宛美志，孟憲軍*

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110866）

蔓越橘又名蔓越莓、小紅莓，原名“鶴莓”，因蔓越莓的花朵形似鶴的頭和喙而得名，果實(shí)表皮鮮紅，果肉泛白，空心有籽，干物質(zhì)含量高且質(zhì)地較輕。蔓越橘屬于杜鵑花科越橘屬紅莓苔子亞屬，植株為常綠灌木，喜生長(zhǎng)在潮濕寒冷、地質(zhì)弱酸的泥炭土壤，主要集中分布在北美、北歐地區(qū)，全球產(chǎn)區(qū)不到4萬 英畝[1]。我國(guó)蔓越莓栽培區(qū)主要集中在大興安嶺地區(qū)、遼寧省和吉林省的東南部，這些區(qū)域具備蔓越橘生長(zhǎng)所需要的土壤、溫度、光照、水分以及無霜期等環(huán)境條件。蔓越橘富含活性成分[2]、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高[3-5]。柯春林等[6]研究表明乙醇提取蔓越莓花色苷含量可達(dá)5.5%；Cesoniene等[7]研究表明不同性系野生蔓越莓花色苷含量為40.7～207.3 mg/100 g；蔓越莓花色苷具有抗氧化能力[6,8]（如清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-dipheny1-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基的能力[9-11]、清除2,2’-聯(lián)氮基-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2,2’-aminodi(3-ethyl-benzothiazoline sulphonic acid-6)ammonium salt，ABTS）自由基的能力[10]和還原鐵離子的能力[11-12]等）及基于抗氧化活性的其他生理功能。近年來，隨著食品科學(xué)和食品營(yíng)養(yǎng)學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，蔓越莓的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值得到普遍重視。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)蔓越莓花色苷進(jìn)行提取、純化、花色苷組成鑒定和抗氧化能力測(cè)定，為蔓越莓資源的發(fā)展、評(píng)價(jià)及利用提供理論依據(jù)。

超高壓輔助提取通常的壓力范圍在100～600 MPa之間。在保證食品安全性的前提下，超高壓提取具有提取時(shí)間短、提取率高、對(duì)生物活性物質(zhì)影響小等特點(diǎn)[13-14]。目前超高壓提取被視為生物活性物質(zhì)最具潛力的提取方式之一，已經(jīng)成功應(yīng)用到多糖[15]、多酚[16]、果膠[17]等活性成分的提取，但是利用超高壓提取技術(shù)提取蔓越莓花色苷鮮見報(bào)道。

高效液相色譜-質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）聯(lián)用技術(shù)被廣泛應(yīng)用于食品、生物、醫(yī)藥、化工、環(huán)境和有害物質(zhì)殘留檢測(cè)等方面[18-19]。Gomes等[13]通過超高效液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)鑒定出蔓越莓中7 種花色苷，分別為矢車菊素-3-半乳糖苷、矢車菊素-3-葡萄糖苷、矢車菊素-3-阿拉伯糖苷、芍藥素-3-半乳糖苷、芍藥素-3-葡萄糖苷、錦葵素-3-半乳糖苷、芍藥素-3-阿拉伯糖苷。Cesonien?等[7]研究表明蔓越莓中包含6 種花色苷，其中以芍藥素-3-半乳糖苷最常見。Jin[20]和Wang Yifei[21]等在蔓越莓中鑒定出矢車菊素-3-葡萄糖苷等花色苷和楊梅素-3-葡萄糖苷等類黃酮類化合物。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蔓越莓產(chǎn)地為吉林省，鮮果采摘后保存在-80 ℃超低溫冰箱中，備用。

DPPH 美國(guó)Sigma公司；AB-大孔樹脂 安徽三星樹脂科技有限公司；ABTS試劑盒、T-AOC試劑盒南京建成生物工程研究所；無水乙醇（分析純） 天津市富宇精細(xì)化工有限公司；鹽酸（分析純） 西隴化工股份有限公司；氯化鉀、無水乙酸鈉（均為分析純）國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MJ-BL25B3美的攪拌機(jī) 廣東美的生活電器制造有限公司；BSA224S型電子分析天平、PB-10型pH計(jì) 北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、玻璃層析柱（18 mm×300 mm） 上海亞榮生化儀器廠；UV-1600型紫外-可見分光光度儀 北京瑞利分析儀器公司；DK-S26型電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；BYGY5L型超高壓殺菌機(jī) 溫州濱一機(jī)械科技有限公司；SHZ-D（III）循環(huán)水式真空泵 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；HL-2恒流泵、BS-100A自動(dòng)部分收集器 上海滬西分析儀器廠有限公司；Epoch型酶標(biāo)儀美國(guó)博騰儀器有限公司；1100型HPLC-MS聯(lián)用儀美國(guó)Agilent公司；LG0.2真空冷凍干燥機(jī) 沈陽新陽航空速凍設(shè)備制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蔓越莓花色苷的超高壓輔助提取

