費(fèi)理文，王 勇*

（1.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，農(nóng)業(yè)部南方食用菌資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家食用菌工程技術(shù)研究中心，國家食用菌加工技術(shù)研發(fā)分中心，上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，上海 201403；2.中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院植物生理生態(tài)研究所，上海 200032）

萊鮑迪苷D（rebaudioside D，RD）是一種來源于甜葉菊的甜菊糖苷類物質(zhì)（圖1）[1]。甜菊糖苷類物質(zhì)組分眾多，目前已知甜葉菊來源的就有約40 多種，具有不同程度的甜味口感，隨著分離分析技術(shù)的提高，不斷有新組分的報(bào)道，它們在化學(xué)結(jié)構(gòu)上具有共同的四環(huán)二萜母環(huán)以及不同的糖基化側(cè)鏈修飾[2-5]。由于甜菊糖苷物質(zhì)具有低熱量、高甜度、高食用安全性[6-7]，目前甜葉菊中含量相對(duì)豐富的甜菊糖和萊鮑迪苷A（RA）已廣泛應(yīng)用于食品飲料、調(diào)味劑、酒類、乳制品等食品加工領(lǐng)域[8-11]。但是甜菊糖和RA具有較明顯的苦后味，口感上尚不能完全替代蔗糖[12]。而天然含量相對(duì)稀少的RD則具有相對(duì)更優(yōu)的口感[13]，是甜菊糖類甜味劑升級(jí)的方向，美國FDA于2017年認(rèn)證RD為“一般安全”物質(zhì)作為食品添加劑應(yīng)用于食品工業(yè)[14]。

圖1 RA和RD化學(xué)結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 1 Structures of rebaudioside A and rebaudioside D

由于RD的天然來源含量低，從植物提取的方式無法滿足市場需求，因此多有研究挖掘其生物合成途徑并開發(fā)其異源合成方法[15-20]。本實(shí)驗(yàn)室在先前的工作中，采用來自水稻的可高效催化RA生物合成RD的糖基轉(zhuǎn)移酶EUGT11，構(gòu)建重組大腸桿菌，實(shí)現(xiàn)了全細(xì)胞催化合成RD[21]。在此生物催化反應(yīng)中，糖基轉(zhuǎn)移酶EUGT11可催化RA的C13-羧基位置上的糖基與活化糖配體尿苷二磷酸葡萄糖（uridine diphosphate glucose，UDPG）提供的葡萄糖進(jìn)一步形成1,2-β-D-葡萄糖苷鍵，從而獲得RD。雖然該重組大腸桿菌可催化RD合成，但是RD產(chǎn)量低下，且需要向催化體系外源添加活化糖配體UDPG才能有效推動(dòng)催化反應(yīng)[21]。而UDPG成本高，以外源添加形式進(jìn)行生產(chǎn)不可行，因此需要進(jìn)一步探索增加異源催化細(xì)胞內(nèi)源性UDPG供給的改造策略。參考KEGG中糖代謝途徑后，蔗糖合酶成為理想的候選酶。蔗糖合酶（EC 2.4.1.13）參與植物蔗糖代謝，催化蔗糖和尿核苷二磷酸（uridine diphosphate，UDP）生成果糖和UDPG的可逆反應(yīng)，反應(yīng)方向的偏向性受到環(huán)境pH值等條件的影響，不同植物來源的蔗糖合酶偏向條件各不相同[22]。蔗糖裂解方向反應(yīng)的產(chǎn)物UDPG可以為RA生產(chǎn)RD的糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)提供活化的糖配體，因此利用蔗糖合酶與糖基轉(zhuǎn)移酶的偶聯(lián)可實(shí)現(xiàn)生物催化體系UDPG的原位再生，從而滿足RD生物合成過程中對(duì)活化糖配體需求，同時(shí)可通過再生反應(yīng)避免糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)產(chǎn)物UDP的積累對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物抑制效應(yīng)，不斷推動(dòng)反應(yīng)向RD合成進(jìn)行（圖2）。參考目前已有研究的植物蔗糖合酶的酶學(xué)參數(shù)[22-23]，并結(jié)合EUGT11催化的適宜條件，選擇擬南芥來源的AtSUS3參與酶偶聯(lián)催化合成RD的實(shí)驗(yàn)。

