 6.8磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）溶解沉淀，后放入截留分子質(zhì)量為12 000～14 000 Da的透析袋中脫去(NH4)2SO4，透析24 h后，收集袋內(nèi)樣品，即得到具有抗菌活性的粗提液。將粗提液進(jìn)行冷凍干燥濃縮，并測試其對粉紅單端孢的抑制活性。

1.3.2.2 抗真菌肽的分離純化

首先，采用AB-8大孔吸附樹脂對粗提物進(jìn)行純化，取20 mL粗提物，加載進(jìn)AB-8大孔吸附樹脂，70%乙醇溶液洗脫，流速為2 BV/h，每管4 mL收集洗脫液，檢測波長280 nm，以粉紅單端孢為指示菌，測其抑菌活性，收集活性組分，進(jìn)行冷凍干燥濃縮，-20 ℃保存，備用，便于下一步純化。將從AB-8大孔吸附樹脂收集到的活性組分通過Sephadex G-100 凝膠進(jìn)行純化，用20 mmol/L pH 6.8 PBS洗脫，流速為0.5 mL/min，檢測波長280 nm，以粉紅單端孢為指示菌，測其抑菌活性，收集活性組分，進(jìn)行冷凍干燥濃縮，-20 ℃保存，備用，便于下一步純化。

最后，將收集到的活性組分用半制備型反相高效液相色譜（reverse phase-high performance liquid chromatography，RP-HPLC）進(jìn)行分離純化。上樣溶液質(zhì)量濃度為5 mg/mL，用0.22 μm微孔濾膜過濾，備用。色譜條件：Kromasil C18柱（4.6 mm×250 mm），A相：0.1%三氟乙酸（tallow fatty acid，TFA）溶液， B相：0.1% TFA-乙腈溶液，流速1 mL/min，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量200 μL，檢測波長280 nm。洗脫程序：0～5 min，A相10%～5%，B相90%～95%；5～10 min，A相5%～0%，B相95%～100%；10～11 min，A相0%～10%，B相100%～90%；11～30 min，A相10%，B相90%，洗脫總時(shí)間為30 min[16]。根據(jù)出峰時(shí)間，收集樣品，并以粉紅單端孢為指示菌，測其抑菌活性，收集活性組分，進(jìn)行冷凍干燥濃縮，-20 ℃保存。

1.3.2.3 抗真菌肽氨基酸序列測定

將經(jīng)半制備型RP-HPLC收集到的活性組分B、C分別用胰蛋白酶酶解，以TFA溶液提取酶解肽段[17]。上述肽段用樣品溶解液（0.1%甲酸、2%乙腈）溶解，充分振蕩渦旋，4 ℃、13 200 r/min離心10 min，上清液轉(zhuǎn)移到上樣管中，進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解析串聯(lián)飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（matrix assisted laser desorption ionization time of fl ight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS/MS）鑒定氨基酸序列。

色譜條件：Acclaim PepMap RPLC C18柱（300 μm×5 mm，3 μm）；流動相A：0.1%甲酸，2%乙腈；流動相B：0.1%甲酸，80%乙腈。流速：300 nL/min。洗脫程序：B相：0～8 min，6%～9%；8～24 min，9%～14%；24～60 min，14%～30%；60～75 min，30%～40%；75～78 min，40%～95%。

分離后的肽段直接進(jìn)入Thermo Scientific Q Exactive質(zhì)譜儀進(jìn)行在線檢測，一級質(zhì)譜參數(shù)：分辨率：70 000；C-trap最大容量（AGC target）：3×106；C-trap最大注入時(shí)間：40 ms；掃描范圍：m/z 350～1 800。二級質(zhì)譜參數(shù)：分辨率：17 500；C-trap最大容量（AGC target）：1×105；C-trap最大注入時(shí)間：60 ms；動態(tài)排除：5 s。

將得到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)庫檢索：質(zhì)譜原始文件，使用Maxquant檢索uniprot全蛋白數(shù)據(jù)庫。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均采用Origin 8.0和Excel 2010處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗菌譜

實(shí)驗(yàn)表明，短小芽孢桿菌HN-10只對粉紅單端孢具有明顯的抑菌活性，而對其他3 株供試細(xì)菌和4 株供試真菌無抑制活性（表1）。

表1 短小芽孢桿菌HN-10對幾種病原細(xì)菌和真菌的拮抗作用Table 1 Antimicrobial activity of B. pumilus HN-10 strain toward several kinds of pathogenic bacteria and fungi

