趙文達(dá)，楊曉鵬，孫銘，張成林，伍文丹，馬 嘯，張新全

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院草業(yè)科學(xué)系，四川 成都 611130)

扁穗雀麥(Bromuscatharticus)為禾本科雀麥屬一年生或越年生草本植物，又名野麥子[1]。最早于20世紀(jì)90年代末引入我國，在內(nèi)蒙古、新疆、甘肅等地表現(xiàn)為一年生，在我國西南和華中地區(qū)表現(xiàn)為越年生[2]。扁穗雀麥再生性和分蘗能力較強(qiáng)，產(chǎn)草量略低于多花黑麥草(Loliummultiflorum)，且具有一定的抗旱性，幼嫩時莖葉有軟毛，成熟時毛漸少，適口性僅次于黑麥草(Loliumperenne)和燕麥(Avenasativa)等。種子成熟后，莖葉仍為綠色，可保持較高的營養(yǎng)價值，其鮮草中家畜所需的必需氨基酸較豐富，賴氨酸含量較高，是解決我國冬春飼草缺乏的優(yōu)良牧草[2]。

水分在植物的生命活動中起著重要的作用，許多植物在經(jīng)受干旱逆境后各項生理指標(biāo)均會受到一定的影響。植物苗期對水分的虧缺相當(dāng)敏感，在干旱環(huán)境下，植物的幼苗易出現(xiàn)死亡情況，對植物生長和生物量的形成均有一定影響[3]。在牧草的生長發(fā)育過程中同樣存在這種問題，所以水分也是制約牧草生物產(chǎn)量的重要因素[4]。扁穗雀麥起源于南美洲潘帕斯草原，喜溫暖濕潤氣候，具有一定的抗旱性，草產(chǎn)量較高，常做短期牧草種植，但在其在我國的適種地區(qū)如西南、華中地區(qū)為亞熱帶季風(fēng)氣候，冬春季節(jié)較為干旱，可能會影響扁穗雀麥出苗和生長，并進(jìn)一步影響到牧草總產(chǎn)量。

目前，國內(nèi)外關(guān)于植物抗旱性特征的研究常通過測定干旱脅迫下植物的含水量、根冠比、干物質(zhì)、株高等形態(tài)和生理指標(biāo)，探究形態(tài)和生理指標(biāo)的變化與其抗性之間的關(guān)系[5-7]。因此，本研究在前期篩選出20% PEG-6000的模擬干旱濃度下，對處于苗期生長的不同扁穗雀麥種質(zhì)連續(xù)72 h干旱脅迫后，比較不同種質(zhì)的葉片相對含水量(RWC)、相對電導(dǎo)率(REC)、丙二醛(MDA)含量、過氧化物酶活性(POD)、游離脯氨酸(Fpro)含量5項生理生化指標(biāo)的變化，綜合評價比較扁穗雀麥種質(zhì)的苗期抗旱性，對抗旱種質(zhì)的引種篩選和品種選育提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試21份扁穗雀麥種質(zhì)資源，具體來源描述如表1所列。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計

將培養(yǎng)皿放置于90 ℃下消毒5 h，扁穗雀麥種子用HgCl2消毒[8]。將消毒后的21份扁穗雀麥種質(zhì)分別各取50粒種子進(jìn)行培育，將培養(yǎng)皿放置于25℃的培養(yǎng)箱中，每天澆水一次。發(fā)芽出苗后待供試材料長至2～3片真葉時，將其移至錐形瓶。每個錐形瓶中放置5株材料，每份材料設(shè)置3個對照組，3個試驗(yàn)組，添加營養(yǎng)液進(jìn)行12 h光照、12 h黑暗交替培養(yǎng)。待供試扁穗雀麥幼苗長至3～4片真葉時，取部分植株進(jìn)行脅迫處理。脅迫處理采用PEG-6000溶于培養(yǎng)液，質(zhì)量濃度為20%，對照組繼續(xù)添加營養(yǎng)液，脅迫處理72 h后，抽取一部分植株進(jìn)行生理生化指標(biāo)測定[9]。每個指標(biāo)設(shè)置對照和處理，進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)。

1.3 測定項目與方法

在脅迫處理和對照處理上各取4片展開葉，用蒸餾水沖洗葉片表面污物，并用吸水紙吸干葉片表面水分，進(jìn)行生理指標(biāo)測試。其中，葉片相對含水量采用飽和稱重法測定；相對電導(dǎo)率采用電導(dǎo)率法測定；丙二醛含量采用硫代巴比妥酸法測定；過氧化物酶活性采用愈創(chuàng)木酚法測定[10]；游離脯氨酸采用茚三酮法測定[11]。

