王 瑤，李 琪，李平蘭*

（北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，教育部-北京市功能乳品重點實驗室，北京 100083）

乳酸細(xì)菌素是菌體在轉(zhuǎn)錄翻譯過程中通過核糖體機(jī)制合成，并分泌到菌體體外的一類具有抑菌活性的蛋白質(zhì)或多肽，具有無毒副作用、無抗藥性及易被人體降解的特點，是一種天然的食品防腐保鮮劑[1-2]。目前已經(jīng)報道了許多新的細(xì)菌素及產(chǎn)生菌，如植物乳桿菌LPL-1產(chǎn)生的植物乳桿菌素LPL-1[3]、動物雙歧桿菌B04產(chǎn)生的雙歧桿菌素A[4]與類植物乳桿菌L-ZS9產(chǎn)生的類植物乳桿菌素L-ZB1[5]等，但細(xì)菌素的產(chǎn)量嚴(yán)重制約了其工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用[6]。

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）是食品發(fā)酵工業(yè)中常見的益生菌，并且是GRAS（generally regarded as safe）微生物成員[7]，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于奶制品、肉制品及果蔬發(fā)酵食品中[8-9]。產(chǎn)細(xì)菌素的植物乳桿菌不僅具有益生特性，而且具有抑菌特性，在微生物菌群中，細(xì)菌素可以作為抗菌肽，抑制有害菌群的增殖[10]，植物乳桿菌素Y[11]、植物乳桿菌素163[12]與植物乳桿菌素JLA-9[13]等可以明顯抑制食源性腐敗菌單核細(xì)胞性李斯特菌、沙門菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌與志賀菌等，因此可以應(yīng)用于食品的防腐保鮮；可以作為定植肽，促進(jìn)有益菌群的定植[14]，腸道菌素SN11[15]不僅可以作為飼料添加劑，而且可以調(diào)節(jié)動物的腸道菌群，促進(jìn)有益菌定植，因此可以應(yīng)用于飼料加工領(lǐng)域；同時又能作為信號肽，增強(qiáng)免疫細(xì)胞的免疫性，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[16]，大腸桿菌素可以抑制腫瘤細(xì)胞DNA酶的活性，對癌癥具有一定的抑制作用[17]，因此可以用于醫(yī)療健康領(lǐng)域。與抗生素不同，細(xì)菌素不僅對食源性致病菌具有抗菌性，而且對人體內(nèi)蛋白酶具有敏感性，因此，天然的細(xì)菌素不僅具有取代抗生素的潛力[18]，而且在食品發(fā)酵與食品防腐保鮮領(lǐng)域具有應(yīng)用潛力。

植物乳桿菌LPL-1不僅是一株新的菌種，而且所產(chǎn)細(xì)菌素為新的IIa類細(xì)菌素，有作為天然食品生物防腐劑的巨大應(yīng)用潛力，然而菌體自身所產(chǎn)細(xì)菌素的產(chǎn)量比較低，其合成不僅受到自身誘導(dǎo)肽的調(diào)控[19]，而且與培養(yǎng)基的組成及培養(yǎng)條件有關(guān)。本研究以植物乳桿菌LPL-1為研究對象，采用MRS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，通過單因素試驗、Plackett-Burman試驗及響應(yīng)面法優(yōu)化植物乳桿菌素LPL-1的發(fā)酵條件，獲得該菌種產(chǎn)生細(xì)菌素的最佳發(fā)酵條件，并探究其生化特性，為該菌種產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)細(xì)菌素提供一定的實踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌LPL-1分離自發(fā)酵魚，指示菌單核細(xì)胞性李斯特菌（Listeria monocytogenes ATCC 54002）由實驗室保存。MRS培養(yǎng)基各組成成分購自西隴科學(xué)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DNP-9162恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏試驗設(shè)備有限公司；YXQ-LS-S高壓蒸汽滅菌鍋 上海博迅實業(yè)有限公司；TG-22高速離心機(jī) 湖南平凡科技有限公司；SCL-1300垂直潔凈工作臺 北京賽伯樂實驗儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌素的提取

按照1%的接種量將植物乳桿菌LPL-1接種至100 mL MRS培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，8 000 r/min離心15 min收集上清液，按照1∶3比例加入-20 ℃預(yù)冷的丙酮，-20 ℃放置1 h取出，8 000 r/min離心15 min收集沉淀，后用-20 ℃預(yù)冷的丙酮等體積洗滌脫水，8 000 r/min離心15 min收集沉淀，沉淀室溫干燥用于計算酶活力。

