陳 功，吳振強(qiáng)*

（華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510006）

紅曲霉作為一種絲狀真菌，可以發(fā)酵生產(chǎn)多種功能性代謝產(chǎn)物[1]。紅曲色素作為紅曲霉主要的聚酮類次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有天然、營養(yǎng)、安全等潛在的價(jià)值，在亞洲國家廣泛用于食品領(lǐng)域[2]。紅曲色素種類較多，根據(jù)顏色一般分為紅、橙、黃3 類。其中常見的紅曲色素主要有6 種，包括兩種黃色素（Y1：monascin、Y2：ankaflavin），兩種橙色素（O1：rubropunctatin、O 2：m o n a s c o r u b r i n）及兩種紅色素（R 1：rubropunctamine、R2：monascorubramine）[3-4]。

紅曲霉深層發(fā)酵主要代謝合成胞內(nèi)色素，菌絲體內(nèi)積累較多的脂溶性色素會(huì)導(dǎo)致反饋抑制，進(jìn)而影響最終的色素產(chǎn)量[5-6]。滲透萃取發(fā)酵作為一種新型發(fā)酵技術(shù)，近年來廣泛用于紅曲色素的生產(chǎn)[6-7]。通過在發(fā)酵培養(yǎng)基中引入生物相容性較好的非離子表面活性劑Triton X-100（TX-100），能夠增加細(xì)胞膜通透性，促進(jìn)胞內(nèi)色素跨膜分泌到胞外膠束溶液中，進(jìn)而避免胞內(nèi)色素反饋抑制，促進(jìn)色素代謝，提高色素產(chǎn)量[8-11]。

紅曲色素和表面活性劑的分離純化是萃取發(fā)酵下游過程中的一個(gè)重要難題。有研究報(bào)道，使用乙醚直接一步法萃取分離紅曲色素和TX-100，乙醚有機(jī)相中能回收較高含量的紅曲色素，并且水相中的TX-100可以使用異丁醇進(jìn)行回收[12]。Shen Lingjie等[13]通過離子液體[BMIm]PF6進(jìn)行微乳液萃取分離，能夠回收約80%的紅曲黃色素（TX-100質(zhì)量濃度未知），但離子液體價(jià)格較貴，不利于大規(guī)模萃取分離。近期，唐銳等[14]采用有機(jī)溶劑微乳液萃取和大孔樹脂吸附聯(lián)合分離方法，能夠很好地將TX-100和紅曲色素進(jìn)行分離；最終黃色素的回收率達(dá)到64.5%，TX-100的去除率為97.47%；但此過程中紅曲色素的分離特性及TX-100的回收利用沒有深入研究。

在前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探索三氯甲烷萃取-大孔樹脂吸附（trihalomethanes extraction combined with resin absorption，THMS-Resin）法分離萃取發(fā)酵液中紅曲色素的相關(guān)特性；同時(shí)研究回收TX-100重復(fù)發(fā)酵的萃取性能；另外，考察回收TX-100共萃取發(fā)酵下紅曲霉的生長和色素代謝情況；最后，研究TX-100多批次回收重復(fù)萃取發(fā)酵紅曲霉生長和色素代謝特性，實(shí)現(xiàn)萃取劑的反復(fù)利用，提高萃取劑的利用價(jià)值和萃取發(fā)酵的應(yīng)用潛力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

用于發(fā)酵的紅曲霉菌株Monascus anka GIM 3.592保藏于廣東省微生物菌種保藏中心（GDMCC/GIMCC）；S-8大孔樹脂（強(qiáng)極性，粒徑范圍0.3～1.25 mm） 東鴻化工有限公司。[BMIm]PF6和[BMIm]BF4中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所；發(fā)酵、分離用試劑均為分析純；液相色譜用試劑均為色譜純；葡萄糖、魚粉蛋白胨、硫酸銨、氯化鉀 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ZWYR-D2402型搖床 海智城分析儀器制造有限公司；UV-2802S型紫外-可見分光光度計(jì) 上海尤尼柯儀器有限公司；e2695高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀（包括2998二極管陣列檢測器和SunFire C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）） 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基制備

