孫 鑫 彭 淵 呂 靖 趙志敏 楊 濤 陶艷艷 胡旭東 劉成海,

(1 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院肝病研究所，上海，201203； 2 上海市中醫(yī)臨床重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海，201203； 3 上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物教研室，上海，201203)

慢性乙型病毒性肝炎是嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的重大傳染性疾病之一。近年來(lái)，隨著疫苗接種與抗病毒藥物廣泛應(yīng)用，慢乙肝的治療取得了巨大進(jìn)展。但是，有效抑制乙型肝炎病毒(Chronic Hepatitis B，HBV)后，肝纖維化肝硬化等后期階段疾病依然存在，目前尚無(wú)抗肝纖維化生物或化學(xué)藥物，中醫(yī)藥具有抗肝纖維化的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，抗乙肝病毒藥物與抗肝纖維化中藥聯(lián)合應(yīng)用可促進(jìn)乙肝肝纖維化逆轉(zhuǎn)。探索并回答中西藥物聯(lián)用療效提高的關(guān)鍵機(jī)制，中醫(yī)藥在其中的作用，其治療應(yīng)答的目標(biāo)人群特征，將發(fā)現(xiàn)中西醫(yī)結(jié)合方案有效逆轉(zhuǎn)乙肝肝纖維化目標(biāo)人群的主要生物學(xué)與中醫(yī)證候特征，闡明中西醫(yī)結(jié)合有效治療乙肝肝硬化的主要原理及中藥作用特點(diǎn)，建立臨床與基礎(chǔ)密切結(jié)合的中西醫(yī)結(jié)合肝纖維化轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究模式，促進(jìn)基礎(chǔ)研究與臨床實(shí)踐的共同發(fā)展進(jìn)步。

1 肝纖維化是影響慢乙肝患者預(yù)后的重要病理特點(diǎn)，抗肝纖維化是中醫(yī)優(yōu)勢(shì)領(lǐng)域，抗乙肝病毒藥物與抗肝纖維化中藥聯(lián)合應(yīng)用可促進(jìn)乙肝肝纖維化逆轉(zhuǎn)

肝纖維化以肝臟的細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular Matrix，ECM)過(guò)度增生和異常沉積為特征，存在于大多數(shù)慢性肝病，是慢性肝炎向肝硬化發(fā)展的關(guān)鍵病理過(guò)程，可引起肝臟結(jié)構(gòu)與功能異常，嚴(yán)重威脅患者健康。目前乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)感染依然是我國(guó)慢性肝病的主要原因，HBV介導(dǎo)的免疫應(yīng)答致使肝細(xì)胞損傷與炎性反應(yīng)反復(fù)存在[1]，促使患者進(jìn)展為肝硬化甚或肝癌。針對(duì)HBV復(fù)制的病因治療可部分減輕與逆轉(zhuǎn)肝臟纖維化[2-3]，但作用有限。乙肝患者在恩替卡韋(Entecavir，ETV)等核苷酸類(lèi)治療1年的肝纖維化改善率僅為39%，部分患者病毒有效控制后肝纖維化依然存在或者發(fā)展[4]；對(duì)于初始治療時(shí)纖維化顯著的慢乙肝高度肝纖維化或肝硬化患者，即使療程延長(zhǎng)到5～10年，仍有1/3患者肝纖維化未能改善[5-6]。究其原因，主要有以下幾個(gè)方面：其一，肝星形細(xì)胞(Hepatic Stellate Cell，HSC)一旦活化可自分泌多種細(xì)胞因子維持活化的持續(xù)；其二，肝臟微環(huán)境破壞，如肝組織炎性免疫細(xì)胞遷移、表型與功能異常，導(dǎo)致肝臟細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)間復(fù)雜病理影響；其三，沉積的ECM降解減少。因此，對(duì)于乙肝肝硬化患者，抗病毒治療是必須的，而針對(duì)HSC的活化與ECM代謝的抗肝纖維化治療也是必要的。