1.3.2 抑菌活性的檢測

采用牛津杯雙層平板擴(kuò)散法測定細(xì)菌素的抑菌活性[20]。將提取的細(xì)菌素進(jìn)行二倍稀釋，取樣100 μL進(jìn)行抑菌實驗，觀察不到抑菌圈出現(xiàn)的最高稀釋度定義為一個活力單位（1 AU），其倒數(shù)即是原液的細(xì)菌素相對抑菌效價值（AU/mL）。

效價值標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：將己知效價值的細(xì)菌素稀釋為80%、60%、40%與20%，分別取100 μL進(jìn)行抑菌實驗，以對應(yīng)抑菌圈直徑為橫坐標(biāo)，效價值對數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=0.105x+0.919（R2=0.996）。

1.3.3 單因素試驗

選擇發(fā)酵溫度、發(fā)酵初始pH值、裝液量、接種量與發(fā)酵時間作為影響抑菌活性的主要因素，通過單因素試驗選擇Plackett-Burman試驗的影響因素與水平。

1.3.3.1 發(fā)酵溫度的影響

分別以1%接種量接種植物乳桿菌LPL-1，發(fā)酵初始pH 6.0，培養(yǎng)溫度分別設(shè)為25、30、37、40、45 ℃，培養(yǎng)時間24 h。發(fā)酵結(jié)束后檢測抑菌活性。

1.3.3.2 發(fā)酵初始pH值的影響

分別設(shè)置pH 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0與7.5，以1%接種量接種植物乳桿菌LPL-1，培養(yǎng)溫度30 ℃，發(fā)酵24 h結(jié)束后，檢測抑菌活性。

1.3.3.3 裝液量的影響

分別設(shè)置20%、40%、60%、80%與100%的裝液量，以1%接種量接種植物乳桿菌LPL-1，發(fā)酵初始pH 6.0，培養(yǎng)溫度30 ℃，發(fā)酵24 h結(jié)束后，檢測抑菌活性。

1.3.3.4 接種量的影響

分別設(shè)置0.5%、1%、1.5%、2%、3%與5%的接種量接種植物乳桿菌LPL-1，發(fā)酵初始pH 6.0，培養(yǎng)溫度30 ℃，發(fā)酵24 h結(jié)束后，檢測抑菌活性。

1.3.3.5 發(fā)酵時間的影響

以1%接種量接種植物乳桿菌LPL-1、發(fā)酵初始pH 6.0、培養(yǎng)溫度30 ℃，每隔4 h取樣并測定發(fā)酵液的抑菌活性和OD600nm。

1.3.4 Plackett-Burman試驗

根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，從各試驗因素的最大響應(yīng)區(qū)間中選擇高低兩個水平，利用Design-Expert 10.0軟件設(shè)計Plackett-Burman試驗，試驗次數(shù)選擇N為12。考察發(fā)酵溫度、初始pH值、接種量、裝液量和發(fā)酵時間5個因素對植物乳桿菌LPL-1產(chǎn)細(xì)菌素的影響，具體設(shè)計及響應(yīng)區(qū)間如表1所示。通過各試驗的結(jié)果以及Design-Expert 10.0軟件對各因素的方差、效應(yīng)值和貢獻(xiàn)率3 個指標(biāo)進(jìn)行分析，為下一步的研究從選取的因素中篩選出最重要的3 個顯著因素。

表1 Plackett-Burman試驗設(shè)計Table 1 Code and level of independent variables used for Plackett-Burman design

1.3.5 最陡爬坡試驗

表2 最陡爬坡試驗設(shè)計Table 2 Steepest ascent design

根據(jù)Plackett-Burman試驗所得到的顯著因素及效應(yīng)值來設(shè)計最陡爬坡試驗的變化方向和變化步長。在所選擇的顯著因素中，若效應(yīng)值為正，則變化方向表現(xiàn)為增加；若效應(yīng)值為負(fù)，則變化方向表現(xiàn)為減少，最陡爬坡試驗具體設(shè)計方案如表2所示。

1.3.6 Box-Behnken響應(yīng)面試驗

以最陡爬坡試驗中的拐點作為中心點，以Plackett-Burman試驗中的顯著影響因素為試驗因素，以細(xì)菌素相對抑菌效價為響應(yīng)值，通過Design-Expert 10.0軟件設(shè)計3因素3水平Box-Behnken響應(yīng)面試驗。具體方案如表3所示。對效價值進(jìn)行二次多元回歸方程擬合，得到各因素與響應(yīng)值之間函數(shù)關(guān)系的回歸方程，根據(jù)試驗生成的等高線和響應(yīng)面圖確定最優(yōu)的發(fā)酵條件。

