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        熱處理對(duì)大豆11S球蛋白溶解性和二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

        2018-11-28 06:51:56齊寶坤趙城彬江連洲
        食品科學(xué) 2018年22期
        關(guān)鍵詞:聚集體卷曲溶解性

        齊寶坤,趙城彬,李 楊,徐 靚,丁 儉,王 歡,江連洲,*

        (1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150030;2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,吉林 長春 130118)

        溶解性是大豆蛋白最重要的功能特性之一,它是大豆蛋白其他功能特性的基礎(chǔ),是大豆蛋白可應(yīng)用性的重要參數(shù)。一般來說,蛋白質(zhì)具有良好的功能特性,前提是必須有較高的溶解性,蛋白質(zhì)的凝膠性、乳化性等其他功能特性都與蛋白質(zhì)的溶解性密切相關(guān)[1]。在大豆蛋白食品生產(chǎn)加工過程中都包括熱處理過程,如熱殺菌、噴霧干燥等,這些操作都會(huì)對(duì)大豆蛋白的溶解性、乳化性、穩(wěn)定性等功能性質(zhì)產(chǎn)生較大的影響[2]。在食品生產(chǎn)加工過程中,溫度較低或熱處理時(shí)間較短時(shí)大豆蛋白的結(jié)構(gòu)不會(huì)發(fā)生改變,使大豆蛋白表現(xiàn)出的功能特性不理想,但過高溫度或過長時(shí)間的熱處理又會(huì)使大豆蛋白過度變性和蛋白質(zhì)分子發(fā)生聚集,使其失去大部分固有的功能性質(zhì)[3]。熱處理的溫度和時(shí)間等因素對(duì)蛋白質(zhì)的聚集程度具有重要影響,可以通過調(diào)整熱處理?xiàng)l件控制蛋白質(zhì)的溶解、聚集狀態(tài),從而控制蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)[4]。大豆分離蛋白主要是由β-伴大豆球蛋白(7S)和大豆球蛋白(11S)組成,由于11S球蛋白具有緊密的分子結(jié)構(gòu),多數(shù)活性基團(tuán)被包裹在球狀結(jié)構(gòu)的內(nèi)部,這是限制大豆蛋白在食品中應(yīng)用的關(guān)鍵因素[5]。因此,研究大豆11S球蛋白對(duì)改善大豆分離蛋白功能性質(zhì)及拓展其應(yīng)用具有重要意義[6-8]。目前已有較多研究以大豆分離蛋白、大豆7S球蛋白和11S球蛋白為對(duì)象,探討熱處理過程中蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化及聚集行為。Weijers等[9]研究指出蛋白質(zhì)的變性和聚集程度會(huì)對(duì)大豆蛋白的功能性質(zhì)產(chǎn)生顯著影響。Chen Nannan等[10]對(duì)中性條件下,50~95 ℃形成的大豆11S球蛋白熱聚集體進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)聚集體的粒徑隨著熱處理時(shí)間的延長而增大,而且在這種熱處理?xiàng)l件下均能形成熱凝膠。本實(shí)驗(yàn)對(duì)大豆11S球蛋白的溶解性和紅外光譜進(jìn)行分析,探討熱處理對(duì)大豆11S球蛋白溶解性和二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響,為功能性大豆食品開發(fā)和品質(zhì)控制提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        大豆(東農(nóng)46) 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所;Lowry法蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒 上海荔達(dá)生物科技有限公司;牛血清白蛋白 美國Sigma公司;溴化鉀(分析純) 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

        1.2 儀器與設(shè)備

        Allegra 64R低溫高速離心機(jī) 美國Beckman公司;FD 5-3型冷凍干燥機(jī) 美國SIM公司;AKTA-蛋白質(zhì)純化儀 美國GE公司;PE Pyris 6差示掃描量熱(differential scanning calorimetry,DSC)儀 美國PULUS TA.XT公司;1600PC紫外-可見分光光度計(jì)上海美普達(dá)儀器有限公司;MAGNA-IR560傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy,F(xiàn)TIR)系統(tǒng) 美國尼高力公司。