近半個(gè)世紀(jì)來(lái)，我國(guó)中醫(yī)中西醫(yī)結(jié)合肝病工作者面對(duì)臨床需求，開(kāi)展了大量臨床與基礎(chǔ)研究，出現(xiàn)了抗肝纖維化中成藥、經(jīng)驗(yàn)方或中西醫(yī)結(jié)合方案，闡明了有效方藥的部分作用機(jī)制，形成了全國(guó)行業(yè)性中西醫(yī)結(jié)合肝纖維化診療指南，并且進(jìn)行了中醫(yī)藥抗肝纖維化的美國(guó)FDA臨床注冊(cè)試驗(yàn)等，這些成績(jī)與進(jìn)步，使得肝纖維化治療成為中醫(yī)中西醫(yī)結(jié)合領(lǐng)域的優(yōu)勢(shì)方向。由丹參、桃仁、蟲(chóng)草菌絲、松黃、五味子、絞股藍(lán)組成的扶正化瘀方(Fuzheng Huayu Formula，F(xiàn)ZHY)，是上海中醫(yī)藥大學(xué)肝病研究所研制的抗肝纖維化中藥新藥。文獻(xiàn)薈萃分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ZHY聯(lián)合抗病毒藥物可改善乙肝肝纖維化患者癥狀與血清纖維化指標(biāo)[7]。我們與瑞金醫(yī)院感染科合作開(kāi)展的FZHY聯(lián)合ETV治療乙肝肝纖維化小樣本、隨機(jī)、雙盲、安慰劑平行對(duì)照臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)ZHY聯(lián)合ETV治療48周，肝組織學(xué)逆轉(zhuǎn)率顯著高于單用ETV組。2014年在國(guó)家傳染病重大科技專(zhuān)項(xiàng)(2014ZX10005001)支持下，我們課題組牽頭聯(lián)合全國(guó)20家臨床醫(yī)院開(kāi)展了中醫(yī)藥聯(lián)合ETV治療乙肝肝硬化的大樣本臨床研究，旨在較大規(guī)模、高質(zhì)量獲得中醫(yī)藥逆轉(zhuǎn)高度肝纖維化的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)，建立有效的臨床方案，促進(jìn)肝纖維化治療這一世界性醫(yī)學(xué)難題的逐步解決。

2 乙肝早期肝硬化患者存在肝臟區(qū)域免疫微環(huán)境紊亂的病理特征，是影響高度肝纖維化難以消退逆轉(zhuǎn)的重要原因

肝纖維化具有形成發(fā)展與消退恢復(fù)2個(gè)階段。既往認(rèn)為，肝纖維化一旦形成，則難以逆轉(zhuǎn)。但近年來(lái)研究證實(shí)，不僅肝纖維化是可逆的，一定程度的肝硬化也是可逆的[8]。無(wú)論肝纖維化的發(fā)展還是消退，其機(jī)制均十分復(fù)雜，涉及到肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞損傷、HSC的活化、自然殺傷細(xì)胞(Natural Killer Cell，NK細(xì)胞)與肝巨噬細(xì)胞(Macrophage，Mφ)(包括庫(kù)普弗細(xì)胞)的功能異常、ECM的代謝失衡等多個(gè)方面。乙肝肝硬化患者肝臟高度纖維化，而活化HSC的凋亡消退與肝臟沉積ECM降解是高度肝纖維化逆轉(zhuǎn)的重要環(huán)節(jié)，該環(huán)節(jié)涉及到NK細(xì)胞與Mφ(包括庫(kù)普弗細(xì)胞)的免疫調(diào)節(jié)、HSC的視黃醇代謝等，且這些細(xì)胞相互聯(lián)系，構(gòu)成影響肝纖維化逆轉(zhuǎn)的“免疫微環(huán)境”。見(jiàn)圖1。