表3 Box-Behnken試驗設(shè)計Table 3 Code and level of independent variables used for Box-Behnken desgin

1.3.7 模型的驗證

利用響應(yīng)面模型優(yōu)化的最佳條件進(jìn)行發(fā)酵實驗，比較模型預(yù)測值與實驗值，驗證模型的有效性。

1.3.8 植物乳桿菌素LPL-1生化特性分析

1.3.8.1 熱穩(wěn)定性

分別于25、60、80 ℃與100 ℃加入粗提的細(xì)菌素樣品，處理15 min和30 min，取出，恢復(fù)室溫（25 ℃）后進(jìn)行抑菌實驗，測定抑菌活性，并以25 ℃保存的細(xì)菌素樣品為對照，計算各處理組細(xì)菌素的相對抑菌效價保留率，研究溫度對細(xì)菌素抑菌活性的影響。

1.3.8.2 酸堿穩(wěn)定性

用3 mol/L的鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)磷酸緩沖液pH值為2、3、4、5、6、7、8、9、10，再溶解粗提得到的細(xì)菌素沉淀，得到相應(yīng)pH值處理的細(xì)菌素溶液，進(jìn)行抑菌實驗，測定抑菌活性，研究細(xì)菌素樣品在不同pH值處理后抑菌活性的變化。

1.3.8.3 蛋白酶敏感性

將粗提的細(xì)菌素調(diào)節(jié)到各酶的最適pH值，分別加入胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K，添加量為l.0 g/L，反應(yīng)時間3 h，將pH值調(diào)回到7做抑菌實驗，測定抑菌圈直徑大小，研究樣品對酶的敏感性。

1.3.8.4 細(xì)菌素二硫鍵特性

將粗提的細(xì)菌素樣品調(diào)節(jié)pH值至6.5，利用0.01 mol/L二硫蘇糖醇對二硫鍵進(jìn)行變性。37 ℃放置2 h后，進(jìn)行抑菌實驗，測定抑菌圈直徑大小，研究二硫鍵的重要性。

1.3.8.5 抑菌譜分析

將各種待測菌雙層平板法培養(yǎng)，進(jìn)行牛津杯雙層瓊脂平板擴(kuò)散抑菌實驗，測量抑菌活性，研究該細(xì)菌素對不同種類細(xì)菌的抑制作用。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

每個實驗重復(fù)3次，取平均值。采用SPSS 23.0進(jìn)行單因素方差分析與顯著性差異分析，Design-Expert 10.0進(jìn)行Plackett-Burman與Box-Behnken試驗設(shè)計。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 發(fā)酵溫度的影響

圖1 發(fā)酵溫度對植物乳桿菌LPL-1產(chǎn)細(xì)菌素的影響Fig. 1 Effect of fermentation temperature on bacteriocin production from L. plantarum LPL-1

如圖1所示，菌株在30 ℃恒溫發(fā)酵時，細(xì)菌素的產(chǎn)量最高，相對抑菌效價為315.02 AU/mL，與其他溫度處理組具有顯著差異，所以選擇30 ℃為最佳發(fā)酵溫度，進(jìn)行Plackett-Burman試驗。

據(jù)報道，菌體產(chǎn)細(xì)菌素的最適溫度差異較大，例如，屎腸球菌RZS C5產(chǎn)細(xì)菌素的最適溫度為35 ℃[21]，戊糖乳桿菌31-1產(chǎn)細(xì)菌素的最適溫度為30 ℃[22]，擴(kuò)展短桿菌ATCC 9175產(chǎn)細(xì)菌素的最適溫度為28 ℃[23]，本研究植物乳桿素LPL-1的最適產(chǎn)生溫度為30 ℃。

2.1.2 初始pH值的影響

圖2 初始pH值對植物乳桿菌LPL-1產(chǎn)細(xì)菌素的影響Fig. 2 Effect of initial medium pH value on bacteriocin production from L. plantarum LPL-1