圖2 雙酶偶聯(lián)生物合成RD示意圖Fig. 2 Illustration of biotransformation of RD by coupling EUGT11 and AtSUS3

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

載體pET28a、pETDuet-1 美國Novagen公司；菌株Escherichia coli DH10B、E. coli BL21（DE3） 上海澤葉生物科技有限公司。質(zhì)粒pYF09及相應(yīng)重組工程菌為本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建[21]。

引物合成及測序、異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）、氨芐青霉素、卡納霉素 生工生物工程（上海）有限公司；各限制性內(nèi)切酶 New England Biolabs公司；PrimerSTAR Max大連TaKaRa公司；質(zhì)粒抽提及DNA片段純化與膠回收試劑盒 美國Axygen公司；Vazyme ClonExpress II一步法克隆試劑盒 南京諾維贊生物科技有限公司；RA標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞97%） 美國Thermo Fisher公司；RD標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞95%） 四川盈嘉合生物科技有限公司；酵母提取物、胰蛋白胨 英國Oxoid公司；其余化學(xué)試劑上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、Ultra 3000高效液相色譜儀 美國Thermo Fisher公司；小型離心機(jī)、高速冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司；搖床 上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 AtSUS3的克隆

圖3 質(zhì)粒pLW105（a）及pLW108（b）示意圖Fig. 3 Schematics showing plasmid pLW105 (a) and pLW108 (b)

根據(jù)NCBI上AtSUS3（NM_116461.3）的開放閱讀框240～266 9 bp序列以及擬插入載體pET28a位置BamHINotI兩端的序列設(shè)計(jì)引物對(duì)，正向引物：5’-AGCAAAT GGGTCGCGGATCCATGGCAAACCCTAAGCTCA-3’，反向引物：5’-TGCTCGAGTGCGGCCGCTCAGTCATCG GCGGTTGA-3’。隨后以擬南芥cDNA為模板進(jìn)行PCR，50 μL反應(yīng)體系中添加25 μL PrimerSTAR Max、上述引物（10 μmol/L）各1 μL、擬南芥cDNA模板0.4 μL，去離子水補(bǔ)滿余下體積，反應(yīng)條件為98 ℃ 3 min，隨后25 個(gè)循環(huán)98 ℃ 10 s、55 ℃ 15 s、72 ℃ 30 s，接著72 ℃ 10 min，降溫至16 ℃。PCR結(jié)束后反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電泳并切膠回收。經(jīng)純化的PCR產(chǎn)物以Infusion法裝配至載體pET28a BamHINotI位點(diǎn)之間，構(gòu)建質(zhì)粒pLW105（圖3），轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B，涂布含50 μg/mL卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基平板，37 ℃過夜培養(yǎng)后挑取克隆雙酶切以及測序驗(yàn)證。

1.3.2 共表達(dá)EUGT11與AtSUS3質(zhì)粒pLW108的構(gòu)建

前期工作中構(gòu)建的pYF09是以pETDuet1為載體，在P1的多克隆位點(diǎn)整合EUGT11基因[21]。鑒于pETDuet1系雙啟動(dòng)子質(zhì)粒，因此在其P2的多克隆位點(diǎn)插入蔗糖合酶AtSUS3基因獲得共表達(dá)質(zhì)粒pLW108。根據(jù)NCBI上AtSUS3（NM_116461.3）的開放閱讀框240～2 669 bp序列以及擬插入載體pETDuet1P2下游FseI-KpnI位置兩端的序列設(shè)計(jì)引物對(duì)，正向引物：5’-TCAATTGGATATCGG CCGGCCAGATGGCAAACCCTAAGCTCA-3’，反向引物：5’-CTTTACCAGACTCGAGGGTACCTCAGTCATC GGCGGTTGA-3’，以pLW105為模板進(jìn)行PCR，條件同構(gòu)建pLW105。PCR結(jié)束后產(chǎn)物進(jìn)行電泳并切膠回收。純化后的PCR產(chǎn)物以Infusion法克隆至質(zhì)粒pYF09（FseI、KpnI雙酶切），所構(gòu)質(zhì)粒pLW108（圖3）轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B，涂布含100 μg/mL 氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板，37 ℃過夜培養(yǎng)后挑取克隆子測序驗(yàn)證。