1.4 數(shù)據(jù)分析與處理

各指標(biāo)的抗旱系數(shù)[12]和隸屬函數(shù)值[13]分別按照式(1)和式(2)進(jìn)行計算：

指標(biāo)性狀的抗旱系數(shù)=干旱脅迫下性狀指標(biāo)值/空白對照性狀指標(biāo)值;

(1)

μ(x)=(X-Xmin)/(Xmax-Xmin) 。

(2)

式(2)中：μ(x)為種質(zhì)材料性狀抗旱系數(shù)的隸屬函數(shù)值，若指標(biāo)與抗旱性呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，則用1-μ(x)表示；X表示某一指標(biāo)的抗旱系數(shù)，Xmax和Xmin分別表示此種質(zhì)某一指標(biāo)抗旱系數(shù)的最大與最小值；且相對含水量、過氧化物酶活性和游離脯氨酸含量為正向指標(biāo)，相對電導(dǎo)率和丙二醛含量為負(fù)向指標(biāo)。

使用SPSS 20.0對抗旱系數(shù)等數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析、多重比較、主成分分析、權(quán)重計算、抗旱性度量值計算和相關(guān)性分析。其中，方差分析和多重比較用來測試某一控制變量的不同水平是否給觀察變量帶來顯著差異，即測定供試種質(zhì)的各指標(biāo)抗旱系數(shù)的差異顯著性。主成分分析用來減少數(shù)據(jù)集的維數(shù)，同時保持?jǐn)?shù)據(jù)集中的對方差貢獻(xiàn)最大的特征。權(quán)重是指某指標(biāo)在整體評價中的相對重要程度。權(quán)重越大則該指標(biāo)的重要性越高，對整體的影響就越高。在試驗(yàn)過程中以主成分分析中第一主成分的指標(biāo)特征值(取絕對值)為權(quán)重進(jìn)行計算?？购敌远攘恐凳怯酶髦笜?biāo)性狀的隸屬函數(shù)值與權(quán)重相乘后相加得到，能全面地比較供試材料的抗旱性。對兩個或多個具備相關(guān)性的指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，從而衡量兩個指標(biāo)間的相關(guān)密切程度。

2 結(jié)果與分析

2.1 各性狀抗旱系數(shù)差異性分析

在干旱脅迫處理72 h后，測定供試材料的5個生理指標(biāo)(表2)。供試材料基于同一指標(biāo)的抗旱系數(shù)存在較明顯的變異，其中相對電導(dǎo)率與游離脯氨酸含量的抗旱系數(shù)變幅較大，其變異系數(shù)分別達(dá)到48.96%和42.61%，表明相對電導(dǎo)率與游離脯氨酸含量對干旱脅迫的敏感性在不同種質(zhì)間變異很高。同一材料不同指標(biāo)的抗旱系數(shù)也呈現(xiàn)出較大的差異，如種質(zhì)PI595114各指標(biāo)抗旱系數(shù)變幅為0.940 9～25.285 1，種質(zhì)PI217583各指標(biāo)抗旱系數(shù)變幅為0.931 4～4.964 7，表明不同指標(biāo)對干旱脅迫的敏感性差異較大。對比干旱脅迫前后的各生理指標(biāo)變化發(fā)現(xiàn)，相對電導(dǎo)率、丙二醛含量、過氧化物酶活性和游離脯氨酸含量總體呈上升趨勢，相對含水量總體呈下降趨勢。

2.2 主成分分析

對多個指標(biāo)性狀進(jìn)行主成分分析，結(jié)果如表3所列。前3個主成分的特征值累計貢獻(xiàn)率達(dá)到了74.454%，可認(rèn)為其具有較強(qiáng)的信息代表性，提取的3個主成分基本上代表了5個原始指標(biāo)的絕大部分信息[14-15]。主成分1占據(jù)了原始數(shù)據(jù)信息的29.623%，且特征值較高，為1.481 1。主成分2與主成分3分別占原始數(shù)據(jù)信息量的24.389%和20.442%，特征值分別為1.219 4與1.022 0。在主成分1中起決定貢獻(xiàn)率大小的因素主要是相對含水量、相對電導(dǎo)率，即相對含水量、相對電導(dǎo)率的抗旱系數(shù)越大，主成分1的的貢獻(xiàn)率越高；主成分2中決定貢獻(xiàn)率大小的為相對含水量、相對電導(dǎo)率、過氧化物酶活性、丙二醛含量的抗旱系數(shù)，主成分3中主要由丙二醛含量、相對含水量抗旱系數(shù)起決定作用。