2.2 粗提物抗粉紅單端孢活性

圖1 粗提物對粉紅單端孢的拮抗作用Fig. 1 Antimicrobial activity of crude extract against T. roseum

從圖1可看出，抗菌粗提物在PDA平板上可以抑制粉紅單端孢，在病原菌與粗提物之間有一條明顯的抑制帶。

2.3 抗真菌肽分離純化

抗菌粗提物通過AB-8大孔吸附樹脂交換層析，經(jīng)抑菌活性測定，發(fā)現(xiàn)洗脫體積在28～52 mL之間有抑菌活性（圖2a、圖3a），抑菌圈直徑為（11±0.2）mm，收集這些活性組分，冷凍干燥。將收集到的活性組分通過Sephadex G-100凝膠層析進(jìn)一步分離，洗脫體積分別在34～36 mL和40～48 mL有抑菌活性（圖2b、圖3b），抑菌圈直徑分別為（9±0.2）mm和（12±0.2）mm，收集有活性組分，進(jìn)行冷凍干燥。

抗菌物質(zhì)粗提物經(jīng)過大孔樹脂和凝膠色譜兩步分離后，樣品組分相對較單一，隨后采用半制備型RP-HPLC分離純化后得到4 個(gè)峰A、B、C、D，收集并做抑菌實(shí)驗(yàn)。其中峰A抑菌活性較弱，抑菌圈直徑小于（0.5±0.2）mm，而峰B和C抑菌活性良好，抑菌圈直徑分別可達(dá)到（13±0.2）mm和（12±0.2）mm（圖2c、圖3c），峰D無活性。由于峰A活性弱，所以對A組分不進(jìn)行氨基酸序列分析。

圖2 抗真菌肽分離純化色譜圖Fig. 2 Purification of the antimicrobial peptide

圖3 各活性組分對粉紅單端孢的抑制活性Fig. 3 Antimicrobial activity of active fractions against T. roseum

2.4 最小抑菌濃度測定結(jié)果

最小抑菌濃度是能夠抑制細(xì)菌生長、繁殖的最低藥物濃度。通過抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)半制備型RP-HPLC純化后的抗真菌肽P-1在1 μg/mL條件下能夠抑制粉紅單端孢的生長，此時(shí)抑菌圈直徑為（10±0.5）mm。

2.5 抗真菌肽氨基酸序列分析

圖4 組分B（a）、C（b）的MALDI-TOF-MS/MS圖Fig. 4 Amino acid sequence of fractions B (a) and C (b) analyzed by MALDI-TOF-MS/MS

表2 P-I與APD數(shù)據(jù)庫中已知抗菌肽的比對Table 2 Alignment of AMPs from the APD database with P-1

將通過MALID-TOF-MS/MS得到的氨基酸序列，于NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）、APD數(shù)據(jù)庫（http://aps.unmc.edu/AP/main. php）、ExPASy（http://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam/）網(wǎng)站上進(jìn)行在線生物信息學(xué)分析。通過MALID-TOF-MS/MS（圖4）可知組分B與C為同一種肽，命名為P-1。推測組分B和C是同分異構(gòu)體，所以為同一種肽，具體原因有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)論證。抗真菌肽P-1由15 個(gè)氨基酸殘基組成，氨基酸序列為G-G-S-G-G-G-S-S-G-G-S-I-G-G-R，分子質(zhì)量為1 149.14 Da，疏水率為6%，是一種富含甘氨酸抗真菌肽。同時(shí)將P-1氨基酸序列與NCBI數(shù)據(jù)庫和APD數(shù)據(jù)庫作比對，發(fā)現(xiàn)P-1的氨基酸序列與APD數(shù)據(jù)庫中其他已知抗菌肽同源性較低，最高只達(dá)到45%（表2），因此，可判斷P-1為新型抗真菌肽。利用ProtParam軟件對抗真菌肽的理化參數(shù)進(jìn)行分析，結(jié)果如下：P-1理論等電點(diǎn)9.75，GRAVY為-0.453，帶電荷數(shù)+1，脂溶性指數(shù)26.00。

3 討 論

抗菌肽具有抗細(xì)菌、真菌、病毒及腫瘤等活性，對真核生物的正常細(xì)胞則無明顯毒副作用，且?guī)缀鯚o耐藥性[18-20]，因此，抗菌肽成為國內(nèi)外研究和開發(fā)的熱點(diǎn)?？咕膩碓磸V泛，可從植物、動物、微生物中提取出來，其中芽孢桿菌中含有大量的生物活性化合物，可作為研發(fā)新的抗菌肽的來源。