        1.3 方法

        1.3.1 大豆11S球蛋白的制備

        根據(jù)Bojórquez-velázquez等[11]的方法。制備步驟如下:

        大豆→脫皮→粉碎→過60 目篩→正己烷脫脂→脫脂大豆粉→與水混合(料液比1∶15(g/mL))→調(diào)節(jié)pH 7.5→提取2 h→離心分離(10 000×g,15 min)→取上清液→添加亞硫酸鈉(0.98 g/L)→提取1 h→調(diào)節(jié)pH 6.4→4 ℃過夜→離心分離(12 000×g,20 min)→沉淀→凍干→大豆11S球蛋白粗提物。

        應(yīng)用AKTA-蛋白質(zhì)純化儀和HiLoad 16/60 Superdex 200 prep grade凝膠制備級(jí)預(yù)裝柱,對(duì)大豆11S球蛋白粗提物進(jìn)行純化。根據(jù)Yadav等[12]的方法,采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析蛋白質(zhì)組成,分離膠為12%,濃縮膠為4%。蛋白質(zhì)量濃度為1 mg/mL,上樣量為10 μL,電泳結(jié)束后考馬斯亮藍(lán)R250進(jìn)行染色,分析亞基組成。通過光密度掃描結(jié)果顯示酸性亞基和堿性亞基之和占該泳道光密度強(qiáng)度的92%,即提取的大豆11S球蛋白純度約為92%。

        1.3.2 大豆11S球蛋白的熱處理

        將一定量大豆11S球蛋白溶于50 mL、0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液中,配制成5%的蛋白溶液,蛋白質(zhì)濃度采用Lowery法測(cè)定,參比蛋白為牛血清白蛋白。將蛋白溶液分別密封于加熱套管中在溫控水浴鍋中分別進(jìn)行80、90 ℃和100 ℃的熱處理,熱處理時(shí)間分別為10、20、30、45、60 min和90 min。

        1.3.3 熱性質(zhì)測(cè)定

        參考Tang Chuanhe等[13]的方法,利用PE Pyris 6-DSC儀測(cè)定大豆11S球蛋白樣品的熱力學(xué)特性。稱取5 mg的樣品放入鋁盒中,加入10 μL、0.01 mol/L的磷酸緩沖液,壓盤密封,室溫條件下放置6 h;將平衡好的樣品放到DSC操作臺(tái)左側(cè),空白鋁盒放在右側(cè)。溫度掃描范圍為20~120 ℃,升溫速率為10 ℃/min,在120 ℃保持1 min;隨后以30 ℃/min的速率降溫至20 ℃。利用Pyris 6.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和處理得到大豆11S球蛋白的DSC曲線,峰值溫度為蛋白質(zhì)的變性溫度(Td),曲線與基線間的面積確定熱焓變(ΔH)。

        1.3.4 溶解性測(cè)定

        參考Samoto等[14]的方法。稱取100 mg大豆11S球蛋白樣品分散于10 mL的去離子水中,磁力攪拌30 min后,12 000×g離心20 min。上清液經(jīng)適度稀釋,采用Lowry法測(cè)定稀釋后的上清液中蛋白質(zhì)的含量,以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)物制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。蛋白質(zhì)的溶解性表示為上清液中蛋白質(zhì)量與樣品中總蛋白質(zhì)量的比值。溶解性按下式計(jì)算:

        1.3.5 FTIR測(cè)定

        參照Zhao Chengbin等[15]的方法。將凍干樣品置于干燥器內(nèi)用P2O5充分干燥,稱取1 mg樣品,與100 mg溴化鉀研磨混勻壓片后進(jìn)行FTIR測(cè)定。在數(shù)據(jù)采集期間,為了減少水蒸汽紅外吸收的干擾,持續(xù)用干燥的N2淋洗測(cè)量室。測(cè)定波數(shù)范圍為4 000~400 cm-1,分辨率為4 cm-1,波數(shù)精度為0.01 cm-1,掃描次數(shù)為64 次,環(huán)境溫度為25 ℃。譜圖處理利用Systat的Peakfit Version 4.12軟件擬合,通過計(jì)算各子峰積分面積得到二級(jí)結(jié)構(gòu)4 種類型的相對(duì)含量。