參考李新原等[16]的方法稍作修改。稱取蔓越莓凍果于室溫條件下避光解凍，轉(zhuǎn)入攪拌機(jī)中打漿，準(zhǔn)確稱取20 份5.0 g蔓越莓果漿無損失地轉(zhuǎn)移到PET真空包裝袋中，分別加入100 mL體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇溶液（用質(zhì)量分?jǐn)?shù)36%～38%的濃鹽酸將乙醇溶液調(diào)至pH值為2.0），塑封機(jī)封口，超高壓400 MPa，提取12 min，過濾，測(cè)定其吸光度，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，所得花色苷濃縮液冷凍干燥成粉，-80 ℃避光密封貯存，使用時(shí)按需配制。

1.3.2 蔓越莓花色苷的常規(guī)溶劑提取

參考柯春林等[6]的方法稍作修改。稱取等質(zhì)量的蔓越莓果漿于燒杯中，按照料液比1∶20（g/mL）加入體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶液（用質(zhì)量分?jǐn)?shù)36%～38%的濃鹽酸將乙醇溶液調(diào)至pH值為2.0），保鮮膜封口，水浴溫度40 ℃，提取60 min，測(cè)定其吸光度。在此條件下所得蔓越莓花色苷樣品與超高壓輔助提取蔓越莓花色苷樣品作比較。

1.3.3 蔓越莓花色苷的純化

稱取一定量的AB-8大孔樹脂，依次用無水乙醇、質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%鹽酸溶液、質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%氫氧化鈉溶液進(jìn)行預(yù)處理，預(yù)處理后的大孔樹脂采用濕法裝柱，樹脂填充體積為玻璃層析柱的2/3，以2 mL/min的流速將400 mL蒸餾水泵入層析柱進(jìn)行平衡過濾，平衡后以2 mL/min的流速泵入由1.3.1節(jié)所得凍干粉配制的花色苷溶液，泵入量為大孔樹脂體積的1/2，然后靜置吸附12 h。待花色苷充分吸附后以4.3 mL/min的流速將800 mL蒸餾水泵入層析柱，洗去花色苷溶液中的蛋白質(zhì)、多糖、無機(jī)鹽等雜質(zhì)。用無水乙醇以2 mL/min的流速洗脫花色苷，收集洗脫液，重復(fù)過柱2 次，最終得到的洗脫液轉(zhuǎn)入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮除去乙醇，濃縮液冷凍干燥成粉，密封，避光貯存在-80 ℃冰箱中，備用。

1.3.4 花色苷含量測(cè)定

取1 mL花色苷溶液，分別用pH 1.0的氯化鉀緩沖溶液和pH 4.5的乙酸鈉緩沖溶液稀釋至10 mL，混勻后于室溫條件下靜置反應(yīng)15～20 min，分別在波長(zhǎng)520 nm和700 nm處，用1 cm比色皿測(cè)定吸光度，重復(fù)操作3 次，取平均值。采用示差法按照公式（1）、（2）計(jì)算蔓越莓花色苷的含量：

式中：ΔA為緩沖液稀釋后的吸光度；V為提取液體積/mL；n為稀釋倍數(shù)；M為矢車菊素-3-葡萄糖苷摩爾質(zhì)量449.2 g/mol；ξ為矢車菊-3-葡萄糖苷消光系數(shù)26 900 L/（mol·cm）；m為稱取樣品質(zhì)量/g；b為比色皿厚度/cm。

1.3.5 花色苷提取率測(cè)定

將蔓越莓凍果于攪拌機(jī)中打漿，準(zhǔn)確稱取5.0 g蔓越莓果漿，加入50 mL體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶液（用質(zhì)量分?jǐn)?shù)36%～38%的濃鹽酸將乙醇溶液調(diào)至pH值為2.0），混勻，超高壓400 MPa，提取時(shí)間12 min，過濾，濾渣重復(fù)提取2 次，合并濾液，取1 mL濾液，采用pH示差法按照公式（1）、（2）計(jì)算蔓越莓總花色苷的含量。超高壓輔助提取蔓越莓花色苷的提取率是指粗提液中花色苷含量與蔓越莓總花色苷含量的百分比，按公式（3）計(jì)算：