1.3.3 細(xì)胞催化合成RD

將測序驗(yàn)證正確的pLW108轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主BL21（DE3）。挑取含100 μg/mL氨芐青霉素的LB轉(zhuǎn)化平板上的單克隆接種至含抗生素的液體LB培養(yǎng)基，37 ℃搖床轉(zhuǎn)速250 r/min培養(yǎng)過夜。然后以1%接種量接種至100 mL含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，同樣條件培養(yǎng)約1.5 h檢測OD600nm達(dá)到0.3～0.4左右時(shí)停止培養(yǎng)，菌液降溫至16 ℃左右后加入IPTG誘導(dǎo)，誘導(dǎo)劑IPTG終濃度為0.1 mmol/L。隨后將培養(yǎng)菌液置于16 ℃，180 r/min轉(zhuǎn)速培養(yǎng)18 h。培養(yǎng)結(jié)束后離心收集菌體，以100 mmol/L pH 8磷酸鈉緩沖液重懸清洗2 遍后用于細(xì)胞催化反應(yīng)。催化體系為2 mL，催化體系以100 mmol/L pH 8磷酸鈉緩沖液配制，每毫升含0.2 g濕菌體、60 mmol/L檸檬酸三鈉、1 mmol/L RA、10 g/L普朗尼克F68、0.1 mmol/L ZnCl2，以及質(zhì)量濃度40 g/100 mL蔗糖。催化反應(yīng)條件為反應(yīng)溫度37 ℃，反應(yīng)時(shí)間24 h。平行實(shí)驗(yàn)5 次，所得樣品分析及統(tǒng)計(jì)方法見1.3.5節(jié)。

1.3.4 粗酶催化合成RD

裂解細(xì)胞催化的細(xì)胞培養(yǎng)方法同全細(xì)胞催化。在培養(yǎng)結(jié)束后離心收集菌體，用100 mmol/L pH 8磷酸鈉緩沖液清洗2 遍后重懸于100 mmol/L pH 8磷酸鈉緩沖液中，菌懸液濃度為每毫升反應(yīng)液0.1 g濕菌體，置于冰上超聲破碎至菌懸液清澈。隨后以此破碎菌懸液中添加其他反應(yīng)物進(jìn)行催化反應(yīng)，催化反應(yīng)體系各添加成分終含量為1 g/L RA，0.1 mmol/L ZnCl2，以及不同質(zhì)量濃度蔗糖分別為0、0.5、1、5 g/100 mL和10 g/100 mL。反應(yīng)溫度37 ℃，反應(yīng)時(shí)間24 h，每組條件平行實(shí)驗(yàn)5 次。

1.3.5 檢測與統(tǒng)計(jì)分析

RA、RD由高效液相色譜進(jìn)行檢測。色譜柱Thermo Hypersil Gold AQ（250 mm×4.6 mm，5 μm），檢測波長205 nm，柱溫控制40 ℃，進(jìn)樣量40 μL。色譜條件為：A相水，B相乙腈，0～5 min，25% B；5～30 min，25%～65% B；30～34 min，65% B；34～35 min，65%～25% B；35～40 min，25% B。標(biāo)準(zhǔn)曲線以RA、RD標(biāo)準(zhǔn)品配制制作。RA標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.260 6x-0.931 8；RD標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.202 5x-0.135 7。催化反應(yīng)結(jié)束后的反應(yīng)體系離心取上清液，0.2 μm濾膜過濾后進(jìn)行液相分析。數(shù)據(jù)由SPSS軟件中GLM One-Way ANOVA進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蔗糖合酶基因AtSUS3的克隆

圖4 蔗糖合酶AtSUS3的克隆與質(zhì)粒pLW105的構(gòu)建Fig. 4 Cloning of AtSUS3 gene and construction of pLW105