如圖2所示，菌株在初始pH值為6.5時，細(xì)菌素的產(chǎn)量最高，相對抑菌效價達(dá)到了351.80 AU/mL，與其他pH值條件具有顯著差異，并且對比于培養(yǎng)溫度優(yōu)化的結(jié)果有顯著提高，所以確定培養(yǎng)基初始pH 6.5為最佳，進(jìn)行Plackett-Burman試驗。pH值不僅影響了菌體的生長，而且在發(fā)酵后期對細(xì)菌素與菌體的黏附性具有影響[24]。

2.1.3 裝液量的影響

圖3 裝液量對植物乳桿菌LPL-1產(chǎn)細(xì)菌素的影響Fig. 3 Effect of medium volume in fl asks on bacteriocin production from L. plantarum LPL-1

裝液量主要影響發(fā)酵過程的溶氧，植物乳桿菌LPL-1為兼性厭氧菌，溶氧對細(xì)菌素發(fā)酵的影響對細(xì)菌素的規(guī)模化生產(chǎn)具有參考價值。如圖3所示，當(dāng)裝液量為80%時，細(xì)菌素效價值最高，為361.27 AU/mL，與60%、100%組無顯著差異，基于Plackett-Burman試驗對影響因素的重復(fù)性驗證，選擇裝液量為考察因素進(jìn)行重復(fù)性驗證，并且選擇80%裝液量為Plackett-Burman試驗的中心點。

2.1.4 接種量的影響

圖4 接種量對植物乳桿菌LPL-1產(chǎn)細(xì)菌素的影響Fig. 4 Effect of inoculum amount on bacteriocin production from L. plantarum LPL-1

如圖4所示，隨著接種量的增加，細(xì)菌素的抑菌活性呈下降趨勢，當(dāng)按0.5%接種量接種發(fā)酵時，細(xì)菌素的抑菌效價最大，為364.67 AU/mL，但與初始接種量1%無顯著差異?；赑lackett-Burman試驗對影響因素的重復(fù)性驗證，選擇接種量為考察因素進(jìn)行重復(fù)性驗證，并且選擇0.5%接種量最低水平，1%為最高水平，進(jìn)行Plackett-Burman試驗的重復(fù)性驗證。

2.1.5 發(fā)酵時間的影響

如圖5所示，在穩(wěn)定期之前，細(xì)菌素產(chǎn)量隨著發(fā)酵時間的延長而增大，在32 h時達(dá)到最大值，細(xì)菌素相對抑菌效價為220.33 AU/mL，進(jìn)入穩(wěn)定期后，細(xì)菌素產(chǎn)量先維持穩(wěn)定，而后開始下降，表現(xiàn)出與植物乳桿菌LPL-1菌株的生長曲線的一致性。選擇32 h作為最佳發(fā)酵時間。發(fā)酵時間的延長不僅會降低發(fā)酵液的pH值，促進(jìn)菌體對細(xì)菌素的黏附，降低其效價[24]，而且對產(chǎn)業(yè)化的生產(chǎn)成本具有重要影響。

圖5 植物乳桿菌LPL-1的生長與抑菌活性曲線Fig. 5 Growth curve and bacteriocin production of L. plantarum LPL-1

2.2 Plackett-Burman試驗結(jié)果

在單因素基礎(chǔ)上，Plackett-Burman試驗主要考察單因素的貢獻(xiàn)率與效應(yīng)值，從而確定主要影響因素。試驗考察發(fā)酵溫度、初始pH值、接種量、發(fā)酵時間、裝液量5 個因素對植物乳桿菌LPL-1產(chǎn)細(xì)菌素的貢獻(xiàn)率。根據(jù)各單因素試驗結(jié)果選擇的高低兩個水平，將響應(yīng)區(qū)間取值轉(zhuǎn)化為編碼值“-1”和“1”，其中“-1”代表低水平值，“1”代表高水平值，試驗設(shè)計與結(jié)果如表4所示。

表4 Plackett-Burman試驗設(shè)計與結(jié)果Table 4 Plackett-Burman design with experimental results

用Design-Expert 10.0軟件對Plackett-Burman試驗結(jié)果進(jìn)行效應(yīng)分析和方差分析，結(jié)果如表5所示。