式中：C1為超高壓輔助提取蔓越莓花色苷粗提液中花色苷含量/（mg/g）；C總為蔓越莓總花色苷含量/（mg/g）。

1.3.6 花色苷組成鑒定

準(zhǔn)確稱取10 μg 1.3.2節(jié)中所得凍干粉，用色譜級(jí)甲醇稀釋至2 mL，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，待測(cè)。

HPLC條件：1100型HPLC儀（配G4212B二極管陣列檢測(cè)器）；C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相A為乙腈；流動(dòng)相B為0.1%甲酸溶液；梯度洗脫程序：0～45 min，0%～45% A；45～50 min，0% A；流速0.7 mL/min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)520 nm。

MS條件：正離子模式，全自動(dòng)二級(jí)質(zhì)譜掃描；質(zhì)量掃描范圍m/z 50～1 000；干燥氣壓力40 psi；流速12 L/min；溫度350 ℃；毛細(xì)管電壓3 500 V。

1.3.7 DPPH自由基清除能力測(cè)定

參照呂春茂等[22]的方法稍作修改。用無水乙醇配制0.2 mmol/L DPPH溶液，稱取1.3.2節(jié)所得花色苷凍干粉配制成不同質(zhì)量濃度的待測(cè)液，100 μL花色苷待測(cè)液加入100 μL DPPH溶液，混勻后于室溫避光放置30 min，在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光度為A1，無水乙醇溶液代替花色苷溶液測(cè)定吸光度為A0，無水乙醇代替DPPH溶液測(cè)定吸光度為A2；以同質(zhì)量濃度VC作陽性對(duì)照。根據(jù)公式（4）計(jì)算DPPH自由基清除率：

1.3.8 ABTS+·清除能力測(cè)定

稱取1.3.2節(jié)所得花色苷凍干粉配制成不同質(zhì)量濃度的待測(cè)液，根據(jù)試劑盒方法配制ABTS工作液，200 μL ABTS工作液加入10 μL花色苷待測(cè)液，混勻后室溫孵育6 min，在波長(zhǎng)734 nm處測(cè)定吸光度，以同質(zhì)量濃度VC作陽性對(duì)照，以Trolox代替花色苷測(cè)定吸光度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算花色苷待測(cè)液的ABTS+·清除能力。

1.3.9 總抗氧化能力測(cè)定

參照安小琦等[23]的方法稍作修改，稱取1.3.2節(jié)所得花色苷凍干粉配制成不同質(zhì)量濃度的待測(cè)液，以同質(zhì)量濃度VC作陽性對(duì)照，按照T-AOC試劑盒說明書加入試劑，在波長(zhǎng)520 nm處測(cè)定吸光度。T-AOC測(cè)定原理為花色苷和VC能使Fe3+還原成Fe2+，F(xiàn)e2+與菲啉類物質(zhì)絡(luò)合，通過比色法測(cè)定抗氧化能力。在37 ℃時(shí)，每分鐘每毫升花色苷溶液，使反應(yīng)體系的吸光度，每增加0.01時(shí)，為一個(gè)總抗氧化能力單位（U）。根據(jù)公式（5）計(jì)算總抗氧化能力：

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)操作3 次，采用Excel 2007軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理繪圖，SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析（Duncan’s差異顯著性分析），P＜0.05，表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 2 種方法提取蔓越莓花色苷含量、提取率及提取條件的比較

采用pH示差法測(cè)得超高壓輔助提取蔓越莓花色苷含量為（75.49±0.43）mg/100 g，常規(guī)溶劑提取蔓越莓花色苷含量為（67.31±1.08）mg/100 g；蔓越莓中總花色苷含量為（79.52±0.50）mg/100 g。如表1所示，超高壓輔助提取蔓越莓花色苷提取率為（94.92±0.54）%，常規(guī)溶劑提取蔓越莓花色苷提取率為（84.65±1.36）%。與常規(guī)溶劑提取法相比，超高壓輔助提取法時(shí)間短，操作條件溫和（不需加熱），提取率顯著高于常規(guī)溶劑提取法，因此，采用超高壓輔助提取蔓越莓花色苷更合適。1.3.1節(jié)中所得粗提物凍干粉的花色苷含量為（46.10±0.92）mg/g，經(jīng)AB-8大孔樹脂純化后，所得純化物凍干粉的花色苷含量提高到（309.26±2.37）mg/g。