HSC是肝纖維化的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞，也是肝內(nèi)重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞與機(jī)體視黃醇代謝關(guān)鍵細(xì)胞，且這種視黃醇代謝與HSC活化及其免疫調(diào)節(jié)有重要聯(lián)系。靜止期HSC胞內(nèi)主要為視黃醇，細(xì)胞活化時(shí)，視黃醇在乙醇脫氫酶作用下變?yōu)橐朁S醛，視黃醛既可通過(guò)短鏈脫氫酶/還原酶再逆轉(zhuǎn)化為視黃醇，也可通過(guò)乙醛脫氫酶轉(zhuǎn)變?yōu)橐朁S酸(Retinoid Acid，RA)。RA則可進(jìn)入核內(nèi)與其核受體相結(jié)合，調(diào)控目的基因表達(dá)，而完全活化的HSC脂滴消失，缺乏視黃醇與RA。有研究表明：視黃醇代謝酶ADH3可刺激I型膠原基因表達(dá)與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(Transforming Growth Factor-β1，TGF-β1)活化，有明顯的促進(jìn)肝纖維化作用[9]。

圖1 肝纖維化“免疫微環(huán)境”示意圖

人肝內(nèi)NK細(xì)胞占淋巴細(xì)胞比例高達(dá)30%～50%，在肝臟中優(yōu)勢(shì)存在，無(wú)需抗原提呈即可對(duì)多種靶細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞毒作用，并由其激活型與抑制型受體的平衡所決定。肝NK細(xì)胞與HSC聯(lián)系密切，且與視黃醇代謝有關(guān)。一方面，NK細(xì)胞可“殺傷”早期活化與衰老的HSC，主要通過(guò)視黃酸早期誘導(dǎo)基因1(RAE-1)、干擾素-γ(Interferon-γ，IFN-γ)、腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(Tumor Necrosis Factor-related Apoptosis-inducing Ligand，TRAIL)等途徑[10]。另一方面，HSC作為免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞負(fù)性調(diào)控NK細(xì)胞，主要通過(guò)細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子1(SCOS1)、TGF-β1-Smads信號(hào)通路等途徑抑制NK細(xì)胞的增殖分化[11]。因此，提高NK細(xì)胞的活性，使NK細(xì)胞殺傷活化HSC功能增強(qiáng)，是逆轉(zhuǎn)肝纖維化的重要措施之一。

肝內(nèi)Mφ數(shù)量眾多，定居于肝臟的Mφ占全身組織定居Mφ總數(shù)的80%～90%[12]，是肝內(nèi)重要的固有免疫細(xì)胞，在維持肝臟免疫穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，其對(duì)肝纖維化有“雙刃劍”作用。在肝臟炎性反應(yīng)與纖維化形成階段，肝內(nèi)Mφ通過(guò)經(jīng)典途徑激活為促炎性的M1型，而在肝纖維化消退階段，肝內(nèi)Mφ通過(guò)旁路激活為恢復(fù)性或抗炎性的M2型。Mφ其主要通過(guò)明膠酶MMP-9、彈性膠原酶MMP-12、TRAIL及其受體等途徑促進(jìn)肝纖維化消退[13]，此外Mφ吞噬清除細(xì)胞凋亡碎片以及增強(qiáng)NK細(xì)胞活性，也有助于肝纖維化的消退。HSC也可影響Mφ的募集與分化，RA可促進(jìn)肝內(nèi)Mφ的活性[14]。因此，調(diào)控肝Mφ的分化，使Mφ更多的發(fā)揮恢復(fù)性亞群的功能，也是逆轉(zhuǎn)高度肝纖維化的重要措施。

在慢性乙型肝炎或肝硬化時(shí)，NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞活性下降。研究發(fā)現(xiàn)HBV感染可負(fù)調(diào)控NK細(xì)胞功能，如促使NKG2A等抑制型受體與共抑制分子Tim3表達(dá)增多[15]，而激活型受體表達(dá)下降，抑制樹(shù)突狀細(xì)胞與NK細(xì)胞間的細(xì)胞通信等，從而抑制NK細(xì)胞活性等。部分患者即使有效控制HBV復(fù)制，肝臟NK細(xì)胞仍處于抑制狀態(tài)[16]，提示除了HBV因素，尚有抑制NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞活性的其他因素。因此，探討肝NK細(xì)胞等免疫逃逸的負(fù)性調(diào)節(jié)機(jī)制與干預(yù)作用，將有助于闡明肝纖維化的免疫病理機(jī)制、發(fā)展肝纖維化治療新策略。