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g；蒸餾水1 000 mL，培養(yǎng)基加熱攪拌全部溶解后分裝，121 ℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，魚粉蛋白胨10 g，酵母提取物3 g，磷酸二氫鉀4 g，氯化鉀0.5 g，七水合硫酸鐵0.01 g，蒸餾水1 000 mL，pH值自然，115 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖50 g，硫酸銨5 g，磷酸二氫鉀5 g，氯化鉀0.5 g，七水合硫酸鎂0.5 g，一水合硫酸錳0.03 g，七水合硫酸鋅0.01 g，七水合硫酸亞鐵0.01 g，蒸餾水1 000 mL，pH值自然，115 ℃滅菌20 min。

1.3.2 常規(guī)發(fā)酵和萃取發(fā)酵

菌種培養(yǎng)：保藏在-80 ℃的菌株M. anka GIM 3.592進(jìn)行活化后，在PDA平板中進(jìn)行劃線，然后置于恒溫培養(yǎng)箱中30 ℃培養(yǎng)7 d，培養(yǎng)后的種子平板4 ℃保存?zhèn)溆茫ㄒ话悴怀^1 個(gè)月）。

種子培養(yǎng)：取培養(yǎng)7 d的PDA種子平板，加入6 mL 0.1 g/100 mL的Tween 80溶液洗脫紅曲霉孢子，取3 mL菌懸液（孢子約106個(gè)/mL）接種到50 mL種子培養(yǎng)基中，180 r/min、30 ℃搖床培養(yǎng)28～30 h。

常規(guī)發(fā)酵培養(yǎng)：將培養(yǎng)好的種子液按8%（體積分?jǐn)?shù)）接種量接種到25 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，180 r/min、30 ℃搖床培養(yǎng)7 d。

萃取發(fā)酵培養(yǎng)：參照常規(guī)發(fā)酵培養(yǎng)，在接種的同時(shí)向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加40 g/L TX-100。

1.3.3 萃取發(fā)酵液中紅曲色素與TX-100的分離

萃取發(fā)酵結(jié)束后，收集發(fā)酵液，8 000 r/min離心10 min，除去菌絲體，上清液用于胞外色素和TX-100分離。分離方法參考唐銳等[14]采用三氯甲烷萃取-堿性樹脂吸附分離-甲醇洗脫色素的方式進(jìn)行。

三氯甲烷萃?。合蛏锨逡褐屑尤氲润w積的三氯甲烷，充分混勻；10 ℃、80 r/min振蕩過夜，進(jìn)行兩相萃?。蝗缓蟮玫较聦佑袡C(jī)溶劑相，記錄相應(yīng)體積；同時(shí)檢測有機(jī)相中TX-100質(zhì)量濃度和色素含量，根據(jù)公式（1）和（2）分別計(jì)算三氯甲烷對(duì)色素和TX-100的萃取率：

式中：A為上清液中色素含量/AU；A1為兩相萃取后有機(jī)相中色素含量/AU；V為上清液體積/mL；V1為兩相萃取后有機(jī)相體積/mL。

式中：C為上清液中TX-100質(zhì)量濃度/（mg/mL）；C1為兩相萃取后有機(jī)相中TX-100質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V為上清液體積/mL；V1為兩相萃取后有機(jī)相體積/mL。

堿性樹脂吸附分離：S-8大孔樹脂的堿性處理參考課題組之前的方法[14]。將堿性S-8樹脂按照5 g/100 mL的比例，加入到三氯甲烷萃取分離后的有機(jī)相溶液中，30 ℃、200 r/min振蕩吸附3 h；然后分離樹脂，檢測溶液中殘留的TX-100質(zhì)量濃度和色素含量，按照公式（3）和（4）分別計(jì)算堿性S-8樹脂對(duì)色素和TX-100的吸附率：

式中：A0為樹脂吸附前有機(jī)相中色素含量/AU；A1為樹脂吸附后有機(jī)相中色素含量/AU。

式中：C0為樹脂吸附前有機(jī)相中TX-100質(zhì)量濃度/（mg/mL）；C1為樹脂吸附后有機(jī)相中TX-100質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

甲醇洗脫樹脂解吸色素：將上述吸附色素的樹脂分離后，按照原比例（5 g/100 mL）加入含有1 g/100 mL?HCl的甲醇洗脫劑，30 ℃、180 r/min振蕩解吸1 h，共洗脫5次；按照公式（5）計(jì)算色素洗脫率：

