鄭召君，張日俊*

（1.中國農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，北京 100193；2.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122）

隨著自由基研究的不斷深入，氧化應激和抗氧化保護作用的理論引起廣泛關注。在需氧代謝過程中，氧氣發(fā)生系列還原反應以調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，同時伴隨活性氧等自由基的形成[1-2]。正常狀態(tài)下，活性氧等自由基產(chǎn)量與抗氧化防御系統(tǒng)處于動態(tài)平衡狀態(tài)[3]。一旦平衡被打破，內(nèi)源性防御系統(tǒng)無法繼續(xù)有效地保護機體抵抗自由基的攻擊，過量的活性氧等高活性分子則會導致蛋白質(zhì)損傷、DNA突變、細胞膜磷脂氧化以及低密度脂蛋白改性，導致多種器官和系統(tǒng)的氧化性損傷，進而刺激產(chǎn)生危害機體健康的疾病，如動脈粥樣硬化、糖尿病、白內(nèi)障、神經(jīng)退行性疾病、癌癥等[4-6]。而補充外源性抗氧化劑，可幫助生物體維持自由基與抗氧化防御系統(tǒng)間的平衡，具有重要的生理意義。

抗氧化劑根據(jù)來源分為化學合成抗氧化劑和天然抗氧化劑?？紤]到化學合成抗氧化劑潛在的危害性，天然抗氧化劑因其安全性高且來源廣泛而備受學者的青睞。近年來，從食物蛋白源的酶解物中提取活性肽已成為許多學者研究的熱點[7-9]。而蛋白酶水解法也因具有反應溫和、安全性高等優(yōu)點，成為獲取抗氧化肽等生物活性肽的有效手段。目前，學者們已利用蛋白酶水解食物蛋白制備出大量的抗氧化活性強且無副作用的肽段，可有效清除自由基并抑制脂質(zhì)過氧化[10-13]。這些抗氧化肽通常由2～20 個氨基酸組成，且氨基酸的組成和序列對其發(fā)揮抗氧化活性具有決定性作用[14]。蛋白酶解受酶濃度、底物濃度、酶解溫度、酶解時間和pH值等多個因素的影響，因此采用響應面分析法優(yōu)化這些因素，對制備抗氧化活性強的酶解產(chǎn)物是非常必要的。

作為肉類加工行業(yè)的主要副產(chǎn)物，血液本身營養(yǎng)價值高，蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)高達20%左右，必需氨基酸（Lys、Leu等）含量高，其營養(yǎng)價值可與畜禽胴體中6%～7%的瘦肉相媲美，素有“液態(tài)肉”、“養(yǎng)血之玉”的美譽。而血球蛋白約占血液總蛋白的50%以上，營養(yǎng)價值高，可作為優(yōu)質(zhì)蛋白原料應用于食品和飼料中[15]。除了營養(yǎng)特性外，血球經(jīng)酶解后的產(chǎn)物具有一定的生物學活性，如鎮(zhèn)痛[16]、抗菌[17-18]、抗氧化[19]、ACE抑制[20-21]和緩激肽增強[22]等作用。然而當前用于制備生物活性肽的血球多是來源于牛血和豬血，而對家禽等其他動物的血球研究甚少[23]。因此，本研究以雞血球為原料，篩選獲得最佳蛋白酶酶解制備抗氧化活性高的酶解物，并通過響應面分析法對酶解條件進行優(yōu)化，連續(xù)分離純化以獲得高活性的抗氧化組分，并對目標肽進行結(jié)構(gòu)鑒定。以期為高效利用家禽血球提供實驗依據(jù)和技術參考，也為家禽血球蛋白酶解物開發(fā)成抗氧化的功能性添加劑提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮雞血球由北京鴻順養(yǎng)源生物科技有限公司提供，-20 ℃避光保存?zhèn)溆?，使用前置? ℃過夜解凍。

酸性蛋白酶 北京東華強盛生物技術有限公司；中性蛋白酶G、堿性蛋白酶、風味蛋白酶G 南寧龐博生物工程有限公司；胰蛋白酶、胰酶、強陽離子填充樹脂（Dowex 50W×8，氫型）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、鄰苯三酚、菲啰嗪 美國Sigma-Aldrich公司；Protamex 諾維信酶制劑公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