2.3 各性狀隸屬函數(shù)值及抗旱性度量值

在計算抗旱性度量值之前，首先要計算各指標(biāo)權(quán)重[16]。在主成分分析中，主成分1占據(jù)了原始數(shù)據(jù)信息的29.623%，因此，可以將主成分1中各性狀的特征向量作為權(quán)重進(jìn)行計算。利用公式(2)計算21份種質(zhì)各性狀抗旱系數(shù)的隸屬函數(shù)(表4)，5種指標(biāo)抗旱隸屬函數(shù)值的變異系數(shù)都超過了10%，其中相對電導(dǎo)率、POD活性抗旱隸屬函數(shù)值的變異系數(shù)超過了18%。將主成分1各抗旱系數(shù)的特征值占總特征值比例作為權(quán)重與對應(yīng)的隸屬函數(shù)值相乘，然后對不同種質(zhì)分別進(jìn)行乘積的求和，即可得到21份種質(zhì)的抗旱性度量值(表4)。種質(zhì)的抗旱性度量值越大，抗旱能力越強(qiáng)，反之則越弱。在21份種質(zhì)中，抗旱性度量值的變異系數(shù)達(dá)到了83.53%，PI442076抗旱性度量值最高，因此抗旱能力最強(qiáng)；PI292258抗旱性度量值最弱。

表2 21份扁穗雀麥種質(zhì)各生理指標(biāo)的抗旱系數(shù)Table 2 Drought resistance coefficients of 5 physiological indices of the 21 Bromus catharticus germplasms

同列不同字母表示不同種質(zhì)間差異顯著(P<0.05)。

Different lowercase letters within the same column indicate significant difference between different germplasms at the 0.05 level.

表3 21份扁穗雀麥種質(zhì)資源指標(biāo)的抗旱系數(shù)主成分分析Table 3 Principal component analysis of drought tolerance coefficients of the 21 Bromus catharticus germplasms

*表示某指標(biāo)在各主成分中的最大絕對值。

* means the highest absolute value of each index in all factors.

表4 21份扁穗雀麥種質(zhì)的抗旱系數(shù)隸屬函數(shù)值和抗旱性度量值Table 4 The subordinate function values and drought-resistance values of Bromus catharticus germplasms

21份扁穗雀麥種質(zhì)不同指標(biāo)抗旱系數(shù)和抗旱性度量值之間的相關(guān)性大小(表5)表現(xiàn)為，游離脯氨酸含量>相對電導(dǎo)率>過氧化物酶活性>相對含水量>丙二醛含量，其中相對電導(dǎo)率的抗旱系數(shù)與抗旱性度量值呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.551，P<0.01)，游離脯氨酸含量的抗旱系數(shù)與抗旱性度量值呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(r=0.572,P<0.01)，而過氧化物酶活性、丙二醛含量、相對含水量的抗旱系數(shù)與抗旱性度量值之間無顯著相關(guān)性。

2.4 聚類分析

為進(jìn)一步分析不同扁穗雀麥種質(zhì)的抗旱性優(yōu)劣，對21份材料的抗旱性度量值進(jìn)行聚類分析，將其分成不同耐旱型(圖1)。在歐式距離閾值為0.045時，可將21份扁穗雀麥種質(zhì)劃分為4類抗旱能力不同的群組：Ⅰ類包括江夏及抗旱性度量值最高的PI442076等4份種質(zhì)；Ⅱ類包括黔南等5份種質(zhì)；Ⅲ類包括3份種質(zhì)；Ⅳ類包括抗旱性度量值最小的PI292258等9份種質(zhì)。由各種質(zhì)的抗旱性度量值可以確定4類材料總體抗旱性強(qiáng)弱排序?yàn)棰?Ⅱ>Ⅲ>Ⅳ，Ⅰ類抗旱性最強(qiáng)，各測定指標(biāo)表現(xiàn)優(yōu)異，4份種質(zhì)表現(xiàn)出優(yōu)秀的抗旱能力；Ⅳ類抗旱性弱，各測定指標(biāo)表現(xiàn)較差。

同時，對分成的4個抗旱型群組進(jìn)行單因素方差分析(表6)，發(fā)現(xiàn)游離脯氨酸含量與相對電導(dǎo)率的隸屬函數(shù)值顯著差異(P<0.05)，相對含水量的隸屬函數(shù)值表現(xiàn)出極顯著差異(P<0.01)；丙二醛含量、過氧化物酶活性的隸屬函數(shù)值差異不顯著(P>0.05)；平均隸屬函數(shù)值與抗旱性度量值均表現(xiàn)極顯著差異(P<0.01)。

表5 抗旱系數(shù)和抗旱性度量值的相關(guān)性分析Table 5 Correlation analysis between drought tolerance coefficients of the 5 indices and drought-resistance values

*,P<0.05; **,P<0.01.

