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        紅曲色素萃取發(fā)酵中表面活性劑的分離與重復(fù)利用

        2018-11-28 06:52:02吳振強(qiáng)
        食品科學(xué) 2018年22期

        陳 功,吳振強(qiáng)*

        (華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,廣東 廣州 510006)

        紅曲霉作為一種絲狀真菌,可以發(fā)酵生產(chǎn)多種功能性代謝產(chǎn)物[1]。紅曲色素作為紅曲霉主要的聚酮類次級(jí)代謝產(chǎn)物,具有天然、營養(yǎng)、安全等潛在的價(jià)值,在亞洲國家廣泛用于食品領(lǐng)域[2]。紅曲色素種類較多,根據(jù)顏色一般分為紅、橙、黃3 類。其中常見的紅曲色素主要有6 種,包括兩種黃色素(Y1:monascin、Y2:ankaflavin),兩種橙色素(O1:rubropunctatin、O 2:m o n a s c o r u b r i n)及兩種紅色素(R 1:rubropunctamine、R2:monascorubramine)[3-4]。

        紅曲霉深層發(fā)酵主要代謝合成胞內(nèi)色素,菌絲體內(nèi)積累較多的脂溶性色素會(huì)導(dǎo)致反饋抑制,進(jìn)而影響最終的色素產(chǎn)量[5-6]。滲透萃取發(fā)酵作為一種新型發(fā)酵技術(shù),近年來廣泛用于紅曲色素的生產(chǎn)[6-7]。通過在發(fā)酵培養(yǎng)基中引入生物相容性較好的非離子表面活性劑Triton X-100(TX-100),能夠增加細(xì)胞膜通透性,促進(jìn)胞內(nèi)色素跨膜分泌到胞外膠束溶液中,進(jìn)而避免胞內(nèi)色素反饋抑制,促進(jìn)色素代謝,提高色素產(chǎn)量[8-11]。

        紅曲色素和表面活性劑的分離純化是萃取發(fā)酵下游過程中的一個(gè)重要難題。有研究報(bào)道,使用乙醚直接一步法萃取分離紅曲色素和TX-100,乙醚有機(jī)相中能回收較高含量的紅曲色素,并且水相中的TX-100可以使用異丁醇進(jìn)行回收[12]。Shen Lingjie等[13]通過離子液體[BMIm]PF6進(jìn)行微乳液萃取分離,能夠回收約80%的紅曲黃色素(TX-100質(zhì)量濃度未知),但離子液體價(jià)格較貴,不利于大規(guī)模萃取分離。近期,唐銳等[14]采用有機(jī)溶劑微乳液萃取和大孔樹脂吸附聯(lián)合分離方法,能夠很好地將TX-100和紅曲色素進(jìn)行分離;最終黃色素的回收率達(dá)到64.5%,TX-100的去除率為97.47%;但此過程中紅曲色素的分離特性及TX-100的回收利用沒有深入研究。

        在前期研究的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步探索三氯甲烷萃取-大孔樹脂吸附(trihalomethanes extraction combined with resin absorption,THMS-Resin)法分離萃取發(fā)酵液中紅曲色素的相關(guān)特性;同時(shí)研究回收TX-100重復(fù)發(fā)酵的萃取性能;另外,考察回收TX-100共萃取發(fā)酵下紅曲霉的生長和色素代謝情況;最后,研究TX-100多批次回收重復(fù)萃取發(fā)酵紅曲霉生長和色素代謝特性,實(shí)現(xiàn)萃取劑的反復(fù)利用,提高萃取劑的利用價(jià)值和萃取發(fā)酵的應(yīng)用潛力。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        用于發(fā)酵的紅曲霉菌株Monascus anka GIM 3.592保藏于廣東省微生物菌種保藏中心(GDMCC/GIMCC);S-8大孔樹脂(強(qiáng)極性,粒徑范圍0.3~1.25 mm) 東鴻化工有限公司。[BMIm]PF6和[BMIm]BF4中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所;發(fā)酵、分離用試劑均為分析純;液相色譜用試劑均為色譜純;葡萄糖、魚粉蛋白胨、硫酸銨、氯化鉀 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

        1.2 儀器與設(shè)備

        ZWYR-D2402型搖床 海智城分析儀器制造有限公司;UV-2802S型紫外-可見分光光度計(jì) 上海尤尼柯儀器有限公司;e2695高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)儀(包括2998二極管陣列檢測器和SunFire C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)) 美國Waters公司。