以1.3.1節(jié)方法克隆蔗糖合酶基因AtSUS3，裝配至載體pET28a，構(gòu)建質(zhì)粒pLW105。由圖4可知，以BamHI和NotI雙酶切pLW105，凝膠電泳結(jié)果顯示2 條條帶，較大的條帶系載體pET28a骨架（約5 369 bp），較小的條帶大小在2 000～3 000 bp之間，2 500 bp左右，與AtSUS3實(shí)際的2 430 bp接近，結(jié)合測序結(jié)果，表明質(zhì)粒pLW105構(gòu)建成功。

2.2 糖基轉(zhuǎn)移酶基因與AtSUS3基因串聯(lián)質(zhì)粒構(gòu)建結(jié)果

獲得蔗糖合酶克隆后，將其與催化RA合成RD的糖基轉(zhuǎn)移酶EUGT11基因在雙啟動(dòng)子質(zhì)粒pETDuet1上共同表達(dá)，構(gòu)建酶偶聯(lián)協(xié)同作用質(zhì)粒pLW108。由于表達(dá)EUGT11的質(zhì)粒pYF09本身就是以pETDuet1為載體構(gòu)建的，因此在構(gòu)建pLW108時(shí)，只需將AtSUS3基因序列裝配至該雙啟動(dòng)子載體的第2個(gè)啟動(dòng)子下游即可。按照1.3.2節(jié)方法構(gòu)建pLW108后，由于AtSUS3基因序列內(nèi)存在KpnI識(shí)別序列，因此酶切驗(yàn)證時(shí)選取質(zhì)粒上另外兩個(gè)單一位點(diǎn)BamHI（位于質(zhì)粒107 bp）以及EcoRI（位于質(zhì)粒2 373 bp）進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，以此雙酶切后應(yīng)該獲得2 個(gè)片斷，大小分別為2 266 bp和6 928 bp。由圖5可知，電泳結(jié)果顯示兩條條帶分別位于大約2 500 bp以及7500 bp，與預(yù)期片斷大小相符，結(jié)合測序結(jié)果，確認(rèn)AtSUS3已經(jīng)成功插入目標(biāo)位置。

圖5 酶偶聯(lián)共表達(dá)質(zhì)粒pLW108的酶切驗(yàn)證Fig. 5 Restriction digestion of pLW108 co-expressing EUGT11 and AtSUS3

2.3 偶聯(lián)雙酶全細(xì)胞催化合成RD

為了驗(yàn)證AtSUS3的效果，首先在不添加外源UDPG的情況下，用共轉(zhuǎn)化pYF09及pLW105雙質(zhì)粒的BL21（DE3）進(jìn)行細(xì)胞催化，結(jié)果表明反應(yīng)上清液中RD質(zhì)量濃度約930 mg/L，RA底物摩爾轉(zhuǎn)化率大于80%，樣品上清液中僅余少量RA（約6～20 mg/L）（圖6、7）。而對(duì)照pYF09-BL21（DE3）在相同條件下，RD質(zhì)量濃度約為23 mg/L，底物摩爾轉(zhuǎn)化率2.3%（圖6、7）。這一結(jié)果說明引入了UDPG再生循環(huán)之后，催化反應(yīng)的瓶頸獲得了非常明顯的緩解?？紤]到雙質(zhì)粒轉(zhuǎn)化對(duì)今后產(chǎn)品開發(fā)影響，隨后構(gòu)建了共表達(dá)雙酶的質(zhì)粒pLW108，催化效果與雙質(zhì)粒轉(zhuǎn)化沒有顯著差異（圖7）。

圖6 不同大腸桿菌工程菌轉(zhuǎn)化RA生產(chǎn)RD的液相色譜圖Fig. 6 HPLC chromatograms showing biotransformation of RD by different engineered E. coli strains

圖7 攜帶不同質(zhì)粒的大腸桿菌BL21（DE3）工程菌催化RA合成RD的結(jié)果Fig. 7 RD yields with different engineered E. coli BL21(DE3) strains

