張曼君，李小敏，張燕鵬,*，齊玉堂，張維農(nóng)，胥 偉

（1.武漢輕工大學食品科學與工程學院，湖北 武漢 430023；2.大宗糧油精深加工教育部重點實驗室，湖北 武漢 430023）

米糠作為水稻加工過程中的主要副產(chǎn)物，含有豐富的膳食纖維、功能性油脂、蛋白質、維生素及礦物質等營養(yǎng)成分，是一種極具開發(fā)潛力的高附加值資源[1]。米糠蛋白在米糠中的質量分數(shù)為12%～16%，具有良好的營養(yǎng)價值，其必需氨基酸組成齊全，氨基酸配比合理平衡，接近于聯(lián)合國糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織推薦模式，并且具有消化率高和低過敏性的優(yōu)點[2-3]。因此米糠蛋白是一種高品質的植物蛋白質資源，特別適合被開發(fā)應用于嬰幼兒和特殊人群營養(yǎng)配方食品中[4]。

米糠蛋白具有良好的功能特性，研究發(fā)現(xiàn)其起泡特性與蛋清蛋白相近[5]，因此可被當作發(fā)泡劑而應用于泡沫類型食品的加工中，如攪打奶油、充氣糖果、慕斯、奶昔、冰淇淋、蛋糕、面包、發(fā)泡酸乳飲料等，從而利用形成的微細泡沫賦予食品體系良好的質構特征與口感，使食品具有質地均勻細膩、潤滑的良好品質[6-7]。已有研究表明，蛋白質的起泡特性不僅取決于本身的結構特征，界面性質、兩親電荷分布及表面疏水性等物化性質[8]，同時也受體系pH值、離子強度以及其他蛋白質競爭性吸附等因素的影響[9]。

目前鮮見有關對米糠蛋白起泡特性的系統(tǒng)研究，因此通過研究分析不同pH值和NaCl濃度體系下米糠蛋白的起泡特性和氣泡的微觀形態(tài)并闡述二者之間的相互關系，對促進米糠蛋白起泡特性的基礎理論研究和構建具有不同質構的米糠蛋白泡沫類食品體系具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米糠蛋白（蛋白質質量分數(shù)84.9%）由實驗室自制；羅丹明B 西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；鹽酸、氫氧化鈉、氯化鈉（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

SorvallRC6Plus型高速冷凍離心機 美國Thermo Scientific公司；FiveEasy實驗pH計 瑞士Mettle Toledo公司；Alpha 1-2 LD plus冷凍干燥機 德國Christ公司；KND-103F自動定氮儀 上海纖檢儀器有限公司；手持式30631型電動打蛋器 日本ECHO公司；FV1200激光共聚焦顯微鏡 日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 米糠蛋白制備

取新鮮米糠用高速粉碎機粉碎后過60 目篩，按料液比1∶5（g/mL）與正己烷混合后在55 ℃條件下反復萃取5 次（殘油含量小于1%）后可獲得脫脂米糠粉。取脫脂米糠粉以料液比1∶10（g/mL）與蒸餾水混合，用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為9.0，在55 ℃條件下攪拌浸提2 h后，25 ℃、10 000 r/min離心15 min獲得上清液。用2 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)上清液的pH值至4.5并靜置2 h，然后20 ℃、8 000 r/min 離心15 min棄去上清液得到蛋白質沉淀。蛋白質用去離子水洗滌3 次后攪拌并調(diào)節(jié)pH值為7.0進行復溶，經(jīng)冷凍干燥后制得米糠蛋白并于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。取部分米糠蛋白樣品使用mico-Kjeldahl法測定蛋白質含量。

1.3.2 米糠蛋白起泡特性測定

參考Zou Yuan[10]和Dhayal[11]等的方法，并作一定修改?？疾靝H值、NaCl質量分數(shù)、pH-NaCl組合條件下對米糠蛋白起泡特性的影響。

pH值：將蛋白質以5 mg/mL的質量濃度分散于蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH值分別為2、4、6、7、8、10、12，然后取30 mL蛋白質溶液于特制帶刻度的試管（直徑4 cm，高10 cm）中，將電動打蛋器深入到溶液中約1 cm處，攪拌15 s后，立即測量泡沫體積V0，靜置2 h后再次測定體積Vt。按公式（1）和（2）計算蛋白質的起泡能力及泡沫穩(wěn)定性：