式中：A0和A1為樹脂吸附前、后有機(jī)相中色素含量/AU；V0為樹脂吸附前后有機(jī)相體積/mL；A2為洗脫液中色素含量/AU；V2為洗脫液體積/mL。

1.3.4 不同方式回收TX-100重復(fù)萃取發(fā)酵

THMS-Resin法[14]：分離1.3.3節(jié)中堿性S-8樹脂吸附后的有機(jī)相溶液，使用氮吹儀除去溶液中的三氯甲烷，獲得TX-100，備用。

離子液體法[13]：向5 mL萃取發(fā)酵上清液中加入5 g離子液體[BMIm]PF6（或者[BMIm]BF4，具有較高親水性、極性、高離子電荷、高介電常數(shù)等特性），充分混勻， 30 ℃水浴2 h，進(jìn)行兩相萃取；上相（TX-100）移入新的離心管中，65 ℃水浴進(jìn)行濁點(diǎn)分離，獲得TX-100，備用。

分別將上述方法（THMS-Resin、[BMIm]PF6、[BMIm]BF4）回收的TX-100以及新的TX-100進(jìn)行萃取發(fā)酵，同時(shí)以常規(guī)發(fā)酵作為參考對(duì)照，考察菌體生長和色素代謝的差異。

1.3.5 新-舊TX-100不同比例復(fù)配重復(fù)萃取發(fā)酵

按照唐銳等[14]的方法回收萃取發(fā)酵液中的TX-100；將回收的TX-100（舊）和未使用過的TX-100（新）以1∶0、4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4、0∶1的比例進(jìn)行復(fù)配，重復(fù)萃取發(fā)酵，考察新-舊TX-100不同比例復(fù)配萃取發(fā)酵對(duì)菌體生長和色素代謝的影響。

1.3.6 TX-100多批次回收重復(fù)萃取發(fā)酵

按照唐銳等[14]的方法，從原始萃取發(fā)酵液中回收得到的TX-100定義為第1次回收，將第1次回收的TX-100萃取發(fā)酵定義為第1次重復(fù)萃取發(fā)酵；然后進(jìn)行第2次回收和第2次重復(fù)萃取發(fā)酵；依次進(jìn)行到第5次回收和第5次重復(fù)萃取發(fā)酵；考察每次重復(fù)萃取發(fā)酵紅曲霉菌體生長和色素代謝情況。按式（6）、（7）計(jì)算各批次回收TX-100進(jìn)行紅曲霉萃取發(fā)酵的胞外、胞內(nèi)色素相對(duì)含量表示萃取效率和代謝能力，按式（8）計(jì)算TX-100回收率：

式中：A0為新TX-100萃取發(fā)酵胞外色素含量/AU；Ax為各批次舊TX-100萃取發(fā)酵胞外色素含量/AU。

式中：B0為新TX-100萃取發(fā)酵胞內(nèi)色素含量/AU；Bx為各批次舊TX-100萃取發(fā)酵胞內(nèi)色素含量/AU。

式中：Cy為各批次萃取發(fā)酵液中回收TX-100質(zhì)量濃度/（mg/mL）；Cx為各批次萃取發(fā)酵液中投入TX-100質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.7 指標(biāo)測定

菌體量測定采用質(zhì)量法[15]；殘?zhí)呛繙y定采用3,5-二硝基水楊酸法[16]；清除DPPH自由基能力檢測參考Bei Qi等[17]的方法，以VC計(jì)（mg/g）。

TX-100質(zhì)量濃度測定：樣品用甲醇適當(dāng)稀釋后，使用HPLC法檢測TX-100質(zhì)量濃度。色譜條件：2998二極管陣列檢測器，C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL，流動(dòng)相甲醇，流速1.0 mL/min，檢測波長277 nm[14,18]。

紅曲色素含量測定：采用UV-2802S紫外-可見分光光度計(jì)測定不同樣品中的色素含量，以410、470、510 nm波長處的吸光度（AU）乘以稀釋倍數(shù)分別作為混合色素中黃色素、橙色素、紅色素的含量[5,6,8-16,19]。