        1.3 方法

        1.3.1 培養(yǎng)基制備

        PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯葡萄糖200 g,葡萄糖20 g,瓊脂15~20 g;蒸餾水1 000 mL,培養(yǎng)基加熱攪拌全部溶解后分裝,121 ℃滅菌20 min。

        種子培養(yǎng)基:葡萄糖20 g,魚粉蛋白胨10 g,酵母提取物3 g,磷酸二氫鉀4 g,氯化鉀0.5 g,七水合硫酸鐵0.01 g,蒸餾水1 000 mL,pH值自然,115 ℃滅菌20 min。

        發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖50 g,硫酸銨5 g,磷酸二氫鉀5 g,氯化鉀0.5 g,七水合硫酸鎂0.5 g,一水合硫酸錳0.03 g,七水合硫酸鋅0.01 g,七水合硫酸亞鐵0.01 g,蒸餾水1 000 mL,pH值自然,115 ℃滅菌20 min。

        1.3.2 常規(guī)發(fā)酵和萃取發(fā)酵

        菌種培養(yǎng):保藏在-80 ℃的菌株M. anka GIM 3.592進(jìn)行活化后,在PDA平板中進(jìn)行劃線,然后置于恒溫培養(yǎng)箱中30 ℃培養(yǎng)7 d,培養(yǎng)后的種子平板4 ℃保存?zhèn)溆茫ㄒ话悴怀^1 個(gè)月)。

        種子培養(yǎng):取培養(yǎng)7 d的PDA種子平板,加入6 mL 0.1 g/100 mL的Tween 80溶液洗脫紅曲霉孢子,取3 mL菌懸液(孢子約106個(gè)/mL)接種到50 mL種子培養(yǎng)基中,180 r/min、30 ℃搖床培養(yǎng)28~30 h。

        常規(guī)發(fā)酵培養(yǎng):將培養(yǎng)好的種子液按8%(體積分?jǐn)?shù))接種量接種到25 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中,180 r/min、30 ℃搖床培養(yǎng)7 d。

        萃取發(fā)酵培養(yǎng):參照常規(guī)發(fā)酵培養(yǎng),在接種的同時(shí)向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加40 g/L TX-100。

        1.3.3 萃取發(fā)酵液中紅曲色素與TX-100的分離

        萃取發(fā)酵結(jié)束后,收集發(fā)酵液,8 000 r/min離心10 min,除去菌絲體,上清液用于胞外色素和TX-100分離。分離方法參考唐銳等[14]采用三氯甲烷萃取-堿性樹脂吸附分離-甲醇洗脫色素的方式進(jìn)行。

        三氯甲烷萃?。合蛏锨逡褐屑尤氲润w積的三氯甲烷,充分混勻;10 ℃、80 r/min振蕩過夜,進(jìn)行兩相萃?。蝗缓蟮玫较聦佑袡C(jī)溶劑相,記錄相應(yīng)體積;同時(shí)檢測有機(jī)相中TX-100質(zhì)量濃度和色素含量,根據(jù)公式(1)和(2)分別計(jì)算三氯甲烷對(duì)色素和TX-100的萃取率:

        式中:A為上清液中色素含量/AU;A1為兩相萃取后有機(jī)相中色素含量/AU;V為上清液體積/mL;V1為兩相萃取后有機(jī)相體積/mL。

        式中:C為上清液中TX-100質(zhì)量濃度/(mg/mL);C1為兩相萃取后有機(jī)相中TX-100質(zhì)量濃度/(mg/mL);V為上清液體積/mL;V1為兩相萃取后有機(jī)相體積/mL。

        堿性樹脂吸附分離:S-8大孔樹脂的堿性處理參考課題組之前的方法[14]。將堿性S-8樹脂按照5 g/100 mL的比例,加入到三氯甲烷萃取分離后的有機(jī)相溶液中,30 ℃、200 r/min振蕩吸附3 h;然后分離樹脂,檢測溶液中殘留的TX-100質(zhì)量濃度和色素含量,按照公式(3)和(4)分別計(jì)算堿性S-8樹脂對(duì)色素和TX-100的吸附率:

        式中:A0為樹脂吸附前有機(jī)相中色素含量/AU;A1為樹脂吸附后有機(jī)相中色素含量/AU。

        式中:C0為樹脂吸附前有機(jī)相中TX-100質(zhì)量濃度/(mg/mL);C1為樹脂吸附后有機(jī)相中TX-100質(zhì)量濃度/(mg/mL)。

        甲醇洗脫樹脂解吸色素:將上述吸附色素的樹脂分離后,按照原比例(5 g/100 mL)加入含有1 g/100 mL?HCl的甲醇洗脫劑,30 ℃、180 r/min振蕩解吸1 h,共洗脫5次;按照公式(5)計(jì)算色素洗脫率:

        式中:A0和A1為樹脂吸附前、后有機(jī)相中色素含量/AU;V0為樹脂吸附前后有機(jī)相體積/mL;A2為洗脫液中色素含量/AU;V2為洗脫液體積/mL。

        1.3.4 不同方式回收TX-100重復(fù)萃取發(fā)酵

        THMS-Resin法[14]:分離1.3.3節(jié)中堿性S-8樹脂吸附后的有機(jī)相溶液,使用氮吹儀除去溶液中的三氯甲烷,獲得TX-100,備用。

        離子液體法[13]:向5 mL萃取發(fā)酵上清液中加入5 g離子液體[BMIm]PF6(或者[BMIm]BF4,具有較高親水性、極性、高離子電荷、高介電常數(shù)等特性),充分混勻, 30 ℃水浴2 h,進(jìn)行兩相萃取;上相(TX-100)移入新的離心管中,65 ℃水浴進(jìn)行濁點(diǎn)分離,獲得TX-100,備用。

        分別將上述方法(THMS-Resin、[BMIm]PF6、[BMIm]BF4)回收的TX-100以及新的TX-100進(jìn)行萃取發(fā)酵,同時(shí)以常規(guī)發(fā)酵作為參考對(duì)照,考察菌體生長和色素代謝的差異。

        1.3.5 新-舊TX-100不同比例復(fù)配重復(fù)萃取發(fā)酵

        按照唐銳等[14]的方法回收萃取發(fā)酵液中的TX-100;將回收的TX-100(舊)和未使用過的TX-100(新)以1∶0、4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4、0∶1的比例進(jìn)行復(fù)配,重復(fù)萃取發(fā)酵,考察新-舊TX-100不同比例復(fù)配萃取發(fā)酵對(duì)菌體生長和色素代謝的影響。

        1.3.6 TX-100多批次回收重復(fù)萃取發(fā)酵

        按照唐銳等[14]的方法,從原始萃取發(fā)酵液中回收得到的TX-100定義為第1次回收,將第1次回收的TX-100萃取發(fā)酵定義為第1次重復(fù)萃取發(fā)酵;然后進(jìn)行第2次回收和第2次重復(fù)萃取發(fā)酵;依次進(jìn)行到第5次回收和第5次重復(fù)萃取發(fā)酵;考察每次重復(fù)萃取發(fā)酵紅曲霉菌體生長和色素代謝情況。按式(6)、(7)計(jì)算各批次回收TX-100進(jìn)行紅曲霉萃取發(fā)酵的胞外、胞內(nèi)色素相對(duì)含量表示萃取效率和代謝能力,按式(8)計(jì)算TX-100回收率:

        式中:A0為新TX-100萃取發(fā)酵胞外色素含量/AU;Ax為各批次舊TX-100萃取發(fā)酵胞外色素含量/AU。

        式中:B0為新TX-100萃取發(fā)酵胞內(nèi)色素含量/AU;Bx為各批次舊TX-100萃取發(fā)酵胞內(nèi)色素含量/AU。

        式中:Cy為各批次萃取發(fā)酵液中回收TX-100質(zhì)量濃度/(mg/mL);Cx為各批次萃取發(fā)酵液中投入TX-100質(zhì)量濃度/(mg/mL)。

        1.3.7 指標(biāo)測定

        菌體量測定采用質(zhì)量法[15];殘?zhí)呛繙y定采用3,5-二硝基水楊酸法[16];清除DPPH自由基能力檢測參考Bei Qi等[17]的方法,以VC計(jì)(mg/g)。

        TX-100質(zhì)量濃度測定:樣品用甲醇適當(dāng)稀釋后,使用HPLC法檢測TX-100質(zhì)量濃度。色譜條件:2998二極管陣列檢測器,C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),柱溫30 ℃,進(jìn)樣量10 μL,流動(dòng)相甲醇,流速1.0 mL/min,檢測波長277 nm[14,18]。