由表5可見，發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間2 個因素的效應(yīng)值為正，應(yīng)該增加；而初始pH值、接種量、裝液量3 個因素的效應(yīng)值為負(fù)，應(yīng)該減小。其中，效應(yīng)值大小表示各因素對該試驗結(jié)果影響的大小，與因素對該試驗貢獻(xiàn)率的結(jié)果保持相關(guān)性，由貢獻(xiàn)率的大小可得到這5 個因素對模型影響的大小依次為：初始pH值＞發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時間＞裝液量＞接種量。試驗整體因素模型P值為0.005 3，P＜0.05，說明整體模型對試驗結(jié)果有顯著影響，Plackett-Burman試驗的結(jié)果具有可信度。因此，最終選擇發(fā)酵溫度、初始pH值和發(fā)酵時間3 個因素進(jìn)行下一步的最陡爬坡試驗，其余2 個因素則根據(jù)每一因素的效應(yīng)值進(jìn)行取值，即選擇接種量0.5%、裝液量60%。

表5 Plackett-Burman試驗效應(yīng)分析Table 5 Effect analysis of independent variables in Plackett-Burman design

2.3 最陡爬坡試驗結(jié)果

圖6 最陡爬坡試驗結(jié)果Fig. 6 Results of steepest ascent design

如圖6所示，最陡爬坡試驗結(jié)果呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢，在3號試驗點處出現(xiàn)最高點，該點處發(fā)酵溫度30 ℃、初始pH 6.5、發(fā)酵時間32 h，此時植物乳桿菌LPL-1產(chǎn)細(xì)菌素相對抑菌效價達(dá)到最大，最大值為612.37 AU/mL。該點即為下一步培養(yǎng)條件Box-Behnken試驗設(shè)計的中心點。

2.4 Box-Behnken響應(yīng)面試驗結(jié)果

利用Design-Expert 10.0軟件對發(fā)酵溫度、初始pH值、發(fā)酵時間設(shè)計3因素3水平的Box-Behnken試驗，結(jié)果見表6，方差分析結(jié)果如表7所示，所選擇的回歸模型的P值小于0.000 1，表明整體模型對試驗結(jié)果具有顯著的影響，具有可信度；而失擬項的P值為0.727 9，大于0.05，失擬項檢驗不顯著，模型選擇適當(dāng)；該模型的決定系數(shù)為0.999 4，校正決定系數(shù)0.998 7，表明模型可信度很高。細(xì)菌素相對抑菌效價（Y）對發(fā)酵溫度（A）、初始pH值（B）和發(fā)酵時間（C）的多元二次回歸方程為：

Y=685.33+38.37A-5.11B+10.84C-21.54AB-21.34AC+0.048BC-220.27A2-211.89B2-185.64C2

表6 Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果Table 6 Box-Behnken experiment with experimental results

表7 回歸模型方差分析結(jié)果Table 7 Analysis of variance for the regression model

2.5 響應(yīng)面試驗結(jié)果

圖7 各因素交互作用的響應(yīng)面與等高線圖Fig. 7 Response surface and contour plots showing the interactive effects of various factors on bacteriocin production

如圖7所示，通過方程可知，二次項系數(shù)為負(fù)值，其所代表的拋物面開口向下，表明方程具有最大值。利用Design-Expert 10.0分析計算，最適培養(yǎng)條件為發(fā)酵溫度30.43 ℃、初始pH 6.49、發(fā)酵時間32.1 h，最大效價為687.16 AU/mL。

2.6 回歸模型的驗證結(jié)果

在上述優(yōu)化的條件下，根據(jù)實際條件，設(shè)置發(fā)酵溫度31 ℃、初始pH 6.40、發(fā)酵時間32 h進(jìn)行3 次發(fā)酵抑菌實驗，以對優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步的驗證。驗證實驗中細(xì)菌素相對抑菌效價的平均值為674.29 AU/mL，與預(yù)測值擬合度達(dá)98.13%，表明優(yōu)化模型可靠。

2.7 植物乳桿菌素LPL-1生化特性分析

在食品工業(yè)中，熱穩(wěn)定性與酸堿穩(wěn)定性是影響細(xì)菌素活性的重要因素，蛋白酶敏感性與其安全性有關(guān)，同時植物乳桿菌素LPL-1二硫鍵結(jié)構(gòu)對其活性影響未知，因此探究其熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、蛋白酶敏感性與二硫鍵結(jié)構(gòu)對其活性的影響具有重要意義。

2.7.1 熱穩(wěn)定性

圖8 溫度對細(xì)菌素活性的影響Fig. 8 Effects of temperature on stability of plantaricin LPL-1

