薛夢瑩，李 璐，張華峰，劉紫祺

(1.陜西師范大學西北瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實驗室 中俄食品與健康科學國際聯(lián)合研究中心 食品工程與營養(yǎng)科學學院，陜西 西安 710119； 2.西北農(nóng)林科技大學生命科學學院，陜西 楊凌 712100)

小檗科(Berberidaceae)南天竹(Nandinadomestica)、綠葉小檗(Berberisthunbergii)和紅葉小檗(B.thunbergiivar.atropurpurea)是重要的園林綠化植物，具有優(yōu)良的生態(tài)性和獨特的觀賞性[1-6]。近年來的研究表明，這3種小檗科植物的化學成分具有一定的藥用開發(fā)價值[3-5]。體外自由基清除試驗發(fā)現(xiàn)，南天竹、綠葉小檗和紅葉小檗的多糖具有一定的抗氧化活性[1]；綠葉小檗甘油提取物和乙醇提取物能夠抑制化膿性鏈球菌(Streptococcuspyogenes)等的生長[7]；紅葉小檗的紅色素能夠抑制枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、大腸桿菌(Escherichiacoli)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的生長[8]；南天竹精油能夠抑制銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和金黃色葡萄球菌的生長[9]。研究南天竹、綠葉小檗和紅葉小檗的化學成分與功能，對于小檗科植物資源的科學開發(fā)和綜合利用具有一定的參考作用。

小檗科植物共有17個屬[1]。大量研究表明，小檗科植物類黃酮和生物堿往往具有較強的抑菌活性[10-11]。小檗科小檗屬具芒小檗(B.aristata)的蘆丁(rutin)、槲皮素(quercetin)等類黃酮能夠抑制多種病原微生物的生長[10,12]；小檗屬異果小檗(B.heteropoda)、伊犁小檗(B.iliensis)、針刺小檗(B.iberica)、喀什小檗(B.kaschgarica)和黃蘆木(Berberisamurensis)的小檗堿(berberine)對食源性致病菌具有顯著的抑制作用[13-14]；淫羊藿屬(Epimedium)朝鮮淫羊藿(E.koreanum)的生物堿能夠抑制大腸桿菌對數(shù)期的繁殖生長，嚴重破壞菌體表面，使菌體之間相互聚團、粘連[2]；十大功勞屬(Mahonia)冬青葉十大功勞(M.aquifolium)的藥根堿(jatrorrhizine)能夠抑制絮狀表皮癬菌(Epidermophytonfloccosum)和痤瘡丙酸桿菌(Propionibacteriumacnes)的生長[15]。但是，迄今鮮見有關(guān)南天竹、綠葉小檗、紅葉小檗生物堿和類黃酮抑菌作用的研究報道。

研究南天竹、綠葉小檗、紅葉小檗生物堿和類黃酮的抑菌作用，分析季節(jié)對類黃酮、生物堿含量與抑菌活性的效應，可能具有以下應用前景：1)有助于開發(fā)類黃酮、生物堿抑菌劑或防腐劑，服務醫(yī)藥、食品或飼料工業(yè)；2)有助于充分利用疏苗、修剪得到的廢棄葉片資源，增加科技附加值；3)有助于拓展3種小檗科植物的應用范圍，延長產(chǎn)業(yè)鏈。同傳統(tǒng)中草藥相比，3種小檗科植物是常見的園林綠化植物，易于規(guī)?；N植，資源豐富，成本較低。鑒于此，本研究分析了不同季節(jié)南天竹、綠葉小檗、紅葉小檗生物堿和類黃酮的含量，探討了生物堿、類黃酮含量季節(jié)變化的可能原因，研究了3種小檗科植物生物堿和類黃酮的抑菌活性及其季節(jié)變化規(guī)律，以期促進小檗科植物生物堿、類黃酮成分的開發(fā)利用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

