邱志敏 王美鑑 付愛榮 王雅琦 董涵之 傅穎媛

乳腺癌是1個重要的全球衛(wèi)生問題，在女性惡性腫瘤中高居首位。目前隨著腫瘤綜合治療的深入開展，乳腺癌的診療越來越規(guī)范，患者生存期逐漸延長，盡管乳腺癌治療已經獲得非常成功，但是隨著隨訪時間的延長發(fā)現(xiàn)10年內仍有50%的乳腺癌出現(xiàn)遠處轉移。針對激素受體陽性型乳腺癌可以給予內分泌藥物維持治療，針對HER-2過表達型可以給予靶向治療，但是針對三陰性乳腺癌后續(xù)卻缺乏更多有效的治療手段，導致此類患者死亡率較高。因此迫切的需要在三陰性乳腺癌患者中尋找更多的可以有效預測療效的生物標志物以及更多的治療方法。有研究表明在三陰性乳腺癌患者腫瘤組織及腫瘤浸潤性淋巴細胞中可見程序性死亡配體-1(programmed death ligand-1，PD-L1)的高表達[1]。程序性死亡配體-1(PD-L1)是PD-1的配體之一，是免疫檢查點的一部分，對預防自身免疫至關重要[2]。PD-1/PD-L1信號通路的激活可以導致腫瘤逃脫T淋巴細胞的免疫監(jiān)視從而出現(xiàn)免疫逃逸，而通過阻斷PD-1/PD-L1信號通路可以使腫瘤細胞重新被T淋巴細胞免疫監(jiān)視，從而達到殺滅腫瘤細胞的作用。本研究旨在系統(tǒng)比較三陰性乳腺癌、非三陰性乳腺癌及癌旁組織的PD-L1表達以及與臨床病理參數的相關性，同時探討PD-L1的表達與不同分子分型乳腺癌的生存關系及預后分析，為乳腺癌患者特別是三陰性乳腺癌患者的免疫檢查點治療提供可靠的理論依據。

1 材料與方法

1.1 一般資料

組織切片為經術后病理確診為乳腺浸潤性導管癌癌組織110例及同期術后癌旁組織30例。收集其完整的病理資料及臨床資料。年齡為30～86歲，中位年齡48歲。N0期51例，N1期31例，N2期10例，N3期18例。M0期99例，M1期11例。行改良根治術99例，行保乳手術11例。Ⅰ期21例，Ⅱ期56例，Ⅲ期22例，Ⅳ期11例。ER陰性71例，陽性39例。PR陰性74例，陽性36例。三陰性乳腺癌50例，HER-2過表達型、LuminalB型、LuminalA型各20例。

1.2 材料與試劑

來自Abcam公司的兔抗人PD-L1單克隆抗體(克隆號28-8)，來自Dako公司的DAB染色劑及Dako EnVision TM檢測系統(tǒng)，PBS緩沖液、EDTA修復液、蘇木精染液、檸檬酸緩沖液均來自廣州安必平公司。

1.3 免疫組化方法

將蠟塊進行常規(guī)切片，二甲苯、酒精脫蠟，水化及高壓鍋抗原修復，滴加相應抗體，陰性對照片上滴加PBS緩沖液，滴加已配好的DAB顯色液顯色，蘇木精染液復染，封片，酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠進行封片，最后在顯微鏡下進行閱片。根據陽性細胞占所在組織所有細胞的比例及陽性細胞染色深淺來進行計分判斷。按顯色細胞數占百分比：顯色的陽性細胞所占百分比<5%計0分，5%～25%計1分，26%～50%計2分，51%～75%計3分，>75%計4分；按陽性細胞顯色深淺計分：無陽性細胞顯色為0分，1+即淺黃色為1分，2+即棕色為2分，3+即深褐色為3分。根據陽性細胞所占百分比分數及陽性細胞顯色深淺分數相乘。>1為陽性，≤1則為陰性。

1.4 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，PD-L1表達與臨床病理參數相關性采用Spearman等級相關統(tǒng)計分析，累計生存率的比較采用Kaplarn-Meei檢驗，單因素分析比較采用Logistic回歸分析，多元回歸分析采用多因素COX回歸模型進行統(tǒng)計分析，所有的檢測都是雙側的，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PD-L1在乳腺癌中的表達結果

三陰性乳腺癌PD-L1陽性表達36%，HER-2過表達型乳腺癌PD-L1陽性表達25%，luminalB型乳腺癌PD-L1陽性表達20%，luminalA型乳腺癌及癌旁組織PD-L1陽性表達0(圖1)。免疫組化染色結果顯示:27例乳腺癌患者PD-L1陽性表達，鏡下可見深淺不同的著色(深褐色至淺黃色)；PD-L1陰性鏡下則未見明顯著色。