由圖8可知，隨著處理溫度的升高和處理時間的延長，細(xì)菌素相對抑菌效價保留率逐漸降低，但仍保持相對抑菌效價。在60 ℃時，保留率與對照組無顯著差異，表明該細(xì)菌素在60 ℃時具有良好的穩(wěn)定性；在80 ℃時，保留率與對照組有顯著性差異，但效價保留率仍在90%以上，表明細(xì)菌素在80 ℃時活性發(fā)生了一定的改變，但仍呈現(xiàn)出較好的熱穩(wěn)定性；在100 ℃時，細(xì)菌素相對抑菌效價保留率發(fā)生顯著下降，處理30 min后為70.79%，細(xì)菌素仍具有一定的穩(wěn)定性。結(jié)果驗證了植物乳桿菌素LPL-1細(xì)菌素的良好耐高溫特性，與植物乳桿菌素JLA-9[13]、植物乳桿菌素J23[25]類似，都具有耐高溫特性，因此有利于其在食品加工中的應(yīng)用。

2.7.2 酸堿穩(wěn)定性

由圖9可知，該細(xì)菌素在pH 2～10范圍內(nèi)均有活性，并且隨著pH值的上升，細(xì)菌素活性呈下降趨勢。細(xì)菌素在pH 2～7保持良好的穩(wěn)定性；在pH 8～10范圍內(nèi)，保留率顯著下降。結(jié)果表明該細(xì)菌素適宜的作用條件為pH 2～8，與細(xì)菌素LXA[26]、植物乳桿菌素K25[27]相似，同樣適合作為酸性、中性和弱堿性食品中的防腐劑。

圖9 pH值對細(xì)菌素活性的影響Fig. 9 Effects of pH value on stability of plantaricin LPL-1

2.7.3 蛋白酶敏感性

表8 蛋白酶對細(xì)菌素活性的影響Table 8 Effects of proteases on stability of plantaricin LPL-1

如表8所示，細(xì)菌素經(jīng)胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶處理后，抑菌活性完全喪失，驗證了能被人體中的各種蛋白酶消化，在一定程度上證明了細(xì)菌素具有安全性。

2.7.4 二硫鍵特性

表9 二硫鍵變性劑對細(xì)菌素活性的影響Table 9 Effects of disul fi de bond denaturants on stability of plantaricin LPL-1

二硫鍵是二級結(jié)構(gòu)的重要組成，與蛋白活性有一定關(guān)聯(lián)[28]，巰基還原劑主要對細(xì)菌素的二硫鍵進(jìn)行破壞[29]，如表9所示，在二硫鍵經(jīng)巰基還原劑還原斷裂后，細(xì)菌素失去其抑菌活性，說明二硫鍵結(jié)構(gòu)對細(xì)菌素的抑菌活性至關(guān)重要，具體的斷點位置還需深入分析。

2.7.5 抑菌譜分析

如表10所示，細(xì)菌素對植物乳桿菌、唾液乳桿菌和乳酸鏈球菌具有明顯的抑制作用，以上菌種屬于啤酒釀造中常見的污染菌[30]，表明該細(xì)菌素對革蘭氏陽性菌具有抑菌能力。其中對食品中常見的腐敗菌（單核細(xì)胞性李斯特菌）[31]與致病菌（金黃色葡萄球菌）[32]具有顯著的抑菌效果，表明了其作為食品防腐劑抑制食源性致病菌的應(yīng)用潛力。

表10 抑菌譜分析Table 10 Antimicrobial spectrum of plantaricin LPL-1

3 結(jié) 論

通過單因素試驗與Plackett-Burman試驗，確定影響因素對細(xì)菌素相對抑菌活性的影響大小為：發(fā)酵初始pH值＞發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時間＞裝液量＞接種量；通過最陡爬坡試驗與Box-Behnken響應(yīng)面試驗，建立細(xì)菌素相對抑菌活性與發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間與發(fā)酵初始pH值的二次多元回歸方程，確定最優(yōu)條件為發(fā)酵溫度31 ℃、初始pH 6.40、發(fā)酵時間32 h、接種量0.5%、裝液量60%，細(xì)菌素相對抑菌效價（674.29 AU/mL）比優(yōu)化前（292.02 AU/mL）提高1.31 倍，經(jīng)驗證實驗證明該數(shù)據(jù)模型合理可靠。通過對植物乳桿菌素LPL-1理化性質(zhì)的分析，證明了其具有熱穩(wěn)定性（100 ℃，30 min）、酸堿穩(wěn)定性 （pH 2～10）、蛋白酶敏感性與抑菌性，二硫鍵對其抑菌活性具有重要影響，因此植物乳桿菌素LPL-1在食品防腐保鮮領(lǐng)域具有安全應(yīng)用的潛力。