        紅曲色素含量測定:采用UV-2802S紫外-可見分光光度計(jì)測定不同樣品中的色素含量,以410、470、510 nm波長處的吸光度(AU)乘以稀釋倍數(shù)分別作為混合色素中黃色素、橙色素、紅色素的含量[5,6,8-16,19]。

        紅曲色素組分測定:采用HPLC檢測樣品中色素組分[20],色譜系統(tǒng)包括Waters e2695分離系統(tǒng)和Waters 2998二極管陣列檢測器檢測系統(tǒng);色譜柱為Sunfire C18反相色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),柱溫30 ℃;樣品進(jìn)樣體積10 μL;流動(dòng)相包括A相(超純水,添加0.3%磷酸)和B相(乙腈);洗脫流速1.000 mL/min,采取梯度洗脫(0 min,80% A;25 min,20% A;35 min,20% A;36 min,80% A;40 min,80% A),洗脫時(shí)間40 min;二極管陣列檢測器檢測波長200~600 nm記錄色素光譜,提取色譜圖波長410 nm[21]。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 有機(jī)溶劑萃取-樹脂吸附分離特性

        表1 THMS-Resin法分離萃取發(fā)酵液中黃色素和TX-100Table 1 Separation of yellow pigment and TX-100 from the extractive fermentation broth by the THMS-Resin method

        采用THMS-Resin法分離紅曲霉萃取發(fā)酵液中的紅曲色素和TX-100,結(jié)果如表1所示。起始的萃取發(fā)酵液中黃色素含量為93.78 AU,TX-100質(zhì)量濃度為38.40 g/L。三氯甲烷萃取后,大部分黃色素和TX-100被萃取到三氯甲烷有機(jī)相中;通過檢測計(jì)算,有機(jī)相中黃色素萃取率達(dá)到81.77%,TX-100萃取率達(dá)到90.71%。說明三氯甲烷具有很好的色素和TX-100萃取回收能力,但選擇性很差,不能很好的將二者分開。大孔樹脂由于具有孔徑結(jié)構(gòu)和表面功能基團(tuán)多樣性的特性,被廣泛用于吸附分離不同分子質(zhì)量的化合物[22-23]。S-8樹脂是一種苯乙烯型極性共聚體大孔樹脂,能夠通過靜電相互作用吸附極性物質(zhì)[24]。通過堿性S-8樹脂吸附三氯甲烷萃取液,檢測發(fā)現(xiàn)樹脂吸附的黃色素含量為65.12 AU(吸附率84.91%),吸附的TX-100質(zhì)量濃度為0.91 g/L(吸附率2.61%)。樹脂的吸附能力與自身極性、孔徑孔穴大小、比表面積有很大的關(guān)系,經(jīng)過酸堿處理可以改變樹脂表面功能基團(tuán)的電荷極性,進(jìn)而影響對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的選擇性吸附效果[25]。說明堿性S-8樹脂能夠很好地將色素和萃取劑分開,TX-100留在三氯甲烷萃取液中,進(jìn)而可以通過除去三氯甲烷回收TX-100。這一結(jié)果與唐銳等[14]的研究基本一致,同時(shí)解釋了萃取吸附原理,即三氯甲烷可能破壞萃取發(fā)酵液中TX-100-色素混合膠束結(jié)構(gòu),導(dǎo)致色素從膠束中釋放到有機(jī)相;堿性S-8樹脂進(jìn)而選擇性吸附有機(jī)相中游離的色素,實(shí)現(xiàn)色素與TX-100的分離。進(jìn)一步通過鹽酸-甲醇洗脫樹脂吸附的色素,結(jié)果顯示,5 次洗脫后的黃色素和TX-100的總洗脫率分別達(dá)到74.90%和61.58%;總洗脫液中黃色素含量為48.77 AU,TX-100質(zhì)量濃度為0.05 g/L。說明通過此方法可以很好地分離萃取發(fā)酵液中的萃取劑和紅曲色素,最終獲得幾乎不含TX-100的較高含量的黃色素。

        圖1 THMS-Resin法分離過程中色素的HPLC圖譜(A)和DPPH自由基清除能力(B)Fig. 1 HPLC chromatogram (A) and DPPH radical scavenging capacity (B) of pigment separated by the THMS-Resin method