表1 不同方法提取條件及提取率的比較Table 1 Comparison of extraction conditions and anthocyanin yield by different extraction methods

2.2 蔓越莓花色苷HPLC-MS聯(lián)用分析鑒定結(jié)果

圖1 蔓越莓花色苷色譜圖Fig. 1 HPLC chromatogram of cranberry anthocyanins

圖2 芍藥素-3,5-二己糖苷質(zhì)譜圖Fig. 2 Mass spectra of peonidin-3,5-dihexoside

表2 HPLC-MS鑒定蔓越莓花色苷種類Table 2 Identi fi cation of cranberry anthocyanins by HPLC-MS

通過HPLC-MS聯(lián)用技術(shù)對(duì)蔓越莓花色苷進(jìn)行組成鑒定，如圖1、2，表2所示。結(jié)合各物質(zhì)的色譜保留時(shí)間、分子離子峰和碎片離子峰，鑒定出蔓越莓中主要有7 種花色苷，與Gomes[13]和Jin[20]等的研究結(jié)果基本一致，芍藥素-3-半乳糖苷的含量最高，其次為矢車菊素-3-半乳糖苷和矢車菊素-3-阿拉伯糖苷，與Cesonien?[7]和Oszmiański[11]等研究結(jié)果一致。

如圖2所示，峰1物質(zhì)分子離子m/z 625，碎片離子m/z 463、301，是由分子離子失去一分子己糖苷[M-162]+而成，m/z 463和m/z 301之間也相差一個(gè)162的己糖苷，且m/z 301是芍藥素的配離子峰，推測(cè)峰1物質(zhì)可能是帶有2 個(gè)己糖苷的芍藥素花色苷，參考相關(guān)文獻(xiàn)[23-24]可知峰1物質(zhì)是芍藥素-3,5-二己糖苷。該種花色苷首次在蔓越莓中被檢測(cè)到。

綜合參考文獻(xiàn)[7,11,13,20]可知，峰2、3均為分子離子m/z 449，碎片離子m/z 287的物質(zhì)，m/z 287是矢車菊素配離子峰，根據(jù)兩者出峰順序和保留時(shí)間不同分析可知，峰2物質(zhì)是矢車菊-3-半乳糖苷，峰3物質(zhì)是矢車菊-3-葡萄糖苷。峰4物質(zhì)是母離子失去一分子阿拉伯糖[M-132]+而成，綜合保留時(shí)間分析，峰4物質(zhì)是矢車菊-3-阿拉伯糖苷。峰5物質(zhì)的碎片離子m/z 301是芍藥素配離子峰，是母離子失去一分子六碳糖[M-162]+而成，可知峰5物質(zhì)是芍藥素-3-半乳糖苷。峰6物質(zhì)的碎片離子m/z 301是芍藥素的配離子峰，是由母離子失去一個(gè)六碳糖[M-162]+而成，可知峰6物質(zhì)是芍藥素-3-葡萄糖苷。峰7物質(zhì)的碎片離子m/z 301是芍藥素配離子峰，是母離子失去一分子阿拉伯糖[M-132]+而成，可以確定峰7物質(zhì)是芍藥素-3-阿拉伯糖。

2.3 蔓越莓花色苷抗氧化能力測(cè)定結(jié)果

2.3.1 DPPH自由基清除能力測(cè)定結(jié)果

如圖3所示，蔓越莓花色苷和VC對(duì)DPPH自由基的清除能力均隨著質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，相同質(zhì)量濃度條件下，蔓越莓花色苷對(duì)DPPH自由基的清除能力強(qiáng)于VC，根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，花色苷和VC的DPPH自由基清除率差異顯著（P＜0.05）。引入半抑制濃度（the half maximal inhibitory concentration，IC50）作為一個(gè)參考指標(biāo)[25]，IC50值在此定義為DPPH清除率50%時(shí)對(duì)應(yīng)的花色苷或VC的質(zhì)量濃度，IC50值越小，抗氧化能力越強(qiáng)；花色苷的IC50值為92.81 μg/mL，VC的IC50值為129.82 μg/mL，250 μg/mL花色苷和VC的清除率均在90%以上。原理為花色苷和VC可以與DPPH自由基的單電子配對(duì)，使其在517 nm波長(zhǎng)處的吸收減弱，花色苷接受DPPH的電子數(shù)量多于VC，褪色更顯著，清除率更高，所以抗氧化能力更強(qiáng)。