NaCl質量分數(shù)：將蛋白質以5 mg/mL的質量濃度分散于蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH值為7，添加質量分數(shù)分別為0%、0.25%、0.5%、1%、2% NaCl，然后起泡并按公式（1）和（2）計算起泡能力及泡沫穩(wěn)定性。

pH-NaCl組合：根據(jù)對單因素條件下起泡能力及泡沫穩(wěn)定性的分析，選取不同pH值、NaCl組合測定起泡特性。將蛋白質以5 mg/mL分散于蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH值分別為2、4、7、12，再添加質量分數(shù)分別為0%、0.25%、1% NaCl，然后起泡并按公式（1）和（2）計算起泡能力及泡沫穩(wěn)定性。

1.3.3 泡沫微觀形態(tài)分析

參考Sadahira[12]和Yang Xin[13]等的方法并稍作修改。取29.5 mL配制好的蛋白質溶液，添加0.5 mL羅丹明B染液（1 mg/mL）使蛋白質溶液質量濃度為5 mg/mL，采用1.3.2節(jié)方法進行起泡實驗，起泡結束后立刻取樣于凹型載玻片，蓋上載玻片后在Olympus激光共聚焦顯微鏡觀察泡沫的微觀形態(tài)并進行分析。激發(fā)波長為543 nm，放大倍數(shù)為100 倍。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實驗均重復3 次后求平均值，采用Origin 8.5和SPSS分析軟件對實驗數(shù)據(jù)進行處理分析；通過采用Image Pro Plus圖片分析軟件對激光共聚焦圖片進行處理分析。

2 結果與分析

2.1 pH值對米糠蛋白起泡特性的影響

如圖1所示，當pH值為4時，米糠蛋白溶液的起泡能力最差（20±0）%，但具有較好的泡沫穩(wěn)定性（88.3±7.3）%，這可能是因為在等電點附近時蛋白質的溶解性較低，可溶性蛋白減少[14]，沉降蛋白質較多，從而沒有足夠的蛋白質吸附到界面[15]，使起泡能力降低。同時在等電點附近由于缺乏相互排斥作用，這有利于氣-液界面上蛋白質之間的相互作用[16]，形成多層蛋白分子網(wǎng)絡結構而增加界面膜的黏度[17-18]，從而有利于泡沫穩(wěn)定性的提高。當pH值偏離米糠蛋白的等電點時，起泡能力會增加而泡沫穩(wěn)定性有所下降，尤其當溶液的pH值為12時起泡能力增加最為顯著。這是因為當溶液的pH值偏離等電點時，蛋白質分子內(nèi)的可解離基團發(fā)生解離，增加蛋白質所帶凈電荷量，導致分子間和分子內(nèi)的靜電排斥力增加，削弱了分子內(nèi)的疏水相互作用[19-20]，使得蛋白質分子膨脹展開，柔性增加，從而有利于更快地吸附至界面而增強起泡能力[21-22]，但此時蛋白質分子在界面由于靜電力的排斥相互作用，而使米糠蛋白無法形成較為緊密的界面膜，降低界面膜的黏彈性和機械性能而使泡沫穩(wěn)定性變差[23-24]。

圖1 pH值對米糠蛋白起泡特性的影響Fig. 1 Effect of pH on foaming properties of rice bran protein

2.2 NaCl質量分數(shù)對米糠蛋白起泡特性的影響

圖2 NaCl質量分數(shù)對米糠蛋白起泡特性的影響Fig. 2 Effect of NaCl concentration on foaming properties of rice bran protein