由于推動(dòng)UDPG再生的重要底物是外源添加的蔗糖，因此催化體系內(nèi)蔗糖質(zhì)量濃度對(duì)催化的影響至關(guān)重要。研究一系列外源蔗糖質(zhì)量濃度后發(fā)現(xiàn)，蔗糖質(zhì)量濃度50 g/100 mL條件下，RD產(chǎn)量最佳，可達(dá)1 100 mg/L，底物轉(zhuǎn)化率高于95%（圖8）。但是細(xì)胞催化體系內(nèi)蔗糖質(zhì)量濃度高于40 g/100 mL時(shí)，反應(yīng)結(jié)束時(shí)細(xì)胞呈現(xiàn)部分裂解狀態(tài)，不能稱為全細(xì)胞催化，而且高質(zhì)量濃度的蔗糖殘留于反應(yīng)體系，會(huì)給后續(xù)的分離純化造成困難。因此下一步的工作需要研究降低催化體系蔗糖質(zhì)量濃度的策略。

圖8 蔗糖質(zhì)量濃度對(duì)工程菌全細(xì)胞催化合成RD的影響Fig. 8 Effect of sucrose concentration on RD yield by whole cell catalysis

2.4 共表達(dá)雙酶細(xì)胞破碎物催化合成RD

以全細(xì)胞進(jìn)行催化時(shí)，為了獲得高效的UDPG再生，需要向體系內(nèi)添加高質(zhì)量濃度的蔗糖（圖9）以形成有效的胞內(nèi)濃度，提示即使體系內(nèi)添加了細(xì)胞透性劑，工程菌細(xì)胞的細(xì)胞膜仍然影響蔗糖進(jìn)入細(xì)胞。為降低蔗糖用量，考慮可以用共表達(dá)雙酶的工程菌細(xì)胞破碎粗酶進(jìn)行“一鍋法”催化合成RD。用粗酶進(jìn)行反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)測試0～10 g/100 mL的蔗糖用量，結(jié)果顯示蔗糖質(zhì)量濃度5 g/100 mL條件下RD產(chǎn)量最高，達(dá)到1 051 mg/L，RA底物摩爾轉(zhuǎn)化率為93%（圖9）。同全細(xì)胞催化相比，粗酶催化實(shí)現(xiàn)了更低質(zhì)量濃度蔗糖條件下RD的高效合成。

圖9 糖基轉(zhuǎn)移酶EUGT11與蔗糖合酶AtSUS3粗酶偶聯(lián)催化合成RDFig. 9 One-pot biocatalysis of RD by raw cell lyse containing EUGT11 and AtSUS3

3 討 論

隨著天然產(chǎn)物生物合成途徑挖掘工作的推進(jìn)，異源表達(dá)系統(tǒng)生物合成高附加值的天然來源糖苷類化合物是天然產(chǎn)物合成生物學(xué)的重要發(fā)展方向。由于異源表達(dá)底盤大腸桿菌的代謝系統(tǒng)先天缺少糖基化反應(yīng)，因此存在內(nèi)源性UDPG供給不足的問題[24]。為了增加底盤細(xì)胞內(nèi)源UDPG供給，目前已見報(bào)道的代謝工程改造策略主要從兩個(gè)方面入手，一方面是對(duì)底盤細(xì)胞自身的UDPG代謝路徑進(jìn)行改造，通過敲除和（或）替換UDPG生物合成和代謝路徑上的相關(guān)基因，結(jié)合過表達(dá)UDPG的合成酶引導(dǎo)UDPG的富集，另一方面是挖掘自然界其他物種的UDPG合成通路引入底盤提高UDPG含量。