紅曲色素組分測定：采用HPLC檢測樣品中色素組分[20]，色譜系統(tǒng)包括Waters e2695分離系統(tǒng)和Waters 2998二極管陣列檢測器檢測系統(tǒng)；色譜柱為Sunfire C18反相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫30 ℃；樣品進(jìn)樣體積10 μL；流動(dòng)相包括A相（超純水，添加0.3%磷酸）和B相（乙腈）；洗脫流速1.000 mL/min，采取梯度洗脫（0 min，80% A；25 min，20% A；35 min，20% A；36 min，80% A；40 min，80% A），洗脫時(shí)間40 min；二極管陣列檢測器檢測波長200～600 nm記錄色素光譜，提取色譜圖波長410 nm[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 有機(jī)溶劑萃取-樹脂吸附分離特性

表1 THMS-Resin法分離萃取發(fā)酵液中黃色素和TX-100Table 1 Separation of yellow pigment and TX-100 from the extractive fermentation broth by the THMS-Resin method

采用THMS-Resin法分離紅曲霉萃取發(fā)酵液中的紅曲色素和TX-100，結(jié)果如表1所示。起始的萃取發(fā)酵液中黃色素含量為93.78 AU，TX-100質(zhì)量濃度為38.40 g/L。三氯甲烷萃取后，大部分黃色素和TX-100被萃取到三氯甲烷有機(jī)相中；通過檢測計(jì)算，有機(jī)相中黃色素萃取率達(dá)到81.77%，TX-100萃取率達(dá)到90.71%。說明三氯甲烷具有很好的色素和TX-100萃取回收能力，但選擇性很差，不能很好的將二者分開。大孔樹脂由于具有孔徑結(jié)構(gòu)和表面功能基團(tuán)多樣性的特性，被廣泛用于吸附分離不同分子質(zhì)量的化合物[22-23]。S-8樹脂是一種苯乙烯型極性共聚體大孔樹脂，能夠通過靜電相互作用吸附極性物質(zhì)[24]。通過堿性S-8樹脂吸附三氯甲烷萃取液，檢測發(fā)現(xiàn)樹脂吸附的黃色素含量為65.12 AU（吸附率84.91%），吸附的TX-100質(zhì)量濃度為0.91 g/L（吸附率2.61%）。樹脂的吸附能力與自身極性、孔徑孔穴大小、比表面積有很大的關(guān)系，經(jīng)過酸堿處理可以改變樹脂表面功能基團(tuán)的電荷極性，進(jìn)而影響對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的選擇性吸附效果[25]。說明堿性S-8樹脂能夠很好地將色素和萃取劑分開，TX-100留在三氯甲烷萃取液中，進(jìn)而可以通過除去三氯甲烷回收TX-100。這一結(jié)果與唐銳等[14]的研究基本一致，同時(shí)解釋了萃取吸附原理，即三氯甲烷可能破壞萃取發(fā)酵液中TX-100-色素混合膠束結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致色素從膠束中釋放到有機(jī)相；堿性S-8樹脂進(jìn)而選擇性吸附有機(jī)相中游離的色素，實(shí)現(xiàn)色素與TX-100的分離。進(jìn)一步通過鹽酸-甲醇洗脫樹脂吸附的色素，結(jié)果顯示，5 次洗脫后的黃色素和TX-100的總洗脫率分別達(dá)到74.90%和61.58%；總洗脫液中黃色素含量為48.77 AU，TX-100質(zhì)量濃度為0.05 g/L。說明通過此方法可以很好地分離萃取發(fā)酵液中的萃取劑和紅曲色素，最終獲得幾乎不含TX-100的較高含量的黃色素。

圖1 THMS-Resin法分離過程中色素的HPLC圖譜（A）和DPPH自由基清除能力（B）Fig. 1 HPLC chromatogram (A) and DPPH radical scavenging capacity (B) of pigment separated by the THMS-Resin method