3 調(diào)節(jié)肝臟區(qū)域免疫微環(huán)境，調(diào)節(jié)活化HSC與肝臟免疫細(xì)胞之間聯(lián)系可能是中醫(yī)藥逆轉(zhuǎn)高度肝纖維化的優(yōu)勢(shì)

我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)蘊(yùn)藏著豐富的免疫學(xué)思想，《素問(wèn)·六微旨大論》云“亢則害，承乃制，制則生化”。從免疫學(xué)角度而言，“亢則害”就是機(jī)體免疫自穩(wěn)態(tài)失調(diào)；“承乃制”則是通過(guò)調(diào)控使免疫自穩(wěn)功能恢復(fù)，機(jī)體生長(zhǎng)代謝等生理功能正常，達(dá)到“制則生化”之境地。中藥與免疫調(diào)節(jié)有著天然而緊密的聯(lián)系：中藥具有“扶正”功能，能夠增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，促進(jìn)單核-巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞等生理功能；中藥也具有“祛邪”作用，能夠免疫抑制，減少炎性反應(yīng)遞質(zhì)的釋放，抑制或消除抗體的產(chǎn)生，抑制T細(xì)胞的增殖等，以達(dá)到“邪去而正安”的目的[17]。這種雙向免疫調(diào)節(jié)作用正體現(xiàn)了中醫(yī)“整體觀”與“陰陽(yáng)平衡”理念。

既往研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ZHY抗肝纖維化的機(jī)制包括保護(hù)肝細(xì)胞損傷與促進(jìn)肝細(xì)胞再生，抑制HSC活化，促進(jìn)膠原降解等[18-19]；有研究提示其作用機(jī)制還與免疫調(diào)節(jié)有關(guān)：FZHY治療肝硬化患者80例3個(gè)月，可有效提高患者外周血的NK細(xì)胞活性及T細(xì)胞數(shù)量[20]；FZHY可提高肝纖維化小鼠的肝臟NK細(xì)胞活性，而對(duì)ASGM-1抗體抑制體內(nèi)NK細(xì)胞的模型小鼠抗肝纖維化效應(yīng)減弱，證實(shí)其抗肝纖維化效應(yīng)與激活NK細(xì)胞密切相關(guān)[21]；FZHY可通過(guò)抑制肝Mφ的激活及其旁分泌作用，而抑制HSC活化等[19]。我們也發(fā)現(xiàn)FZHY主要藥物丹參與蟲(chóng)草菌絲抗小鼠肝纖維化的作用與提高肝臟NK細(xì)胞活性有關(guān)。這些結(jié)果均提示，F(xiàn)ZHY可能具有調(diào)節(jié)NK細(xì)胞與肝Mφ等肝臟區(qū)域免疫的作用，與抗病毒藥物協(xié)同作用，促進(jìn)活化HSC凋亡與肝纖維化消退。

4 發(fā)現(xiàn)有效人群的生物學(xué)與中醫(yī)證候特征，將有助于乙肝肝纖維化的精細(xì)分層與中西醫(yī)結(jié)合精準(zhǔn)治療

疾病是環(huán)境與基因相互復(fù)雜影響的結(jié)果，常常具有異質(zhì)性。例如，均為慢性丙型肝炎患者，但發(fā)展為肝纖維化的時(shí)間相差可達(dá)5倍，且IL28-B基因多態(tài)性可明顯影響到患者對(duì)干擾素-α的臨床療效[22-23]。因此，需重視疾病分層，以準(zhǔn)確判斷預(yù)后，選擇適應(yīng)人群，精準(zhǔn)醫(yī)療以提高臨床診治水平。