圖1 扁穗雀麥抗旱性度量值聚類分析Fig. 1 Clustering dendrogram of the 21 Bromus catharticus germplasms based on drought-resistance value

3 討論與結(jié)論

干旱脅迫對植物的影響表現(xiàn)在多個方面，對于脅迫造成的壓力，生理代謝迅速做出調(diào)整以保證植物細(xì)胞能進(jìn)行正常的生理活動[17]。在這個過程中滲透調(diào)節(jié)是植物抵抗干旱的主要方式，干旱環(huán)境下，植物體內(nèi)的水分減少，糖、氨基酸和無機(jī)離子等溶質(zhì)不斷積累，植物滲透勢降低，從而吸收水分，保持基本的生理活動。因此，測定在干旱脅迫下植物的相對含水量、相對電導(dǎo)率、丙二醛含量、過氧化物酶活性、游離脯氨酸含量等指標(biāo)，可有效評價植物苗期的抗旱能力。

當(dāng)在干旱脅迫下，牧草的生存和形成生物產(chǎn)量的能力下降，不同品種對干旱脅迫呈現(xiàn)出不同的抗性[18]。相對含水量降低的幅度愈小，牧草的抗旱能力就愈強(qiáng)，如多花黑麥草表現(xiàn)出抗旱性與相對含水量呈正相關(guān)關(guān)系[19]；而植物的相對電導(dǎo)率會隨著質(zhì)膜的選擇透性被破壞呈上升趨勢，與植物的抗旱能力呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。此外，植物體內(nèi)因干旱產(chǎn)生的丙二醛會導(dǎo)致植物細(xì)胞膜的損傷加劇，使細(xì)胞膜脂過氧化作用變強(qiáng)。因此，丙二醛含量增幅越高，植物的抗旱能力越弱[20]。過氧化物酶是一種保護(hù)性酶，對環(huán)境較為敏感，能夠清除植物體內(nèi)的活性氧，多數(shù)研究表明，在植物遭受逆境脅迫時，其體內(nèi)的過氧化物酶活性會有所上漲[21]。游離脯氨酸除了作為植物細(xì)胞質(zhì)內(nèi)調(diào)節(jié)滲透外，還在穩(wěn)定大分子結(jié)構(gòu)、降低細(xì)胞酸性等方面其重要的作用，當(dāng)植物受到干旱脅迫時，游離脯氨酸的含量會呈現(xiàn)增加趨勢[22]。本研究通過對脅迫下和非脅迫下扁穗雀麥種質(zhì)資源的相對含水量、相對電導(dǎo)率、丙二醛含量、過氧化物酶活性、游離脯氨酸含量的研究發(fā)現(xiàn)，脅迫處理后相對含水量呈現(xiàn)下降趨勢，相對電導(dǎo)率、丙二醛含量、過氧化物酶活性、游離脯氨酸含量表現(xiàn)出上升趨勢，與上述結(jié)論基本相符合。因此可以推斷扁穗雀麥通過調(diào)節(jié)體內(nèi)的一些生理活動如降低葉片含水量，增強(qiáng)酶活性來抵御水分脅迫對其帶來的不良影響[23]。

表6 扁穗雀麥種質(zhì)4個類組的各觀測指標(biāo)隸屬函數(shù)值的方差分析Table 6 Multiple comparisons of the subordinate function values of 4 clusters of Bromus catharticus germplasms

不同小寫字母和大寫字母表示相同指標(biāo)不同類組間差異顯著和極顯著(P<0.05和P<0.05);ns,表示差異不顯著。

Different lowercase and capital letters indicate significant difference between different groups in the same parameter at 0.05 and 0.01 levels, respectively; **,P<0.01; *,P<0.05; ns, not significant.

植物抗旱性受多個基因的控制，是多個指標(biāo)相互表達(dá)而呈現(xiàn)出的綜合性狀[24]。因此，單因素或單個性狀分析并不能有效分析出21份扁穗雀麥種質(zhì)的抗旱性強(qiáng)弱，需要綜合多個性狀，使單性狀分析抗旱性的片面性得到有效的補(bǔ)充，盡可能準(zhǔn)確的接近實(shí)際情況[25]。本研究通過測定多項生理指標(biāo)并結(jié)合隸屬函數(shù)分析及聚類分析，以抗旱性度量值來直觀定量表示其抗旱性強(qiáng)弱，并劃分了不同的抗旱型分組以對多個供試種質(zhì)進(jìn)行組群劃分。

綜上所述，供試21份扁穗雀麥種質(zhì)資源經(jīng)苗期模擬干旱脅迫，各項生理生化指標(biāo)都存在明顯差異。根據(jù)其抗旱性度量值，可將其分為4類不同的抗旱型，且抗旱性強(qiáng)弱順序?yàn)棰耦?Ⅱ類>Ⅲ類>Ⅳ類。材料PI442076的苗期抗旱性最強(qiáng)，材料PI292258的苗期抗旱性最弱，這為今后抗旱性品種選育及抗旱性分子機(jī)理研究提供了重要供試材料。