單獨(dú)對(duì)底盤細(xì)胞已有UDPG生物合成途徑改造成效往往并不明顯，敲除UDPG合成路線上的分支代謝不能有效提高UDPG供給[25-27]。因此對(duì)已有路徑的改造往往與外源引入其他途徑結(jié)合從而實(shí)現(xiàn)理想的UDPG供給。例如De Bruyn等[27-28]以Bifidobacterium adolescentis的蔗糖磷酸化酶（EC 2.4.1.7）替換大腸桿菌底盤原有的蔗糖水解酶，將菌體生長與UDPG合成分開并富集UDPG合成前體1-磷酸葡萄糖，敲除大腸桿菌內(nèi)UDPG的生物合成路徑中消耗1-磷酸葡萄糖各途徑多個(gè)基因以及UDPG降解酶基因ushA，再結(jié)合過表達(dá)催化前體1-磷酸葡萄糖生成UDPG的UTP-1-磷酸葡萄糖尿苷轉(zhuǎn)移酶構(gòu)建了糖基化平臺(tái)合成糖基化酚類和槲皮苷。Weyler等[29]則僅敲除了催化6-磷酸葡萄糖與1-磷酸葡萄糖互變的磷酸變位酶，結(jié)合來自Leuconostoc mensenteroides的蔗糖磷酸化酶構(gòu)建了高效合成UDPG的菌株，在不添加ATP的情況下達(dá)到了54%的底物轉(zhuǎn)化率。事實(shí)上對(duì)底盤已有UDPG的改造相較外源引入U(xiǎn)DPG合成通路來說，并不是必要的操作。Pei Jianjun等[30]采用重組Bifidobacterium adolescentis的蔗糖磷酸化酶結(jié)合過表達(dá)UTP-1-磷酸葡萄糖尿苷轉(zhuǎn)移酶實(shí)現(xiàn)了內(nèi)源性UDPG的富集，以此方法生物催化黃芪苷，產(chǎn)量達(dá)到1.7 g/L，底物轉(zhuǎn)化率91.9%。

由于蔗糖磷酸化酶（EC 2.4.1.7）的產(chǎn)物是果糖和UDPG的前體1-磷酸葡萄糖，因此引入該酶的同時(shí)需要加強(qiáng)UTP-1-磷酸葡萄糖尿苷轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)才能實(shí)現(xiàn)UDPG的富集。而除了蔗糖磷酸化酶之外，還有一個(gè)簡潔的UDPG富集策略，即引入蔗糖合酶，同糖基化反應(yīng)形成偶聯(lián)原位再生UDPG。蔗糖合酶對(duì)糖基化反應(yīng)的貢獻(xiàn)是雙效的，一方面通過消耗蔗糖和UDP再生UDPG，另一方面消耗了UDP可防止UDP積累抑制糖基化反應(yīng)。但是蔗糖合酶催化的反應(yīng)是可逆的，并且其作為植物糖代謝的重要酶類廣泛存在，對(duì)于UDPG富集所需的蔗糖裂解方向傾向的條件各有不同，因此選擇與目標(biāo)產(chǎn)物糖基化反應(yīng)搭配得宜的蔗糖合酶成為雙酶高效偶聯(lián)催化糖基化產(chǎn)物的關(guān)鍵。Masada等[31]采用擬南芥（Arabidopsis thaliana）的AtSUS1用于姜黃素苷的合成，可大大降低外源UDPG的添加量至原有添加量的1/10。AtSUS1亦有用于催化合成RA的報(bào)道，但體系內(nèi)需要添加UDP[32]。Huang等[33]則選取來自大豆的蔗糖合酶GmSUS構(gòu)建UDPG再生平臺(tái)，用于合成多種糖基化小分子，其中香葉苷的產(chǎn)率可達(dá)99%。本實(shí)驗(yàn)選擇擬南芥AtSUS3與糖基轉(zhuǎn)移酶EUGT11偶聯(lián)，因?yàn)榕c其他已有報(bào)道的蔗糖合酶的酶學(xué)特性相比，AtSUS3可以在EUGT11的催化條件下高效再生UDPG[22]。實(shí)際結(jié)果也表明AtSUS3與EUGT11結(jié)合可在不外源添加UDPG或UDP的條件下高效催化RD合成。

高效異源催化合成RD有賴于篩選出活性與專一性均優(yōu)異的糖基轉(zhuǎn)移酶，以及充足的內(nèi)源性UDPG供給。本實(shí)驗(yàn)選擇高效專一糖基轉(zhuǎn)移酶EUGT11，聯(lián)合適宜糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)條件下高效循環(huán)再生UDPG的蔗糖合酶AtSUS3，實(shí)現(xiàn)了僅添加底物RA和蔗糖為起始物料的RD高效合成，為開發(fā)甜菊糖苷類珍稀組分的生產(chǎn)提供了參考基礎(chǔ)。