        1.4 統(tǒng)計(jì)分析

        每個(gè)樣品重復(fù)3 次實(shí)驗(yàn),ANOVA差異顯著性分析利用SPSS V17.0軟件完成,P值小于0.05為顯著性差異,采用Origin 8.0軟件作圖。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 熱處理對(duì)大豆11S球蛋白熱性質(zhì)影響

        表1 熱處理大豆11S球蛋白DSC分析參數(shù)Table 1 DSC characteristics of 11S glycinin before and after heat treatment

        變性溫度(Td)反映蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性,Td越高則熱穩(wěn)定性越好,Td越低則熱穩(wěn)定性越差。熱焓變(ΔH)表征蛋白質(zhì)分子的聚集程度,反映有序結(jié)構(gòu)所占比例[16],ΔH越大說明蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)越緊密、含有的氫鍵數(shù)量越多、構(gòu)象越穩(wěn)定,ΔH越小說明蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)越伸展、含有的氫鍵數(shù)量越少、構(gòu)象越不穩(wěn)定。由表1可知,未經(jīng)熱處理的大豆11S球蛋白的Td為(91.52±0.11) ℃,ΔH為(13.02±0.21) J/g。Zhao Chengbin等[17]采用DSC對(duì)大豆11S球蛋白進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的Td值分布在85~93 ℃范圍內(nèi),這與本研究得到的結(jié)果相似。相對(duì)于未經(jīng)熱處理的大豆11S球蛋白而言,90 ℃熱處理10 min能夠?qū)е碌鞍踪|(zhì)Td和ΔH的降低;在100 ℃熱處理20 min條件下,大豆11S球蛋白的吸熱峰消失,表明蛋白質(zhì)發(fā)生完全變性。造成這種現(xiàn)象的原因可能是由于熱處理降低了蛋白質(zhì)分子間的相互作用,使得蛋白質(zhì)分子發(fā)生一定程度的去折疊展開,分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)在此過程中發(fā)生部分外露,蛋白質(zhì)亞基組分解離[13],從而使DSC檢測(cè)加熱誘導(dǎo)分子展開需要的熱量減少,使Td和ΔH降低,導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生部分或完全變性。

        2.2 熱處理對(duì)大豆11S球蛋白溶解性的影響

        圖1 熱處理對(duì)大豆11S球蛋白溶解性的影響Fig. 1 Effect of heat treatments on the solubility of 11S glycinin

        在一定條件下,對(duì)大豆蛋白進(jìn)行熱處理會(huì)在一定程度上誘導(dǎo)大豆蛋白形成可溶性或不溶性的蛋白聚集體,從而改變大豆蛋白的溶解性。從圖1可以看出,大豆11S球蛋白的溶解性在不同熱處理?xiàng)l件下發(fā)生了一定程度的改變。經(jīng)過80 ℃熱處理后,大豆11S球蛋白的溶解性隨著熱處理時(shí)間的延長而逐漸降低,這與Mori等[18]報(bào)道的一致。經(jīng)90 ℃和100 ℃熱處理后,大豆11S球蛋白的溶解性呈先降低后又小幅度升高的趨勢(shì),且100 ℃熱處理的大豆11S球蛋白溶解性先降低后升高所需的熱處理時(shí)間比90 ℃熱處理時(shí)間短。整體來看,熱處理主要是降低了大豆11S球蛋白的溶解性。