不同季節(jié)的南天竹、綠葉小檗、紅葉小檗葉片2015年采自陜西省西安市。季節(jié)劃分參考繆啟龍和王勇[16]的方法。葉片采摘后用蒸餾水漂洗，而后置通風處陰干，粉碎，過篩(180±7.6)μm，在4 ℃冰箱中密封冷藏，備用。大腸桿菌(菌種代號：ATCC25922)購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)(純度≥99%)、氨芐青霉素鈉(ampicillin sodium salt)(USP級)、槲皮素(純度≥95%)、小檗堿(純度≥95%)購自上海源葉公司；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(pH為7.2～7.4)、瓊脂購自北京奧博星公司；三氯化鋁、堿式硝酸鉍、乙醇等均為國產(chǎn)試劑(分析純)。

1.2 類黃酮的制備、鑒定與定量分析

稱取1.0 g葉片粉末，加入40 mL 60%(V∶V)乙醇，浸泡30 min后，85 ℃加熱回流3 h。過濾去除殘渣，將濾液濃縮至稠膏狀，凍干后得到類黃酮提取物[17]。參照文獻[18]方法進行純化和定性、定量分析。每個試驗重復3次。

1.3 生物堿的制備、鑒定與定量分析

參照郝淼等[19]的方法分離、純化生物堿。采用碘化鉍鉀顯色法鑒定生物堿[20]。采用紫外分光光度法定量分析生物堿[19]。每個試驗重復3次。

1.4 抑菌活性分析

1.4.1菌株活化與菌懸液制備 將供試菌接種在斜面培養(yǎng)基上，在37 ℃活化24 h。然后接種于100 mL液體培養(yǎng)基中，在37 ℃振蕩培養(yǎng)18 h(振蕩速度110 r·min-1)，制得活化菌懸液，用液體培養(yǎng)基稀釋到106～107 cfu·mL-1備用。

1.4.2最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)測定 采用經(jīng)典的二倍稀釋法考察不同樣品對大腸桿菌的最小抑菌濃度[21]。取9支事先滅菌的試管，依次編號為A、B、C、D、E、F、G、H、I。在A試管中先加入2 mL的液體培養(yǎng)基，再加入2 mL的樣品溶液(100 mg·mL-1)，混勻后吸取2 mL混合溶液，加入B試管，再向B試管中加入等體積的液體培養(yǎng)基后混勻，以此類推使樣品溶液不斷稀釋，直至G試管。在H試管中僅加入液體培養(yǎng)基(不加入樣品溶液)，作為陰性對照。在I試管中加入液體培養(yǎng)基和氨芐青霉素鈉，作為陽性對照。分別向A～I試管中加入400 μL菌懸液，在37 ℃振蕩培養(yǎng)18 h(振蕩速度110 r·min-1)。用TTC染色法評判大腸桿菌的生長情況[22]。每個試驗重復3次。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel軟件錄入試驗數(shù)據(jù)，使用Microsoft Word軟件制作表格，使用SPSS 12.0軟件進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，P<0.05、P≥0.05分別表示差異顯著、不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 類黃酮、生物堿的制備

制得了綠葉小檗、紅葉小檗和南天竹的類黃酮與生物堿。3種小檗科植物類黃酮的三氯化鋁反應和鹽酸-鎂粉反應等呈現(xiàn)陽性，生物堿的碘化鉍鉀顯色反應等也呈現(xiàn)陽性，符合標準[18-19]。

2.2 不同季節(jié)類黃酮、生物堿含量的變化動態(tài)

2.2.1類黃酮含量的變化 綠葉小檗4個季節(jié)類黃酮含量的平均值顯著高于紅葉小檗(P<0.05)，而與南天竹沒有顯著差異(P≥0.05)。綠葉小檗與紅葉小檗親緣關(guān)系較近，但是兩者類黃酮含量的差異較大。紅葉小檗和南天竹類黃酮的含量隨著季節(jié)由春季向冬季的遞進而逐漸升高，綠葉小檗中類黃酮的水平則表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(表1)。紅葉小檗的類黃酮水平在冬季最高(3.908%)，顯著高于其他季節(jié)(P<0.05)。南天竹的類黃酮含量也在冬季最高(6.138%)，顯著高于春季和夏季(P<0.05)，但與秋季沒有顯著差異(P≥0.05)。綠葉小檗的類黃酮水平在夏季最高(6.277%)，顯著高于其他季節(jié)(P<0.05)。