TU-1810紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；iMark酶標儀 美國伯樂公司；離子交換層析柱（2.6 cm×60 cm）、BSZ-100自動部分收集器上海滬西分析儀器廠有限公司；LGF-10C型冷凍干燥機 北京軍事醫(yī)學科學院；?KTA explorer 10蛋白純化儀 美國GE公司；nano高效液相色譜 美國Waters公司；Zorbax SB-C18預裝柱 美國Agilent公司；Q Exactive高分辨質(zhì)譜儀 美國Thermo Fisher Scientifc公司。

1.3 方法

1.3.1 酶解工藝流程

雞血球溶于0.1 mol/L HCl溶液（血球蛋白∶HCl溶液3∶2（g/mL））和去離子水中制備血球溶液，混合均勻后，置于40 ℃、200 r/min恒溫振蕩器中反應30 min?；旌弦豪鋮s至室溫，用85%乳酸溶液或4 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)至預定pH值，加入蛋白酶，放入轉(zhuǎn)速為200 r/min的恒溫振蕩器中進行酶解。反應結(jié)束后，90 ℃水浴15 min滅酶，冷卻，在6 000×g、4 ℃條件下離心10 min得到活性強的上清液酶解物。

1.3.2 蛋白酶篩選

選用6 種蛋白酶，包括酸性蛋白酶、中性蛋白酶G、風味蛋白酶G、胰蛋白酶、胰酶和Protamex。在生產(chǎn)廠家推薦的最適pH值和溫度基礎上，考察不同酶用量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%），酶解時間（1、2、3、4、5、6、7、8 h）對5%血球蛋白進行酶解反應。以酶解物DPPH自由基清除能力作為指標，篩選出適宜的蛋白酶。

1.3.3 單因素試驗

以底物質(zhì)量分數(shù)5%、pH 3.5、酶用量3%、酶解溫度50 ℃、酶解時間4 h為基本條件，在其他條件不變的前提下，設置酶用量0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%；酶解溫度30、35、40、45、50、55、60、70 ℃；酶解時間1、2、2.5、3、4、5、6、7、8 h，以DPPH自由基清除能力作為衡量指標進行單因素試驗。

1.3.4 響應面試驗設計

利用JMP Pro 12.0軟件，根據(jù)中心組合設計原理，選取酶用量（X1）、酶解溫度（X2）、酶解時間（X3）這3 個影響酶解物抗氧化活性的主要因素作為響應面考察因素，以DPPH自由基清除能力、超氧陰離子自由基清除能力和還原力為響應值，設計3因素5水平試驗優(yōu)化酶解工藝，試驗因素與水平見表1。

表1 響應面優(yōu)化試驗因素與水平Table 1 Code and level of independent variables used for response surface design

1.3.5 抗氧化活性檢測

DPPH自由基清除能力測定[24]：將1.5 mL不同濃度的肽溶液與1.5 mL DPPH溶液（1.0 mmol/L）混合，室溫避光反應30 min，于517 nm波長處測定吸光度。

超氧陰離子自由基清除能力測定[25]：將0.1 mL不同濃度的肽粉溶液加入2.8 mL Tris-HCl-EDTA（pH 8.2）緩沖液，25 ℃水浴保溫10 min后加入0.1 mL 3.0 mmol/L鄰苯三酚溶液，迅速混勻，每30 s于325 nm波長處測定吸光度，5 min結(jié)束。作吸光度隨時間變化的回歸方程，求其斜率。超氧陰離子自由基清除能力計算見下式：

式中：V對照為對照組鄰苯三酚自氧化速率/（ΔA/min）；V樣品為樣品組鄰苯三酚自氧化速率/（ΔA/min）。

還原力測定[26]：取1.0 mL樣品與1.0 mL磷酸鈉溶液（pH 6.6）及1.0 mL 1%鐵氰化鉀溶液混合，50 ℃孵化20 min。加入1.0 mL 10%三氯乙酸溶液，5 000×g離心10 min。將2.0 mL上清液與2.0 mL去離子水、0.4 mL 0.1%三氯化鐵溶液混合，室溫靜置10 min，于700 nm波長處測定吸光度。

羥自由基清除能力測定：參考Zhang Tao等[27]的方法。

1.3.6 超濾處理

采用截留分子質(zhì)量為3 kDa的50 mL超濾離心管對酶解物進行分級分離，獲得兩部分肽段（＞3 kDa）和（＜3 kDa），在5 000×g條件下低溫離心15 min，凍干后分析其DPPH自由基清除能力、超氧陰離子自由基清除能力、羥自由基清除能力與還原力。