        通過HPLC檢測上述THMS-Resin分離過程中色素組分變化情況,圖1A結(jié)果顯示,萃取發(fā)酵液中含有多種色素成分,除了原有的胞內(nèi)外色素組分外[26],還出現(xiàn)一些新的色素成分;鑒定發(fā)現(xiàn),有4 種新的黃色素在萃取分泌過程中通過酶催化橙色素(O1:rubropunctatin、O2:monascorubrin)轉(zhuǎn)化而來[27]。經(jīng)過三氯甲烷萃取后,萃取液中色素組分幾乎沒有改變,但單個(gè)色素峰譜圖更加清晰;說明三氯甲烷很好地將色素萃取出來,進(jìn)而分離除去發(fā)酵液中的一些雜質(zhì)。堿性S-8樹脂吸附三氯甲烷萃取液后,發(fā)現(xiàn)只有部分色素(Y1:monascin)殘留在萃取液;說明大量的色素被吸附到樹脂中,體現(xiàn)了S-8樹脂的強(qiáng)大吸附能力。經(jīng)過酸性甲醇溶液洗脫樹脂中的色素,發(fā)現(xiàn)洗脫液中含有較多的黃色素,其中包括一些新的色素成分。說明通過上述分離方法最終可以獲得較高含量的黃色素。

        有研究報(bào)道,紅曲黃色素具有一定的生物活性功能,例如抗腫瘤、抗糖尿病、抗氧化、抗肥胖、抗炎[28-29]。通過檢測THMS-Resin分離過程中色素的抗氧化活性,圖1B結(jié)果顯示,與常規(guī)發(fā)酵(空白)相比,萃取發(fā)酵胞外色素具有更高的DPPH自由基清除能力,說明萃取到胞外的色素具有很強(qiáng)的抗氧化活性。通過三氯甲烷萃取后,除去了發(fā)酵液中的一些雜質(zhì),獲得較純的色素,導(dǎo)致DPPH自由基清除能力進(jìn)一步提高。堿性S-8樹脂吸附三氯甲烷萃取液色素后,剩余萃取液的DPPH自由基清除能力顯著下降,說明大量的功能活性色素被樹脂吸附。進(jìn)一步檢測洗脫液中色素的DPPH自由基清除能力,發(fā)現(xiàn)抗氧化活性能力達(dá)到較高水平,說明分離純化后的紅曲色素具有很高的抗氧化活性。所以,采用萃取發(fā)酵技術(shù),分離分泌到紅曲霉胞外的色素具有潛在的抗氧化活性功能,可能來自于這些新的黃色素成分。

        2.2 不同方法回收表面活性劑重復(fù)用于萃取發(fā)酵

        圖2 不同方法回收TX-100重復(fù)萃取發(fā)酵細(xì)胞生長(A)和色素代謝(B)情況Fig. 2 Cell growth rates (A) and pigment metabolism (B) in extractive fermentation with the recycled TX-100 by different methods

        萃取劑的回收率和回收溶液中含有的雜質(zhì)成分,在重復(fù)發(fā)酵時(shí)會(huì)影響紅曲霉細(xì)胞的生長和色素的萃取效率。通過不同方法回收TX-100進(jìn)行重復(fù)萃取發(fā)酵,結(jié)果如圖2所示。[BMIm]BF4法回收的TX-100重復(fù)萃取發(fā)酵,葡萄糖利用很少,菌體生長緩慢,幾乎沒有色素產(chǎn)生??赡苁荹BMIm]BF4法回收的TX-100溶液中含有一些殘留的離子液體,在紅曲霉萃取發(fā)酵過程中對(duì)細(xì)胞毒性較大,抑制了細(xì)胞的生長和色素代謝。相反,采用[BMIm]PF6和THMS-Resin法對(duì)回收的TX-100進(jìn)行重復(fù)發(fā)酵表現(xiàn)出較好的生物相容性;葡萄糖幾乎完全利用,菌體量與正常TX-100萃取發(fā)酵相比差別不大,最終均可達(dá)到9 g/L左右,并且THMS-Resin法略高于[BMIm]PF6法;但相對(duì)于常規(guī)發(fā)酵(空白),萃取發(fā)酵的菌體量均有所下降,說明萃取劑對(duì)細(xì)胞生長具有一定的抑制作用(圖2A)。另外,采用[BMIm]PF6和THMS-Resin法對(duì)回收的TX-100進(jìn)行重復(fù)萃取發(fā)酵,可以獲得跟正常TX-100萃取發(fā)酵相近的總色素含量,且高于常規(guī)發(fā)酵,進(jìn)一步說明萃取發(fā)酵可以顯著提高紅曲色素產(chǎn)量。相比[BMIm]PF6法,采用THMS-Resin法對(duì)回收的TX-100進(jìn)行紅曲霉重復(fù)萃取發(fā)酵,胞外色素含量相對(duì)較多(圖2B),說明THMS-Resin法回收的TX-100沒有降低萃取能力,可以用于重復(fù)進(jìn)行紅曲霉萃取發(fā)酵,提高色素產(chǎn)量。