如圖2所示，NaCl質量分數(shù)的增加有利于提高米糠蛋白的起泡能力和泡沫穩(wěn)定性，特別是當pH 7、NaCl質量分數(shù)為1%時米糠蛋白的起泡能力與泡沫穩(wěn)定性均可達到較大值，分別為（90.0±5.8）%和（84.6±0）%，這表明此時米糠蛋白的分子結構與理化特性保持了較好的平衡狀態(tài)，以保證可同時具有較好的起泡能力和泡沫穩(wěn)定性。已有研究發(fā)現(xiàn)，NaCl可通過非特異性的靜電作用與蛋白質分子發(fā)生相互作用而改變其所帶凈電荷量，并影響蛋白質分子的展開和聚集狀態(tài)及水合作用[25]。因此當離子濃度較低時，由于“鹽溶”效應使蛋白質的溶解度增加從而使起泡能力提高[26]；當離子濃度過高時，會影響蛋白質分子的水合作用而可能使部分蛋白質分子發(fā)生聚集，從而使起泡能力有所降低[27]。同時由于鹽離子對蛋白質分子電荷的中和作用，有利于加速蛋白質分子在膜界面的吸附及擴散[28]，并使其在界面的靜電排斥作用減弱，分子間的相互作用增強而易于形成黏彈性和機械性質較好的界面膜，從而有利于泡沫穩(wěn)定性的增強[29]。

2.3 pH-NaCl組合條件下米糠蛋白的起泡特性

圖3 pH-NaCl組合對米糠蛋白起泡能力（A）和泡沫穩(wěn)定性（B）的影響Fig. 3 Effect of pH and NaCl combinations on foaming capacity (A)and foam stability (B) of rice bran protein

由圖3A可知，在不同pH值條件下添加NaCl后均對米糠蛋白的起泡能力有所改善，其中當pH值分別為2、4、7時米糠蛋白的起泡能力隨著NaCl質量分數(shù)的增加而升高，并且當NaCl添加量為1%時，起泡能力改善最為顯著；而在pH值為12，NaCl質量分數(shù)為0.25%時米糠蛋白的起泡性達到最大值（196.7±5.8）%。如圖3B所示，只有當米糠蛋白溶液的pH值為7時，添加NaCl可提高米糠蛋白的泡沫穩(wěn)定性，而當pH值為2、4和12時，NaCl的添加泡沫穩(wěn)定性無顯著改善，甚至會降低米糠蛋白的泡沫穩(wěn)定性，這也說明與NaCl相比，pH值對米糠蛋白泡沫穩(wěn)定性的改善更為顯著。

2.4 泡沫微觀形態(tài)分析

通過采用激光共聚焦顯微鏡觀察分析氣泡的大小與數(shù)量等幾何動態(tài)變化特性，可一定程度上從微觀的角度反映米糠蛋白的起泡特性[13,30]，因此根據(jù)上述實驗結果，選取pH值分別為2、4、7、12與NaCl質量分數(shù)分別為0%和1%的組合條件下的米糠蛋白泡沫進行微觀形態(tài)的觀察。

圖4 激光共聚焦顯微掃描圖片F(xiàn)ig. 4 Confocal laser scanning microscope (CLSM) images

如圖4所示，隨著時間的延長，氣泡的數(shù)量由于空氣的擴散瀝水、凝集及歧化等反應而減少[31]，進一步對起泡初始階段的氣泡直徑分布頻率直方圖（圖5）分析可知，在不添加NaCl的情況下，與其他pH值相比，米糠蛋白溶液的pH值為4時氣泡直徑的分布范圍較窄也較為均勻，因此可以避免由于小氣泡中的氣壓小于大氣泡而發(fā)生歧化反應，這在一定程度上有利于泡沫的穩(wěn)定性[12]；相比當米糠蛋白溶液pH值為2時，因所形成的泡沫中含有較多直徑較大的氣泡，則易發(fā)生歧化反應，因此泡沫穩(wěn)定性較差（圖1）[13,30]。另外由圖4可知，當pH值為4時，米糠蛋白在連續(xù)相中的分布并不均勻，傾向于在氣泡表面聚集，這就易于形成較為黏稠的界面膜，從而有利于泡沫的穩(wěn)定性[23]。當米糠蛋白溶液中添加一定量的NaCl時，由圖5可知，在pH值為2的情況下，起始階段氣泡的平均直徑（d32）顯著減小，但隨著時間的延長氣泡發(fā)生了明顯的歧化和凝聚反應，這說明NaCl的添加可能屏蔽了蛋白質表面部分正電荷而有利于加速米糠蛋白在氣-液界面的吸附和擴散以改善起泡能力[9]，但并不利于泡沫穩(wěn)定性。在其他pH值條件下添加NaCl后氣泡平均直徑（d32）則均有一定程度的升高。