        大豆11S球蛋白經(jīng)熱處理后表現(xiàn)出的變化趨勢(shì)可能是由于熱處理改變了大豆11S球蛋白的空間結(jié)構(gòu)和表面電荷所致。在未經(jīng)熱處理的球蛋白溶液中,蛋白質(zhì)分子呈現(xiàn)出一種卷曲的緊密結(jié)構(gòu),表面被水化膜包圍,具有相對(duì)的穩(wěn)定性。熱處理過程破壞了大豆11S球蛋白分子的天然結(jié)構(gòu),加熱后的蛋白分子結(jié)構(gòu)去折疊展開,使包埋于球蛋白結(jié)構(gòu)內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露出來,相應(yīng)降低了處于球蛋白分子外部親水性基團(tuán)的比例,從而使11S球蛋白溶解性降低[19]。此外,熱處理引起蛋白分子結(jié)構(gòu)的展開也可能會(huì)導(dǎo)致分子表面帶電氨基酸重新排布,使蛋白表面電荷發(fā)生改變,對(duì)親水性/疏水性平衡產(chǎn)生影響,從而導(dǎo)致溶解性降低。然而,當(dāng)溫度接近變性溫度和處理時(shí)間達(dá)到一定值時(shí),蛋白分子已經(jīng)基本上達(dá)到最大化的伸展,再繼續(xù)升高溫度或延長處理時(shí)間會(huì)使蛋白質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)加劇,分子間交聯(lián)機(jī)率增加,伸展開的大豆11S球蛋白分子之間通過疏水相互作用可以結(jié)合形成可溶性聚集體,使蛋白分子的疏水基團(tuán)重新包裹在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部[20]。在90 ℃熱處理超過30 min和100 ℃熱處理超過20 min時(shí),大豆11S球蛋白的溶解性均有一定程度的升高,這可能是形成可溶性聚集體造成的。

        2.3 熱處理大豆11S球蛋白的FTIR分析

        FTIR能夠提供蛋白質(zhì)分子中的氨基基團(tuán)、酰胺I帶、酰胺II帶、酰胺III帶、蛋白質(zhì)環(huán)狀結(jié)構(gòu)中的C—C振動(dòng)和C—O—O糖苷鍵振動(dòng)的波段信息[21]。如圖2所示,其中酰胺I帶(1 600~1 700 cm-1)的譜峰對(duì)于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析最為重要,與蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)之間存在一定的對(duì)應(yīng)關(guān)系[22]。利用波段縮小技術(shù)將FTIR譜圖中的酰胺I帶細(xì)分,得到大豆11S球蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的定性定量信息[23]。不同熱處理?xiàng)l件下大豆11S球蛋白的FTIR譜圖分析依次進(jìn)行基線校正、去卷積處理、二階導(dǎo)數(shù)擬合處理,經(jīng)多次擬合確保擬合殘差最小[24]。如圖3所示,確定擬合圖譜中各子峰與二級(jí)結(jié)構(gòu)類型的對(duì)應(yīng)關(guān)系,通過計(jì)算各子峰積分面積得到二級(jí)結(jié)構(gòu)4 種類型的相對(duì)含量。各子峰與二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)關(guān)系:1 650~1 660 cm-1為α-螺旋,1 610~1 640 cm-1為β-折疊,1 661~1 700 cm-1為β-轉(zhuǎn)角,1 640~1 650 cm-1為無規(guī)卷曲,1 612 cm-1附近的吸收峰為蛋白質(zhì)和多肽的側(cè)鏈吸收[25]。

        圖2 熱處理?xiàng)l件下大豆11S球蛋白FTIR譜圖Fig. 2 FTIR spectra of 11S glycinin under different heat treatment conditions

        圖3 未經(jīng)熱處理大豆11S球蛋白去卷積酰胺I帶二階導(dǎo)數(shù)擬合圖譜Fig. 3 Second-derivative fi tting spectra in the amide I region for unheated 11S glycinin

        2.4 熱處理對(duì)大豆11S球蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

        圖4 熱處理?xiàng)l件下大豆11S球蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量的變化Fig. 4 Changes in secondary structure contents of 11S glycinin under different heat treatment conditions