        2.3 回收表面活性劑部分替代萃取發(fā)酵

        圖3 新-舊TX-100不同比例共萃取發(fā)酵細(xì)胞生長(A)和色素代謝(B)情況Fig. 3 Cell growth rates (A) and pigment metabolism (B) in extractive fermentation with new and recycled TX-100 in different proportions

        采用THMS-Resin法對(duì)回收的TX-100(舊)和未使用過的TX-100(新)以不同比例混合后進(jìn)行萃取發(fā)酵,結(jié)果如圖3所示。新-舊TX-100不同比例混合萃取發(fā)酵均表現(xiàn)出很好的生物相容性,發(fā)酵7 d后葡萄糖基本耗盡,菌體量均達(dá)到9 g/L左右;但新TX-100比例相對(duì)較高時(shí)(>1∶1),細(xì)胞生長抑制相對(duì)加強(qiáng),最終菌體量略有減少(圖3A)。采用新-舊TX-100不同比例進(jìn)行紅曲霉混合萃取發(fā)酵,總色素含量均可以達(dá)到160 AU以上,說明紅曲霉均能很好地代謝色素。而采用新-舊TX-100高比例(>1∶1)混合萃取發(fā)酵時(shí),胞內(nèi)外色素含量均相對(duì)較高,從而獲得較高的總色素含量。說明通過回收的舊TX-100部分替代新TX-100萃取發(fā)酵,可以促進(jìn)紅曲霉胞內(nèi)外色素的代謝與分泌,可能由于回收的舊TX-100膠束中含有少量的微量元素,在重復(fù)萃取發(fā)酵過程中促進(jìn)細(xì)胞生長和色素代謝。研究顯示,紅曲色素液態(tài)發(fā)酵過程中,一些金屬離子包括Fe2+、Mn2+、Zn2+、Mg2+等對(duì)色素代謝有很大的調(diào)控作用[4,30]。因此,采用新-舊TX-100協(xié)同發(fā)酵可以在一定程度上減少細(xì)胞傷害,促進(jìn)色素代謝,同時(shí)提高色素萃取效率,獲得較高的色素產(chǎn)量。

        2.4 多批次回收表面活性劑重復(fù)萃取發(fā)酵

        TX-100經(jīng)過5 次反復(fù)回收和重復(fù)萃取發(fā)酵,每批次的紅曲霉細(xì)胞均能很好地生長代謝,菌體量均維持在8~11 g/L之間,說明TX-100多次重復(fù)利用均具有很好的生物相容性。值得注意的是,使用各批次回收的TX-100重復(fù)萃取發(fā)酵獲得的菌體量比正常萃取發(fā)酵略高,相對(duì)生長率(舊TX-100萃取發(fā)酵菌體量/新TX-100萃取發(fā)酵菌體量)均達(dá)到1.0以上(表2)。可能由于TX-100批次利用會(huì)降低回收的相對(duì)含量,進(jìn)而減少對(duì)細(xì)胞的毒性和抑制,促進(jìn)紅曲霉菌體生長;同時(shí)說明各批次回收的TX-100可以重復(fù)用于萃取發(fā)酵。

        表2 TX-100多批次回收重復(fù)萃取發(fā)酵細(xì)胞生長和色素代謝情況Table 2 Cell growth rates and pigment metabolism in extractive fermentation with the recycled TX-100 from multiple batches