圖5 CLSM圖片初始時刻（0 min）氣泡直徑分布頻率直方圖Fig. 5 Histograms of distribution frequency of bubble diameter in CLSM images (0 min)

為了進一步說明不同反應體系下米糠蛋白起泡特性和氣泡的微觀形態(tài)，對氣泡的平均面積與數(shù)量隨時間的變化規(guī)律進行分析，如圖6所示。與未添加NaCl的米糠蛋白溶液相比，添加NaCl后當pH值為2和4時，初始階段氣泡平均面積相差不大，但氣泡的數(shù)量增加明顯；而當pH值為7和12時，初始階段氣泡數(shù)量相差不大，但氣泡的平均面積增加，因此這二者的綜合效應從宏觀上表現(xiàn)為NaCl的添加可改善米糠蛋白的起泡能力（圖3A）。另外結合氣泡數(shù)量的變化速率分析可知，在30 min內(nèi)，在pH 2、4和12條件下添加NaCl后米糠蛋白的起泡數(shù)量減少的速率明顯增加，這表明NaCl的加入對泡沫的穩(wěn)定性沒有明顯改善作用（圖4），而對于在pH值為7的情況下，添加NaCl后在前10 min內(nèi)氣泡數(shù)量降低的速率較高，然后速率有所降低，同時30 min后與未添加NaCl的米糠蛋白溶液相比，氣泡的平均面積較大，因此雖然氣泡的數(shù)量較少，但在宏觀形態(tài)上與對照樣品相比，泡沫體積的穩(wěn)定性并未降低（起泡30 min后二者的泡沫穩(wěn)定性分別為pH 7、0% NaCl：（89.4±4.1）%和pH 7、1% NaCl：（91.7±1.8）%）。因此基于對米糠蛋白泡沫的微觀形態(tài)的動態(tài)分析說明，在利用蛋白質泡沫改善食品品質時一方面要考慮泡沫的穩(wěn)定性，同時也要考慮到氣泡的微觀形態(tài)，以便制備出具有符合最佳感官體驗的產(chǎn)品[32]。

圖6 氣泡平均面積和氣泡數(shù)量隨觀察時間變化Fig. 6 Changes in mean bubble area and bubble count per area in CLSM images from 0 to 30 min

3 結 論

通過單因素試驗分析pH值和NaCl質量分數(shù)對米糠蛋白起泡特性的影響。研究發(fā)現(xiàn)當pH值為4時，米糠蛋白的泡沫穩(wěn)定性可達最大值（88.3±7.3）%，而當溶液pH值偏離4時，泡沫穩(wěn)定性降低但起泡能力增加，在pH 2和12條件下起泡能力可分別提高至（98.3±4.4）%和（168.9±10.2）%。另外在pH 7條件下添加1%的NaCl后，米糠蛋白的起泡能力和泡沫穩(wěn)定性可分別提高至（90.0±5.8）%和（84.6±0）%。

在單因素試驗的基礎研究不同pH值和NaCl質量分數(shù)組合條件下米糠蛋白起泡特性。研究結果表明，在pH 2、4、7和12條件下，添加NaCl均可顯著提高米糠蛋白溶液的起泡能力，但僅在pH值為7的情況下添加NaCl可改善泡沫穩(wěn)定性。

通過對不同環(huán)境因素條件下米糠蛋白泡沫微觀形態(tài)進行分析發(fā)現(xiàn)，起始階段泡沫直徑的大小和分布均可影響泡沫體系的歧化反應進而影響米糠蛋白溶液的起泡能力與泡沫穩(wěn)定性；另外通過對氣泡平均面積與數(shù)量隨時間的變化規(guī)律分析可知，米糠蛋白溶液的宏觀泡沫穩(wěn)定性與二者的綜合效應有關。因此在實際應用中可通過對環(huán)境因素的調(diào)控來控制起泡的微觀形態(tài)以滿足產(chǎn)品的品質要求。