通過HPLC檢測上述THMS-Resin分離過程中色素組分變化情況，圖1A結(jié)果顯示，萃取發(fā)酵液中含有多種色素成分，除了原有的胞內(nèi)外色素組分外[26]，還出現(xiàn)一些新的色素成分；鑒定發(fā)現(xiàn)，有4 種新的黃色素在萃取分泌過程中通過酶催化橙色素（O1：rubropunctatin、O2：monascorubrin）轉(zhuǎn)化而來[27]。經(jīng)過三氯甲烷萃取后，萃取液中色素組分幾乎沒有改變，但單個(gè)色素峰譜圖更加清晰；說明三氯甲烷很好地將色素萃取出來，進(jìn)而分離除去發(fā)酵液中的一些雜質(zhì)。堿性S-8樹脂吸附三氯甲烷萃取液后，發(fā)現(xiàn)只有部分色素（Y1：monascin）殘留在萃取液；說明大量的色素被吸附到樹脂中，體現(xiàn)了S-8樹脂的強(qiáng)大吸附能力。經(jīng)過酸性甲醇溶液洗脫樹脂中的色素，發(fā)現(xiàn)洗脫液中含有較多的黃色素，其中包括一些新的色素成分。說明通過上述分離方法最終可以獲得較高含量的黃色素。

有研究報(bào)道，紅曲黃色素具有一定的生物活性功能，例如抗腫瘤、抗糖尿病、抗氧化、抗肥胖、抗炎[28-29]。通過檢測THMS-Resin分離過程中色素的抗氧化活性，圖1B結(jié)果顯示，與常規(guī)發(fā)酵（空白）相比，萃取發(fā)酵胞外色素具有更高的DPPH自由基清除能力，說明萃取到胞外的色素具有很強(qiáng)的抗氧化活性。通過三氯甲烷萃取后，除去了發(fā)酵液中的一些雜質(zhì)，獲得較純的色素，導(dǎo)致DPPH自由基清除能力進(jìn)一步提高。堿性S-8樹脂吸附三氯甲烷萃取液色素后，剩余萃取液的DPPH自由基清除能力顯著下降，說明大量的功能活性色素被樹脂吸附。進(jìn)一步檢測洗脫液中色素的DPPH自由基清除能力，發(fā)現(xiàn)抗氧化活性能力達(dá)到較高水平，說明分離純化后的紅曲色素具有很高的抗氧化活性。所以，采用萃取發(fā)酵技術(shù)，分離分泌到紅曲霉胞外的色素具有潛在的抗氧化活性功能，可能來自于這些新的黃色素成分。

2.2 不同方法回收表面活性劑重復(fù)用于萃取發(fā)酵

圖2 不同方法回收TX-100重復(fù)萃取發(fā)酵細(xì)胞生長（A）和色素代謝（B）情況Fig. 2 Cell growth rates (A) and pigment metabolism (B) in extractive fermentation with the recycled TX-100 by different methods

萃取劑的回收率和回收溶液中含有的雜質(zhì)成分，在重復(fù)發(fā)酵時(shí)會(huì)影響紅曲霉細(xì)胞的生長和色素的萃取效率。通過不同方法回收TX-100進(jìn)行重復(fù)萃取發(fā)酵，結(jié)果如圖2所示。[BMIm]BF4法回收的TX-100重復(fù)萃取發(fā)酵，葡萄糖利用很少，菌體生長緩慢，幾乎沒有色素產(chǎn)生?？赡苁荹BMIm]BF4法回收的TX-100溶液中含有一些殘留的離子液體，在紅曲霉萃取發(fā)酵過程中對(duì)細(xì)胞毒性較大，抑制了細(xì)胞的生長和色素代謝。相反，采用[BMIm]PF6和THMS-Resin法對(duì)回收的TX-100進(jìn)行重復(fù)發(fā)酵表現(xiàn)出較好的生物相容性；葡萄糖幾乎完全利用，菌體量與正常TX-100萃取發(fā)酵相比差別不大，最終均可達(dá)到9 g/L左右，并且THMS-Resin法略高于[BMIm]PF6法；但相對(duì)于常規(guī)發(fā)酵（空白），萃取發(fā)酵的菌體量均有所下降，說明萃取劑對(duì)細(xì)胞生長具有一定的抑制作用（圖2A）。另外，采用[BMIm]PF6和THMS-Resin法對(duì)回收的TX-100進(jìn)行重復(fù)萃取發(fā)酵，可以獲得跟正常TX-100萃取發(fā)酵相近的總色素含量，且高于常規(guī)發(fā)酵，進(jìn)一步說明萃取發(fā)酵可以顯著提高紅曲色素產(chǎn)量。相比[BMIm]PF6法，采用THMS-Resin法對(duì)回收的TX-100進(jìn)行紅曲霉重復(fù)萃取發(fā)酵，胞外色素含量相對(duì)較多（圖2B），說明THMS-Resin法回收的TX-100沒有降低萃取能力，可以用于重復(fù)進(jìn)行紅曲霉萃取發(fā)酵，提高色素產(chǎn)量。