肝臟是機(jī)體的代謝器官也是免疫器官，因此肝臟疾病的異質(zhì)性除了常用的代謝組學(xué)所表征，免疫學(xué)的變化也是重要表征特點(diǎn)。代謝組學(xué)可發(fā)現(xiàn)藥物代謝組及其療效預(yù)測(cè)的生物標(biāo)志物，通過(guò)與轉(zhuǎn)錄組等相結(jié)合，可以構(gòu)建生物分子網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)與交叉驗(yàn)證影響代謝的關(guān)鍵通路及其節(jié)點(diǎn)。肝臟雖不是“專(zhuān)職”免疫器官，但是其天然免疫優(yōu)勢(shì)存在，對(duì)于維護(hù)肝臟微環(huán)境穩(wěn)定、肝臟疾病的發(fā)生變化及全身免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)等均發(fā)揮重要作用[24]。因此，基于影響乙肝肝纖維化消退轉(zhuǎn)歸的肝臟區(qū)域免疫關(guān)鍵病理，結(jié)合視黃醇代謝這一肝臟特有、與纖維化與免疫調(diào)節(jié)均密切相關(guān)的物質(zhì)代謝，且聯(lián)系全身的免疫蛋白質(zhì)組變化，可以發(fā)現(xiàn)對(duì)治療方案應(yīng)答差異的免疫學(xué)重要特征。

中醫(yī)證候是疾病過(guò)程中某一階段機(jī)體在內(nèi)外致病因素作用下的綜合反應(yīng)，中醫(yī)重視辨證論治與病證結(jié)合，早在漢代《金匱要略》中即有《黃疸病脈證并治》等論述?！陡卫w維化中西醫(yī)結(jié)合診療指南》[25]指出：肝纖維化的基本病機(jī)為正虛血瘀，而主要證型有肝膽濕熱、肝郁脾虛與肝腎陰虛，在辨證治療時(shí)，主要證型與治法、基本證型與治法兩者必須相互結(jié)合，靈活運(yùn)用[26]。因此，在中醫(yī)基本治法基礎(chǔ)上，通過(guò)差異療效的證候因素分層分析，可以發(fā)現(xiàn)影響療效的中醫(yī)主要證候，并了解基本證候的主要生物學(xué)基礎(chǔ)。

5 科學(xué)假說(shuō)的提出與主要工作思路

基于中醫(yī)藥抗肝纖維化的優(yōu)勢(shì)與免疫調(diào)節(jié)特點(diǎn)，重大專(zhuān)項(xiàng)乙肝早期肝硬化患者中西醫(yī)結(jié)合方案的組間、組內(nèi)療效差異現(xiàn)象，肝臟區(qū)域免疫微環(huán)境在肝纖維化逆轉(zhuǎn)中的重要作用，我們提出以下科學(xué)假說(shuō)：1)調(diào)節(jié)肝HSC與NK細(xì)胞、肝Mφ之間相互聯(lián)系，改善肝纖維化免疫微環(huán)境，是中西藥物聯(lián)用逆轉(zhuǎn)乙肝高度肝纖維化的重要作用機(jī)制；2)中藥扶正化瘀方的作用特點(diǎn)在于調(diào)節(jié)活化HSC的視黃醇代謝與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，以恢復(fù)NK細(xì)胞的免疫殺傷功能；3)該被治療藥物改善的肝臟免疫微環(huán)境是有效人群的重要生物學(xué)表現(xiàn)，與機(jī)體血清代謝標(biāo)志物及其中醫(yī)證候構(gòu)成效應(yīng)目標(biāo)人群的主要特征。

本研究將借助傳染病重大科技專(zhuān)項(xiàng)的乙肝肝硬化臨床研究生物樣本，結(jié)合動(dòng)物與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，圍繞肝纖維化免疫微環(huán)境中HSC、NK細(xì)胞與肝Mφ的相互聯(lián)系及其視黃醇代謝，臨床與基礎(chǔ)、區(qū)域免疫與整體變化等相結(jié)合研究，以驗(yàn)證以上科學(xué)假說(shuō)，發(fā)現(xiàn)有效方案的目標(biāo)人群特征，闡明其主要治療機(jī)制與中藥作用特點(diǎn)，促進(jìn)中西醫(yī)結(jié)合肝病的精準(zhǔn)醫(yī)療與基礎(chǔ)研究發(fā)展。