表1 3種小檗科植物中類黃酮的含量Table 1 Contents of flavonoids in three Berberidaceae species %

同行不同大寫字母表示同種植物不同季節(jié)之間差異顯著(P<0.05)，同列不同小寫字母表示同一季節(jié)不同物種之間差異顯著(P<0.05)。表2同。

Different capital letters within the same row indicate significant difference for the same species in different seasons at the 0.05 level, and different lowercase letters within the same column indicate significant difference between different species in the same season at the 0.05 level; similarly for Table 2.

2.2.2生物堿含量的變化 綠葉小檗四季生物堿含量的平均值顯著高于紅葉小檗(P<0.05)，而與南天竹沒有顯著差異(P≥0.05)。紅葉小檗的生物堿含量在秋季最高(5.517%)，冬季、夏季次之，春季最低。綠葉小檗的生物堿含量表現(xiàn)為夏季>秋季>春季>冬季。南天竹的生物堿含量表現(xiàn)為夏季>冬季>秋季>春季?？傮w上看，3種小檗科植物的生物堿水平在夏季普遍較高(表2)。

2.3 類黃酮、生物堿抑菌活性的季節(jié)變化

2.3.1類黃酮抑菌活性的變化動態(tài) 在一定濃度時，綠葉小檗、紅葉小檗和南天竹類黃酮對大腸桿菌均表現(xiàn)出抑制作用(表3)，但均弱于氨芐青霉素鈉(10 μg)。同種植物不同季節(jié)類黃酮的MIC值不盡相同。紅葉小檗類黃酮的MIC值在春季和冬季較小，秋季次之，夏季較大。綠葉小檗類黃酮的MIC值次序為春季<冬季<秋季<夏季。南天竹類黃酮的MIC值在春季、冬季和秋季較小，在夏季較大?？傮w上看，3種小檗科植物在春季、冬季時類黃酮的抑菌作用相對較強，而在夏季、秋季時相對較弱。冬季時，紅葉小檗中類黃酮含量較高(表1)，抑菌活性較強(表5)，值得進一步研究開發(fā)。

2.3.2生物堿抑菌活性的變化動態(tài) 綠葉小檗、紅葉小檗和南天竹生物堿對大腸桿菌均具有抑制作用(表4)。紅葉小檗生物堿的MIC值在春季最小，秋季、冬季次之，夏季最大(表5)。綠葉小檗生物堿的MIC值表現(xiàn)為冬季<春季<夏季<秋季。南天竹生物堿的MIC值表現(xiàn)為冬季<春季<秋季<夏季?？傮w上看，3種小檗科植物在冬季、春季時生物堿的抑菌作用相對較強，而在夏季、秋季時相對較弱。春季時，紅葉小檗生物堿的MIC值最低(5 mg·mL-1)。綜上可見，紅葉小檗的生物堿和類黃酮對大腸桿菌均有較好的抑制效應。

3 討論

3.1 類黃酮、生物堿含量變異的原因

紅葉小檗4個季節(jié)的類黃酮含量與綠葉小檗差異較大(表1)。紅葉小檗為綠葉小檗的變種，其葉片顏色(磚紅色)可能與甲基花青素-3,5-雙葡萄糖苷(anthocyanidin-3,5-diglucoside)含量較高有關(guān)[8]。植物花青素通常是以黃烷-3,4-二醇(flavan-3,4-diol)為底物，在花青素合成酶(anthocyanidin synthase)催化下合成而得[23]。紅葉小檗中甲基花青素-3,5-雙葡萄糖苷等花青素的水平與綠葉小檗區(qū)別很大[8]，暗示兩者的類黃酮代謝途徑可能存在較大差異。不同的類黃酮代謝途徑可能是引起兩者類黃酮含量顯著差異的主要原因。