2.3 回收表面活性劑部分替代萃取發(fā)酵

圖3 新-舊TX-100不同比例共萃取發(fā)酵細(xì)胞生長（A）和色素代謝（B）情況Fig. 3 Cell growth rates (A) and pigment metabolism (B) in extractive fermentation with new and recycled TX-100 in different proportions

采用THMS-Resin法對(duì)回收的TX-100（舊）和未使用過的TX-100（新）以不同比例混合后進(jìn)行萃取發(fā)酵，結(jié)果如圖3所示。新-舊TX-100不同比例混合萃取發(fā)酵均表現(xiàn)出很好的生物相容性，發(fā)酵7 d后葡萄糖基本耗盡，菌體量均達(dá)到9 g/L左右；但新TX-100比例相對(duì)較高時(shí)（＞1∶1），細(xì)胞生長抑制相對(duì)加強(qiáng)，最終菌體量略有減少（圖3A）。采用新-舊TX-100不同比例進(jìn)行紅曲霉混合萃取發(fā)酵，總色素含量均可以達(dá)到160 AU以上，說明紅曲霉均能很好地代謝色素。而采用新-舊TX-100高比例（＞1∶1）混合萃取發(fā)酵時(shí)，胞內(nèi)外色素含量均相對(duì)較高，從而獲得較高的總色素含量。說明通過回收的舊TX-100部分替代新TX-100萃取發(fā)酵，可以促進(jìn)紅曲霉胞內(nèi)外色素的代謝與分泌，可能由于回收的舊TX-100膠束中含有少量的微量元素，在重復(fù)萃取發(fā)酵過程中促進(jìn)細(xì)胞生長和色素代謝。研究顯示，紅曲色素液態(tài)發(fā)酵過程中，一些金屬離子包括Fe2+、Mn2+、Zn2+、Mg2+等對(duì)色素代謝有很大的調(diào)控作用[4,30]。因此，采用新-舊TX-100協(xié)同發(fā)酵可以在一定程度上減少細(xì)胞傷害，促進(jìn)色素代謝，同時(shí)提高色素萃取效率，獲得較高的色素產(chǎn)量。

2.4 多批次回收表面活性劑重復(fù)萃取發(fā)酵

TX-100經(jīng)過5 次反復(fù)回收和重復(fù)萃取發(fā)酵，每批次的紅曲霉細(xì)胞均能很好地生長代謝，菌體量均維持在8～11 g/L之間，說明TX-100多次重復(fù)利用均具有很好的生物相容性。值得注意的是，使用各批次回收的TX-100重復(fù)萃取發(fā)酵獲得的菌體量比正常萃取發(fā)酵略高，相對(duì)生長率（舊TX-100萃取發(fā)酵菌體量/新TX-100萃取發(fā)酵菌體量）均達(dá)到1.0以上（表2）。可能由于TX-100批次利用會(huì)降低回收的相對(duì)含量，進(jìn)而減少對(duì)細(xì)胞的毒性和抑制，促進(jìn)紅曲霉菌體生長；同時(shí)說明各批次回收的TX-100可以重復(fù)用于萃取發(fā)酵。

表2 TX-100多批次回收重復(fù)萃取發(fā)酵細(xì)胞生長和色素代謝情況Table 2 Cell growth rates and pigment metabolism in extractive fermentation with the recycled TX-100 from multiple batches