        從色素代謝產(chǎn)量來看,各批次回收的TX-100重復(fù)萃取發(fā)酵均能獲得較高的總色素含量。與正常萃取發(fā)酵相比,各批次回收的TX-100重復(fù)萃取發(fā)酵可以獲得相同含量的胞外色素,尤其是胞外黃色素相對(duì)含量達(dá)到1.0以上;同時(shí),胞外橙色素和紅色素相對(duì)含量分別達(dá)到0.9和0.8以上(表2)。通過計(jì)算,5 次重復(fù)萃取發(fā)酵TX-100的回收率均達(dá)到80%左右(圖4),說明采用回收的TX-100進(jìn)行紅曲霉重復(fù)萃取發(fā)酵,表現(xiàn)出很好的胞外色素萃取能力,可能與較高的TX-100回收率有關(guān);同時(shí),胞內(nèi)黃色素相對(duì)含量為0.6左右,可能由于回收的TX-100溶液中含有一定的殘余色素和抑制物質(zhì),進(jìn)而影響了胞內(nèi)色素的代謝。

        圖4 TX-100多批次重復(fù)萃取發(fā)酵回收率Fig. 4 Recovery of TX-100 from multiple batches

        圖5 TX-100多批次回收重復(fù)萃取發(fā)酵胞內(nèi)外色素可見光譜和HPLC圖譜Fig. 5 Visible spectra and HPLC chromatograms of intracellular and extracellular pigments in extractive fermentation with the recycled TX-100 from multiple batches

        5 次重復(fù)萃取發(fā)酵,各批次胞外色素光譜基本一致,最大吸收峰在430 nm左右,但胞內(nèi)色素最大吸收峰從470 nm向410 nm轉(zhuǎn)移,說明胞內(nèi)色素特性發(fā)生變化(圖5A、B)。通過HPLC分析發(fā)現(xiàn),5 次重復(fù)萃取發(fā)酵胞外色素組分和相對(duì)比例基本一致,但胞內(nèi)黃、橙色素相對(duì)比例有所差異,與光譜圖結(jié)果一致(圖5C、D)。說明采用回收的TX-100進(jìn)行紅曲霉重復(fù)萃取發(fā)酵可能改變了胞內(nèi)的色素代謝調(diào)控水平,進(jìn)而影響了胞內(nèi)色素產(chǎn)量。分析第5次重復(fù)萃取發(fā)酵液中紅曲色素和TX-100的分離結(jié)果,發(fā)現(xiàn)利用THMS-Resin法同樣可以回收51.78%的黃色素和78.61%的TX-100。同時(shí),分離過程中紅曲色素組分的HPLC譜圖與圖1基本一致,說明通過THMSResin法能很好地實(shí)現(xiàn)TX-100和紅曲色素的分離;回收的TX-100可以很好地重復(fù)用于萃取發(fā)酵,獲得較高含量的紅曲色素,尤其是黃色素。

        3 結(jié) 論

        采用THMS-Resin法可以分離出紅曲霉萃取發(fā)酵液中的TX-100和紅曲黃色素,回收率分別達(dá)到78%和52%左右;最終獲得的紅曲色素中含有大量的新黃色素成分,同時(shí)具有顯著的抗氧化活性。采用THMS-Resin法回收的TX-100進(jìn)行紅曲霉重復(fù)萃取發(fā)酵,細(xì)胞生長良好,同時(shí)萃取劑保持較好的色素萃取性能,優(yōu)于[BMIm]PF6和[BMIm]BF4法。采用新-舊TX-100進(jìn)行協(xié)同萃取發(fā)酵,可以顯著促進(jìn)胞內(nèi)外色素代謝分泌;其中新-舊TX-100比例4∶1時(shí),胞內(nèi)外總色素產(chǎn)量提高最為明顯,達(dá)到35%左右。連續(xù)5 次采用回收的TX-100進(jìn)行重復(fù)萃取發(fā)酵,紅曲霉生長穩(wěn)定,細(xì)胞生長量高于正常萃取發(fā)酵水平;胞外色素相對(duì)含量均達(dá)到0.8以上,其中黃色素達(dá)到1.0;同時(shí),胞內(nèi)色素代謝能力能夠維持在相對(duì)含量0.6以上;另外,5 次重復(fù)萃取發(fā)酵TX-100回收率均達(dá)到80%左右。因此,THMS-Resin法能夠很好地實(shí)現(xiàn)萃取劑和紅曲色素的分離,回收的TX-100可以多次回用,為萃取發(fā)酵的生產(chǎn)應(yīng)用提供參考。

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