Carmona等[24]研究發(fā)現(xiàn)，低溫有助于甜橙(Citrussinensis)中花青素的合成與積累。冬季氣溫較低，有助于花青素的生物合成，這可能是紅葉小檗和南天竹類黃酮含量在冬季最高的原因。植物類黃酮的生物合成過程常常受到紫外線等環(huán)境因子的影響[25-26]。Guidi等[26]研究認為，植物葉肉類黃酮可以保護葉綠體免受紫外線引起的光氧化損傷，因此紫外線可以促進類黃酮的生物合成。陜西省夏季平均光照時間較長，紫外線照射強度可能較高[27-28]。植物為了應對紫外線脅迫往往合成出更多的類黃酮，這可能是綠葉小檗類黃酮含量在夏季較高的原因。

生物堿對植物本身具有重要的生理生態(tài)意義，對植食動物、昆蟲具有拒食或毒害作用，還可防御微生物病原的侵害[29-30]。此外，溫度、光等環(huán)境因子對生物堿的生物合成往往也有較大影響[31-33]。通常，高溫有利于生物堿等含氮物質(zhì)的合成[29]。陜西省夏季平均氣溫較高，昆蟲、微生物病原等對植物的威脅相對嚴重，因此植物可能會合成出更多的生物堿，這可能是綠葉小檗和南天竹生物堿含量在夏季較高的原因。

表2 3種小檗科植物中生物堿的含量Table 2 Contents of alkaloids in three Berberidaceae species %

表5 3種小檗科植物類黃酮及生物堿的最小抑菌濃度(n=3)Table 5 Minimum inhibitory concentration of flavonoids and alkaloids in three Berberidaceae species (n=3)

季節(jié)Season紅葉小檗Berberis thunbergii var. atropurpurea類黃酮Flavonoids/(mg·mL-1)生物堿Alkaloids/(mg·mL-1)綠葉小檗Berberis thunbergii類黃酮Flavonoids/(mg·mL-1)生物堿Alkaloids/(mg·mL-1)南天竹Nandina domestica類黃酮Flavonoids/(mg·mL-1)生物堿Alkaloids/(mg·mL-1)春季 Spring7520151512夏季 Summer10875201814秋季 Autumn8740381513冬季 Winter7725131510平均值 Average value8.006.7540.0021.5015.7512.25

3.2 類黃酮、生物堿抑菌活性的機理分析

本研究中，抑菌試驗表明，綠葉小檗、紅葉小檗和南天竹類黃酮和生物堿對大腸桿菌均具有一定的抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)，植物類黃酮能夠抑制細菌群體感應信號受體、毒素和酶等毒力因子，影響細菌生物膜的形成，破壞細菌對宿主配體的粘附作用[34]。生物堿能夠擾亂細菌分裂Z環(huán)的形成，抑制核酸合成，影響質(zhì)膜功能，抑制二氫葉酸還原酶(topoisomerase)和DNA拓撲異構(gòu)酶(dihydrofolate reductase)活性，從而顯示出特定的抑菌效果[2,35]。3種小檗科植物類黃酮、生物堿的抑菌機制尚待進一步探究。

4 結(jié)語

本研究分析了不同季節(jié)南天竹、綠葉小檗、紅葉小檗生物堿和類黃酮的含量，探討了生物堿、類黃酮含量季節(jié)變化的可能原因，研究了3種小檗科植物生物堿和類黃酮的抑菌活性及其季節(jié)變化規(guī)律，為小檗科植物類黃酮、生物堿活性物質(zhì)的開發(fā)利用提供了思路。本研究發(fā)現(xiàn)，綠葉小檗、紅葉小檗、南天竹的類黃酮和生物堿含量、抑菌活性都隨著季節(jié)的變化而存在差異。3種小檗科植物類黃酮、生物堿含量的季節(jié)變化可能與光、溫度等環(huán)境因子密切相關(guān)。3種小檗科植物類黃酮、生物堿對模式菌大腸桿菌均具表現(xiàn)出一定的抑制作用。同種植物不同季節(jié)類黃酮、生物堿對大腸桿菌的抑制活性不盡相同。在3種小檗科植物中，紅葉小檗對大腸桿菌的抑制作用相對較強，春季時紅葉小檗生物堿的抑菌活性最強。今后可進一步探究紅葉小檗抑菌活性的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制。