1.3.7 陽離子交換色譜層析

稱取DOWEX 50W×8（100～200 目，氫型）填充料溶入20 mmol/L醋酸銨溶液（pH 4.0），浸泡使其溶脹2 d，多次浮選去除未沉淀細顆粒后裝柱（2.6 cm×60 cm），洗脫液平衡柱子至基線平穩(wěn)。將超濾所得的抗氧化最強的組分溶解于相同的緩沖液以獲得質(zhì)量濃度為20 mg/mL的樣品，0.22 μm濾膜過濾后上樣，用0～1 mol/L甲酸銨溶液梯度洗脫并用自動部分收集器收集洗脫液，檢測吸光度并混合相同洗脫峰的液體，凍干后分析抗氧化能力。

1.3.8 凝膠色譜層析

將1.3.7節(jié)所得的抗氧化最強的組分，配成20 mg/mL溶液，0.22 μm濾膜過濾后上樣于Superdex Peptide HR 10/30色譜柱，用超純水以1.0 mL/min的流速洗脫，檢測吸光度收集各洗脫峰，冷凍干燥后測定各組分的抗氧化能力。

1.3.9 反相高效液相色譜層析

采用反相高效液相色譜進一步分離1.3.8節(jié)獲得的活性較強的抗氧化組分，配成10 mg/mL溶液，過0.22 μm濾膜，于蛋白純化儀進一步分離純化。色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18預裝柱；流動相A為含0.1%三氟乙酸溶液，流動相B為含0.1%三氟乙酸-乙腈溶液；進樣量為200 μL，流速為0.5 mL/min。上樣前用流動相A平衡3 個柱體積，上樣，再用流動相B進行梯度洗脫，收集活性峰，凍干并分析抗氧化活性。

1.3.10 結(jié)構(gòu)鑒定

采用nano高效液相色譜在線連接電噴霧二級質(zhì)譜鑒定純化肽的氨基酸序列和分子質(zhì)量。將目標肽段上樣于液相色譜柱，用流動相B（含0.1%三氟乙酸-乙腈溶液）進行梯度洗脫；經(jīng)高效液相色譜分析后的樣品穿過Thermo Q-Exactive高分辨質(zhì)譜儀，在陽離子模式下（噴霧電壓2 kV，毛細血管溫度320 ℃）進行離子化（質(zhì)譜檢測由中國農(nóng)業(yè)大學生物質(zhì)譜實驗室完成）。二級質(zhì)譜肽序列分析借助Mascot Distiller 2.4 （Matrix Science，London，UK）和Swissprot數(shù)據(jù)庫。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶的篩選結(jié)果

自由基清除劑可與DPPH中的單電子配對而使其吸收逐漸消失，其褪色程度可用吸光度檢測，因此DPPH被廣泛應用于自由基清除劑的篩選[28-30]。由圖1a可知，酸性蛋白酶酶解物的抗氧化活性明顯優(yōu)于其他5 種酶。而且隨著酶用量的逐漸增加，酸性蛋白酶水解物DPPH自由基清除能力在酶用量3%時達到最大值，為（92.95±0.17）%。由圖1b可知，隨著酶解時間的逐漸延長，酸性蛋白酶酶解物的抗氧化活性維持相對穩(wěn)定狀態(tài)，其DPPH自由基清除能力均維持在90%以上。而其他5 種蛋白酶的酶解物DPPH自由基清除能力隨著時間變化而上下波動。由此可見，酸性蛋白酶酶解物的抗氧化活性最佳且成本低，可作為制備血球抗氧化肽的工具酶。酸性蛋白酶是由黑曲霉發(fā)酵提純而成的內(nèi)切性蛋白酶，安全性高且活力強，其酶解物多具有抗菌[31]、抗氧化[32]、ACE抑制[33]等活性。

圖1 酶用量（a）和酶解時間（b）對酶解物清除DPPH自由基清除能力的影響Fig. 1 Effects of E/S ratio (a) and hydrolysis time (b) on the DPPH scavenging activity of hydrolysates using various proteases