本實(shí)驗(yàn)通過硫酸銨沉淀、AB-8大孔吸附樹脂、Sephadex G-100凝膠和半制備型RP-HPLC從短小芽孢桿菌HN-10發(fā)酵液中逐級分離純化得到一種對粉紅單端孢有抑制作用的新型陽離子抗真菌肽，氨基酸序列為G-GS-G-G-G-S-S-G-G-S-I-G-G-R。由于這種抗真菌肽屬于短肽，所以合成較為簡單，而這有利于擴(kuò)大抗菌肽的應(yīng)用范圍。

已有研究報(bào)道，由短小芽孢桿菌產(chǎn)生的抗菌肽可作為生物防治劑應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上[21]。Rishad等[22]從短小芽孢桿菌MCB-7中分離得到的抗菌肽可顯著抑制黃曲霉、黑曲霉、煙曲霉菌和尖孢鐮刀菌等病原真菌。Shali等[23]從短小芽孢桿菌SG2分離得到的幾丁質(zhì)酶可抑制小麥上的病原體禾谷鐮刀菌和麥根腐平臍蠕孢的生長，可應(yīng)用于生物防治。

一般認(rèn)為，大多數(shù)的抗菌肽抑菌機(jī)制是抗菌肽能夠與細(xì)胞膜表面相互作用，使膜的通透性改變，陽離子抗菌肽的正電荷區(qū)域與細(xì)胞膜上的負(fù)電荷區(qū)域相互作用，使抗菌肽分子的疏水端插入細(xì)胞膜的脂質(zhì)膜中，進(jìn)而改變脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)，造成細(xì)胞內(nèi)容物泄漏，直接或間接地導(dǎo)致細(xì)胞死亡[6,24-25]。另外，抗菌肽的疏水性對抑菌活性也有影響，疏水性在抗菌肽插入細(xì)菌等微生物的脂質(zhì)雙分子層過程中具有重要作用。在一定范圍內(nèi)，雖然疏水性越大，抗菌肽的抗菌活力也就越強(qiáng)，但疏水性過高會導(dǎo)致抗菌肽自身聚集至沉淀析出，降低抗菌活性[26-28]。

由P-1的氨基酸序列可知，此種抗真菌肽為帶正電荷+1的陽離子肽，P-1疏水率只有6%，疏水性較弱，與疏水性強(qiáng)的抗菌肽相比，其抑菌作用也較弱。但是經(jīng)抑菌實(shí)驗(yàn)可看出，P-1的抑菌效果很好，這是由于P-1是一種富含甘氨酸肽，甘氨酸含量高達(dá)60%。

肽鏈中甘氨酸的存在使肽鏈結(jié)構(gòu)更加靈活，它們一般位于帶正電的雙親螺旋N端與疏水C端的連接部位，對活性起重要作用，能夠抑制革蘭氏陰性菌及真菌，同時(shí)也能夠通過破壞細(xì)胞膜的方式抑制癌細(xì)胞生長[18,29]。如從番石榴種子中提取的富含甘氨酸抗菌肽Pg-AMP1，能夠抑制革蘭氏陽性菌（大腸桿菌、克雷伯氏肺炎桿菌、銅綠假單胞菌）和革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌）生長[30]。Thompson等[31]曾報(bào)道，采用羧肽酶從C端上移除谷氨酰胺和氨基酸，大量暴露甘氨酸，增強(qiáng)了肽的抑菌活性，同時(shí)提高了肽的穩(wěn)定性。而這可得出甘氨酸是影響抗菌肽抑菌活性的一個(gè)關(guān)鍵因素。

在本研究中，已知抗菌肽P-1的氨基酸序列，但是這兩種抗菌肽如何作用細(xì)胞壁并導(dǎo)致細(xì)胞死亡的機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本研究通過硫酸銨沉淀、AB-8大孔吸附樹脂、Sephadex G-100凝膠以及半制備型RP-HPLC對短小芽孢桿菌HN-10發(fā)酵液進(jìn)行分級純化，最終得到純的抗菌肽P-1。利用MALDI-TOF-MS/MS分析確定該抗菌肽P-1由15 個(gè)氨基酸組成，分子質(zhì)量為1 149.14 Da，等電點(diǎn)9.75。實(shí)驗(yàn)已對抗真菌肽的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，但其具體空間結(jié)構(gòu)還未得出，有待于進(jìn)一步研究。