從色素代謝產(chǎn)量來看，各批次回收的TX-100重復(fù)萃取發(fā)酵均能獲得較高的總色素含量。與正常萃取發(fā)酵相比，各批次回收的TX-100重復(fù)萃取發(fā)酵可以獲得相同含量的胞外色素，尤其是胞外黃色素相對(duì)含量達(dá)到1.0以上；同時(shí)，胞外橙色素和紅色素相對(duì)含量分別達(dá)到0.9和0.8以上（表2）。通過計(jì)算，5 次重復(fù)萃取發(fā)酵TX-100的回收率均達(dá)到80%左右（圖4），說明采用回收的TX-100進(jìn)行紅曲霉重復(fù)萃取發(fā)酵，表現(xiàn)出很好的胞外色素萃取能力，可能與較高的TX-100回收率有關(guān)；同時(shí)，胞內(nèi)黃色素相對(duì)含量為0.6左右，可能由于回收的TX-100溶液中含有一定的殘余色素和抑制物質(zhì)，進(jìn)而影響了胞內(nèi)色素的代謝。

圖4 TX-100多批次重復(fù)萃取發(fā)酵回收率Fig. 4 Recovery of TX-100 from multiple batches

圖5 TX-100多批次回收重復(fù)萃取發(fā)酵胞內(nèi)外色素可見光譜和HPLC圖譜Fig. 5 Visible spectra and HPLC chromatograms of intracellular and extracellular pigments in extractive fermentation with the recycled TX-100 from multiple batches

5 次重復(fù)萃取發(fā)酵，各批次胞外色素光譜基本一致，最大吸收峰在430 nm左右，但胞內(nèi)色素最大吸收峰從470 nm向410 nm轉(zhuǎn)移，說明胞內(nèi)色素特性發(fā)生變化（圖5A、B）。通過HPLC分析發(fā)現(xiàn)，5 次重復(fù)萃取發(fā)酵胞外色素組分和相對(duì)比例基本一致，但胞內(nèi)黃、橙色素相對(duì)比例有所差異，與光譜圖結(jié)果一致（圖5C、D）。說明采用回收的TX-100進(jìn)行紅曲霉重復(fù)萃取發(fā)酵可能改變了胞內(nèi)的色素代謝調(diào)控水平，進(jìn)而影響了胞內(nèi)色素產(chǎn)量。分析第5次重復(fù)萃取發(fā)酵液中紅曲色素和TX-100的分離結(jié)果，發(fā)現(xiàn)利用THMS-Resin法同樣可以回收51.78%的黃色素和78.61%的TX-100。同時(shí)，分離過程中紅曲色素組分的HPLC譜圖與圖1基本一致，說明通過THMSResin法能很好地實(shí)現(xiàn)TX-100和紅曲色素的分離；回收的TX-100可以很好地重復(fù)用于萃取發(fā)酵，獲得較高含量的紅曲色素，尤其是黃色素。

3 結(jié) 論

采用THMS-Resin法可以分離出紅曲霉萃取發(fā)酵液中的TX-100和紅曲黃色素，回收率分別達(dá)到78%和52%左右；最終獲得的紅曲色素中含有大量的新黃色素成分，同時(shí)具有顯著的抗氧化活性。采用THMS-Resin法回收的TX-100進(jìn)行紅曲霉重復(fù)萃取發(fā)酵，細(xì)胞生長良好，同時(shí)萃取劑保持較好的色素萃取性能，優(yōu)于[BMIm]PF6和[BMIm]BF4法。采用新-舊TX-100進(jìn)行協(xié)同萃取發(fā)酵，可以顯著促進(jìn)胞內(nèi)外色素代謝分泌；其中新-舊TX-100比例4∶1時(shí)，胞內(nèi)外總色素產(chǎn)量提高最為明顯，達(dá)到35%左右。連續(xù)5 次采用回收的TX-100進(jìn)行重復(fù)萃取發(fā)酵，紅曲霉生長穩(wěn)定，細(xì)胞生長量高于正常萃取發(fā)酵水平；胞外色素相對(duì)含量均達(dá)到0.8以上，其中黃色素達(dá)到1.0；同時(shí)，胞內(nèi)色素代謝能力能夠維持在相對(duì)含量0.6以上；另外，5 次重復(fù)萃取發(fā)酵TX-100回收率均達(dá)到80%左右。因此，THMS-Resin法能夠很好地實(shí)現(xiàn)萃取劑和紅曲色素的分離，回收的TX-100可以多次回用，為萃取發(fā)酵的生產(chǎn)應(yīng)用提供參考。