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 酶用量對DPPH自由基清除能力的影響

圖2 酶用量對酶解物DPPH自由基清除能力的影響Fig. 2 Effects of enzyme dosage on the DPPH scavenging activity of hydrolysates

由圖2可知，隨著酶用量的逐漸增加，DPPH自由基清除能力逐漸增強，當酶用量為2.5%～3%時達到最大值。這是因為在底物濃度一定的條件下，酶濃度較低，酶解反應速率快，DPPH自由基清除能力升高。而隨著酶用量的逐漸加大，反應體系中的酸性蛋白酶已處于飽和狀態(tài)，反應速率不再變化，酶解產(chǎn)物DPPH自由基清除能力逐漸趨于平穩(wěn)。當酶用量為2.5%時，DPPH自由基清除能力高達92.30%，考慮到節(jié)約成本，選用酶用量2.5%作為下一步研究條件。

2.2.2 酶解溫度對DPPH自由基清除能力的影響

圖3 酶解溫度對酶解物DPPH自由基清除能力的影響Fig. 3 Effects of hydrolysis temperature on the DPPH scavenging activity of hydrolysates

由圖3可以看出，酶解物的DPPH自由基清除能力隨酶解溫度的升高而增強，在溫度50 ℃時達到最大值；之后，酶解物DPPH自由基清除能力隨溫度的繼續(xù)升高而逐漸降低。因此選用酶解溫度50 ℃作為后續(xù)研究條件。

2.2.3 酶解時間對DPPH自由基清除能力的影響

圖4 酶解時間對酶解物DPPH自由基清除能力的影響Fig. 4 Effects of hydrolysis time on the DPPH scavenging activity of hydrolysates

由圖4可知，酶解時間1～3 h對酶解物DPPH自由基清除能力影響并不明顯，此時其清除能力維持在92%左右。然而隨著酶解時間的延長，其DPPH自由基清除能力總體呈下降趨勢。究其原因可能是隨時間的不斷延長，酸性蛋白酶將具有抗氧化活性的長肽鏈切割水溶性小肽，使其不易與脂溶性的自由基結(jié)合，從而致使抗氧化能力降低[34]?？紤]到酶解產(chǎn)物的穩(wěn)定性問題，選擇酶解時間2.5 h。

2.3 酸性蛋白酶酶解血球的響應面分析

2.3.1 響應面試驗設計及結(jié)果

表2 響應面設計方案與結(jié)果Table 2 Program and experimental values for response surface analysis

表3 DPPH自由基清除能力（Y1）的試驗結(jié)果方差分析Table 3 Analysis of variance for the regression model of DPPH scavenging activity

為獲得高抗氧化活性的血球蛋白酶解物，采用響應面設計對水解條件（酶用量、酶解溫度和酶解時間）進行優(yōu)化，以期獲得抗氧化最強的酶解物。以X1、X2、X3分別表示酶用量、酶解溫度與酶解時間，以DPPH自由基清除能力（Y1）、超氧陰離子自由基清除能力（Y2）和還原力（Y3）為響應值，設計3因素5水平的二次回歸方程擬合因素和響應值間的函數(shù)關系，見表2。根據(jù)試驗結(jié)果建立多元二次回歸方程：Y1=77.50-14.94X1+2.47X2-10.49X3-0.58X12-0.03X22+4.96X32+0.30X1X2-0.89X1X3-0.25X2X3；Y2=-292.2+69.70X1+7.88X2+42.70X3-15.09X12-0.095X22-8.74X32+0.31X1X2-3.54X1X3+0.18X2X3；Y3=4.67-1.58X1-0.026X2-0.15X3+0.11X12-0.000 62X22+0.15X32+0.033X1X2-0.23X1X3-0.000 47X2X3。

表4 超氧陰離子自由基清除能力（Y2）的試驗結(jié)果方差分析Table 4 Analysis of variance for the regression model of superoxide anion scavenging activity

表5 還原力（Y3）的試驗結(jié)果方差分析Table 5 Analysis of variance for the regression model of reducing power

由表3～5可知，3 個模型的R2和調(diào)整R2均大于0.93，且P值均小于0.000 1，證明該試驗方法是可靠的，各因素水平區(qū)間設計合理，因此可用模型替代真實試驗點來模擬因素和響應值之間的關系。此外，X2（酶解溫度）對3 個響應值均有極顯著的線性影響（P＜0.01），且其二次項也可顯著影響抗氧化效果（P＜0.05）。而X3（酶解時間）與3個因變量Y1、Y2和Y3