圖3 蔓越莓花色苷的DPPH自由基清除率Fig. 3 DPPH free radical scavenging capacity of cranberry anthocyanins

2.3.2 ABTS+·清除能力測(cè)定結(jié)果

圖4 蔓越莓花色苷的ABTS＋·清除能力Fig.4 ABTS+· scavenging capacity of cranberry anthocyanins

如圖4所示，蔓越莓花色苷和VC對(duì)ABTS+·的清除能力均隨著質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，在相同質(zhì)量濃度條件下，蔓越莓花色苷對(duì)ABTS+·的清除能力強(qiáng)于VC，根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，蔓越莓花色苷和VC對(duì)ABTS+·的清除能力差異顯著（P＜0.05）。ABTS在氧化劑作用下氧化成綠色的ABTS+·，花色苷和VC可以抑制ABTS+·的產(chǎn)生，削弱其在734 nm波長(zhǎng)處的吸收[26]。Trolox是一種VE類似物，定義Trolox抗氧化能力為1，其他物質(zhì)的抗氧化能力用其相比于Trolox的倍數(shù)表示。以標(biāo)準(zhǔn)品當(dāng)量質(zhì)量濃度為x，吸光度為y，作標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=-0.040 83x-0.046 69，R2=0.999 2，在250 μg/mL時(shí)蔓越莓花色苷和VC對(duì)ABTS+·清除能力分別是Trolox的2.8 倍和2 倍，蔓越莓花色苷對(duì)ABTS+·的清除能力是VC的1.4 倍。

2.3.3 總抗氧化能力測(cè)定

如圖5所示，在50～250 μg/mL范圍內(nèi)，蔓越莓花色苷和VC的總抗氧化能力均隨著質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，蔓越莓花色苷的總抗氧化能力顯著高于VC（P＜0.05），250 μg/mL蔓越莓花色苷和VC的總抗氧化能力分別為2.61、1.50 U/mL。蔓越莓花色苷的總抗氧化能力、DPPH自由基清除率和ABTS+·清除能力變化趨勢(shì)一致，質(zhì)量濃度越高，抗氧化能力越強(qiáng)，兩者呈正相關(guān)[27-30]。

圖5 蔓越莓花色苷的總抗氧化能力Fig. 5 Total antioxidant capacity of cranberry anthocyanins

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用超高壓輔助提取法提取蔓越莓花色苷，提取條件為料液比1∶20（g/mL）、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、pH 2.0、超高壓壓力400 MPa、提取時(shí)間12 min，花色苷含量為（75.49±0.43）mg/100 g；常規(guī)溶劑提取蔓越莓花色苷，提取條件為料液比1∶20（g/mL）、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、pH 2.0、提取溫度40 ℃、提取時(shí)間60 min，花色苷含量為（67.31±1.08）mg/100 g；蔓越莓中總花色苷含量為（79.52±0.50）mg/100 g，超高壓輔助提取蔓越莓花色苷提取率為（94.92±0.54）%，常規(guī)溶劑提取蔓越莓花色苷提取率為（84.65±1.36）%，說明超高壓輔助提取蔓越莓花色苷的效果較好。選擇AB-8大孔樹脂對(duì)蔓越莓花色苷粗提物進(jìn)行純化，凍干粉中花色苷含量從（46.10±0.92）mg/g提高到（309.26±2.37）mg/g。通過測(cè)定DPPH自由基清除率、ABTS+·清除能力、總抗氧化能力，比較蔓越莓花色苷與VC的抗氧化能力。結(jié)果表明：相同質(zhì)量濃度條件下，蔓越莓花色苷的抗氧化能力強(qiáng)于VC。采用HPLC-MS聯(lián)用技術(shù)對(duì)蔓越莓花色苷的組成進(jìn)行鑒定，共鑒定出7 種花色苷，分別為芍藥素-3,5-二己糖苷、矢車菊-3-半乳糖苷、矢車菊-3-葡萄糖苷、矢車菊-3-阿拉伯糖苷、芍藥素-3-半乳糖苷、芍藥素-3-葡萄糖苷、芍藥素-3-阿拉伯糖苷，其中芍藥素-3,5-二己糖苷首次在蔓越莓中被鑒定出。綜上所述，超高壓輔助提取蔓越莓花色苷效果較好，蔓越莓中花色苷含量較高，花色苷種類豐富，其抗氧化能力顯著高于VC。