        如圖4A所示,在80 ℃熱處理?xiàng)l件下,隨熱處理時(shí)間的延長,大豆11S球蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋結(jié)構(gòu)相對(duì)含量逐漸降低,而β-折疊和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)相對(duì)含量逐漸升高,β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)相對(duì)含量變化較小,這表明α-螺旋結(jié)構(gòu)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)棣?折疊和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)。Moriyama等[26]對(duì)熱變性過程中牛血清蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)隨著加熱時(shí)間的延長,蛋白質(zhì)中α-螺旋結(jié)構(gòu)相對(duì)含量逐漸降低,而β-折疊和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)相對(duì)含量逐漸增加,這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。分析原因可能是在加熱過程中11S球蛋白分子相鄰肽鏈之間的氫鍵受到破壞,使蛋白質(zhì)分子內(nèi)α-螺旋結(jié)構(gòu)隨之展開并形成松散的無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)[27],從而使α-螺旋結(jié)構(gòu)相對(duì)含量降低而無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)相對(duì)含量升高。蛋白質(zhì)分子中β-折疊結(jié)構(gòu)是一種相當(dāng)伸展的結(jié)構(gòu),由于氫鍵作用,β-折疊結(jié)構(gòu)易存在于蛋白質(zhì)聚集體的內(nèi)部。熱處理使β-折疊結(jié)構(gòu)相對(duì)含量增加的原因可能是由于11S球蛋白分子內(nèi)部的α-螺旋結(jié)構(gòu)解旋后發(fā)生了分子間的相互作用產(chǎn)生較多的β-折疊結(jié)構(gòu)[28]。與α-螺旋結(jié)構(gòu)相比,β-折疊結(jié)構(gòu)的弱水合作用使其在熱聚集體和網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成過程中具有重要作用,這是由2 種結(jié)構(gòu)中水分子與羰基基團(tuán)相互作用幾何學(xué)分布差異造成的[29]。

        如圖4B、C所示,在90 ℃和100 ℃熱處理?xiàng)l件下,隨熱處理時(shí)間的延長,大豆11S球蛋白中α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)相對(duì)含量逐漸降低,而β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)相對(duì)含量逐漸升高,表明大豆11S球蛋白分子的α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)向β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變。這種結(jié)構(gòu)改變可能與高溫處理?xiàng)l件下大豆11S球蛋白中分子發(fā)生變性有關(guān),發(fā)生變性的蛋白分子內(nèi)部氫鍵遭到破壞,蛋白質(zhì)分子去折疊展開,而α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)主要是以氫鍵為作用力,因此氫鍵的破壞導(dǎo)致二者含量的降低[30]。此外,β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)可能是由更為有序結(jié)構(gòu)單元轉(zhuǎn)化而來,熱聚集體分子間的β-折疊結(jié)構(gòu)也易于轉(zhuǎn)變?yōu)棣?轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)[31],從而導(dǎo)致β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)相對(duì)含量的升高。由此推斷,β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)對(duì)熱聚集體的形成具有重要作用。

        3 結(jié) 論

        熱處理能夠使大豆11S球蛋白Td和ΔH降低,甚至沒有吸熱峰,說明熱處理導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生部分或完全變性。80 ℃熱處理使大豆11S球蛋白的溶解性逐漸降低,這可能是由于熱處理改變了蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)和表面電荷所致。經(jīng)90 ℃和100 ℃熱處理后,11S球蛋白的溶解性呈先降低后升高的趨勢(shì),溶解性的升高可能是形成可溶性聚集體造成的。FTIR分析表明,80 ℃熱處理能夠使大豆11S球蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中的α-螺旋結(jié)構(gòu)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)棣?折疊和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)。90 ℃和100 ℃熱處理使α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)向β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變。二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化可能與熱處理?xiàng)l件下大豆11S球蛋白中分子發(fā)生變性有關(guān),發(fā)生變性的蛋白分子內(nèi)部氫鍵遭到破壞,蛋白質(zhì)分子去折疊展開,從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)內(nèi)二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生相互轉(zhuǎn)變。

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