2.3.2 交互作用分析

圖5 酶用量和酶解溫度交互作用對酶解物抗氧化活性的影響Fig. 5 Three-dimensional response surface plots showing the interactive effects of various factors on the antioxidative activity of hydrolysates

采用JMP軟件對酶用量和酶解溫度交互作用進行模型分析，當酶解時間固定在中心值2.5 h時，酶用量和酶解溫度對Y1、Y2和Y3影響的響應面分析圖及等高線如圖5所示。對于酶解物的DPPH自由基清除能力（Y1）而言，酶用量（X1）對其影響最顯著，酶用量的增加會引起清除能力的下降。而且酶用量對酶解物的超氧陰離子自由基清除能力（Y2）的影響效果也很明顯，酶用量在2%～2.5%范圍內(nèi)Y2達到最高值。而酶解溫度在45～50 ℃時可獲得較高的DPPH和超氧陰離子自由基清除能力，這是因為在該溫度區(qū)時，部分蛋白在熱作用下去折疊，內(nèi)部疏水基團或質(zhì)子供體殘基暴露，而且此時蛋白酶活性最高，有利于酶解反應，對酶解產(chǎn)物發(fā)揮抗氧化活性有一定的促進作用。就還原力而言，高溫高酶用量或低溫低酶用量有助于提高酶解物的還原力。

2.3.3 最佳酶解工藝條件的驗證結(jié)果

對回歸模型進行數(shù)學分析，獲得酸性蛋白酶酶解血球的最佳工藝參數(shù)為酶用量2%、酶解溫度45 ℃、酶解時間3.0 h，這與表2中處理組18相同。比較而言，該條件下所獲得的DPPH自由基清除能力和還原力明顯優(yōu)于其他處理組，因此確定酶用量2%、酶解溫度45 ℃和酶解時間3.0 h為最佳工藝條件。該條件下，獲得的酸性蛋白酶酶解物的DPPH自由基清除能力為（98.31±0.66）%，超氧陰離子自由基清除能力為（28.89±0.31）%，還原力為1.94±0.03。

2.4 抗氧化肽純化結(jié)果

2.4.1 超濾各組分抗氧化性比較

表6 酸性蛋白酶酶解物超濾后兩組分的抗氧化活性Table 6 Antioxidant activity of two ultrafiltration fractions of antioxidant hydrolysate SH

采用截留分子質(zhì)量為3 kDa的超濾膜對血球蛋白酸性蛋白酶酶解物進行初步分離純化，收集得到兩個組分：SH-I和SH-II。由表6可知，SH-I（＜3 kDa，4 mg/mL）清除DPPH自由基、超氧陰離子自由基能力和還原力明顯高于SH-II（P＜0.01，4 mg/mL）。雖然SH-I和SH-II清除羥自由基的能力在統(tǒng)計學意義上不顯著，但SH-I的羥自由基清除能力數(shù)值上高于SH-II。加之目前報道的生物活性肽多是低于3 kDa的肽段，因此組分SH-I被多次收集凍干后繼續(xù)下一步分離。

2.4.2 陽離子交換色譜層析

將SH-I上樣于陽離子交換層析柱，經(jīng)甲酸銨溶液梯度洗脫后獲得4 組分（A～D），多次重復分離、收集組分凍干后測定各組分的DPPH自由基清除能力。由圖6a1可以看出，所有分離組分中，組分B（2 mg/mL）具有最強的DPPH自由基清除能力，為（88.92±6.03）%。此外，研究還發(fā)現(xiàn)組分B具有最強還原力為0.96±0.02，因此對B組分進行下一步分離純化。

2.4.3 凝膠色譜層析

Superdex Peptide HR 10/30凝膠色譜柱對B組分進行分離純化，分成10 個不同的組分（a～j）見圖6b1。所有組分被收集凍干后測定其抗氧化能力。結(jié)果表明，陽離子交換色譜層析獲得的B組分經(jīng)凝膠色譜分離后的j組分（0.1 mg/mL）的DPPH自由基清除能力最強，被應用于下一步的分離純化。

2.4.4 反相高效液相色譜層析

將酸性蛋白酶酶解物經(jīng)超濾、離子交換色譜層析、凝膠色譜層析后得到的組分j加入到Zorbax SB-C18的柱子進行高效液相色譜的進一步分離純化，結(jié)果如圖6c1所示。通過檢測2 個組分的抗氧化活性發(fā)現(xiàn)，組分I（0.1 mg/mL）具有最強的DPPH自由基清除能力（（87.16±1.59）%）和還原力（0.21±0.01）。該組分再次上樣于高效液相色譜檢驗純度后，進行質(zhì)譜分析。

圖6 分離純化SH-I制備抗氧化肽并鑒定其氨基酸序列Fig. 6 Purification and identification of antioxidant peptide SH-I

2.5 結(jié)構(gòu)鑒定與分析

經(jīng)分離純化后的組分I采用高效液相色譜-串聯(lián)電噴霧電離源質(zhì)譜儀進行測序并借助軟件對質(zhì)譜結(jié)果進行分析。如圖6d2所示，氨基酸序列為Met-Gly-Gln-Lys-Asp-Ser-Tyr-Val-Gly-Asp-Glu-Ala-Gln-Ser-Lys-Arg-Gly-Ile-Leu-Thr（MGQKDSYVGDEAQSKRGILT）。根據(jù)氨基酸序列預測該抗氧化肽的結(jié)構(gòu)如圖7所示。經(jīng)肽庫、抗菌肽庫和美國化學文摘等檢索，該肽段為首次發(fā)現(xiàn)的具有顯著抗氧化活性的肽段。

該目標肽的分子質(zhì)量為2 182.1 Da，與源自金槍魚內(nèi)臟蛋白酶解物的抗氧化肽（518.5 Da）、玉米抗氧化肽（782.3 Da）和脫脂花生粕抗氧化肽（325.5 Da）相比，其分子質(zhì)量較大。但也有許多研究學者從食源蛋白中分離提取出2 kDa左右的抗氧化肽，如鱈魚骨架中1 801 Da的抗氧化肽[13]、雞蛋中1 754 Da抗氧化肽[30]、牛蛙肌肉中1 988 Da抗氧化肽[35]等。多數(shù)研究報道表明，分子質(zhì)量在200～3 000 Da區(qū)間的肽段具有較強的抗氧化活性[25,36-37]。此外，該肽段中含有Met、Leu等疏水性氨基酸和非極性脂肪族氨基酸（Val），這些氨基酸對疏水性組分有很高的結(jié)合能力，有助于增強活性肽和自由基間的相互作用從而提高抗氧化能力[38-39]。也有研究報道稱酸性氨基酸（Glu、Asp等）殘基的存在有助于增強肽段的抗氧化能力[40]。此外，Tyr、Gly、Glu、Gln等氨基酸殘基可提供質(zhì)子以淬滅孤電子或自由基，這對肽抗氧化活性的體現(xiàn)具有重要影響[41]?？傮w而言，氨基酸數(shù)目、種類及組成對抗氧化肽發(fā)揮其活性具有至關重要的作用。

圖7 純化肽的預測結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 7 Predicted structure of the purified peptide

3 結(jié) 論

本研究通過酶解雞血球蛋白制備抗氧化肽并對其進行結(jié)構(gòu)鑒定。6 種蛋白酶中，酸性蛋白酶水解獲得的酶解物具有最高的DPPH自由基清除能力（＞80%）。采用響應面分析法優(yōu)化酶解工藝，獲得其最佳水解條件為酶用量2%、酶解溫度45 ℃和酶解時間3.0 h，在此條件下獲得酸性蛋白酶酶解物的DPPH自由基清除能力為（98.31±0.66）%，超氧陰離子自由基清除能力為（28.89±0.31）%，還原力為1.94±0.03。利用超濾、離子交換色譜、凝膠色譜層析和反相高效液相色譜分離純化得到液相組分I，其在質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL時，DPPH自由基清除能力和還原力分別為（87.16±1.59）%和0.21±0.01。經(jīng)質(zhì)譜鑒定得到的目標肽氨基酸序列為MGQKDSYVGDEAQSKRGILT，分子質(zhì)量為2 182.1 Da。為家禽血液蛋白資源的開發(fā)利用和精深加工提供實驗依據(jù)和技術參考，也為家禽血球蛋白酶解物開發(fā)成抗氧化的功能性添加劑奠定理論基礎。