圖1 PD-L1在乳腺癌癌組織及癌旁組織中的表達結果

2.2 PD-L1表達與乳腺癌臨床病理特征的相關性分析

單因素分析提示：PD-L1表達與陽性淋巴結、TNM分期呈正相關，與ER、PR受體呈負相關。行改良根治術的患者PD-L1表達率遠遠高于行保乳手術的乳腺癌患者，具有統(tǒng)計學差異。PD-L1表達在三陰性乳腺癌中較非三陰性乳腺癌中高，且有統(tǒng)計學意義(表1)。多因素分析提示：PD-L1表達與陽性淋巴結個數及TNM分期相關(表2)。

2.3 各臨床病理特征與臨床預后關系相關性分析

單因素分析提示：總生存期與陽性淋巴結個數、腫瘤大小、TNM分期、PD-L1表達率呈負相關，與ER、PR狀態(tài)呈正相關；總生存期與分子分型相關，其中三陰性乳腺癌及l(fā)uminal B型乳腺癌中PD-L1表達陽性與預后差相關，且有統(tǒng)計學意義(表3)。多因素分析提示：PD-L1表達是影響乳腺癌臨床預后的唯一預測因素(表4)。

2.4 PD-L1表達與乳腺癌患者總生存期的關系

多因素分析提示：乳腺癌患者中PD-L1表達是影響患者臨床預后的獨立危險因素。

表1 PD-L1在乳腺癌中的表達與其臨床病理特征的相關性單因素分析/例

表2 PD-L1表達與乳腺癌臨床病理特征的相關性多因素分析

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率在世界各地迥然不同。我國乳腺癌發(fā)病率在北京、上海等發(fā)達城市高發(fā)[3]。對于激素受體陰性及HER-2陰性的患者給予手術及放化療之后缺乏有效的維持治療手段，而且三陰性乳腺癌發(fā)病年齡較輕、侵襲性高、分化差、內臟轉移多、預后極差，目前臨床上缺乏有效的特異性治療手段。但是考慮這種類型的乳腺癌被證明是免疫原性腫瘤，所以系統(tǒng)免疫療法利用患者自身的免疫系統(tǒng)直接消滅和靶向腫瘤細胞已作為三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)有效的治療手段[4]。

PD-1/PD-L1信號通路是目前免疫靶向治療的熱點話題，被越來越多的研究者所關注，它是一對協(xié)同刺激分子，其在T淋巴細胞的激活過程中起著負性調節(jié)作用。目前PD-L1在許多惡性腫瘤中均有表達，如非小細胞肺癌、尿路上皮癌、軟組織肉瘤、乳腺癌、惡性黑色素瘤、腸癌等大部分實體瘤中均有表達。在已經報道不同的研究中PD-L1在惡性腫瘤中的表達差異較大(1.7%～58%)[5-8]。本研究乳腺癌PD-L1陽性表達率為24.5%，在三陰性乳腺癌PD-L1陽性表達率高達36%。

Sang等[6]發(fā)現(xiàn)乳腺癌中PD-L1表達與高組織學分級、陰性淋巴結、病理分期早、高腫瘤浸潤細胞數目、激素受體陰性表達、HER-2陽性表達、表皮生長因子受體、P53及高增殖表達呈正相關。QIN等[7]發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中PD-L1高表達與大負荷腫瘤、較高的組織分級、轉移性淋巴結及激素受體表達陰性呈正相關。Muenst等[8]發(fā)現(xiàn)乳腺癌PD-L1表達與年齡、腫瘤大小、原發(fā)腫瘤的分類、腫瘤分級、淋巴結轉移狀態(tài)、激素狀態(tài)及腫瘤增殖情況等相關。Li等[9]研究發(fā)現(xiàn)高PD-L1表達和增加的FOXP3+Treg浸潤均與高組織學級別、陰性ER有關，還有PR狀態(tài)和侵略性的腫瘤亞型，尤其是基底樣的亞型相關。本研究發(fā)現(xiàn)PD-L1高表達與陽性淋巴結、TNM分期呈正相關，與雌激素受體、孕激素受體呈負相關；與分子分型相關，特別是三陰性乳腺癌表達高于非三陰性乳腺癌；與手術方式相關，改良根治術患者PD-L1表達明顯高于保乳手術患者。

表3 影響乳腺癌總生存率的臨床病理特征單因素分析

表4 影響乳腺癌總生存率的多因素分析

Sang等[6]研究發(fā)現(xiàn)PD-L1是乳腺癌獨立的預后預測因子。Muenst等[8]研究發(fā)現(xiàn)PD-L1的表達與總生存期呈負相關，是總生存期獨立不良預后因素。Li等[9]研究發(fā)現(xiàn)PD-L1和FOXP3+Treg的高表達與更差的預后相關，這兩個標記物都是降低患者總體生存的獨立預測因子。Baptista等[10]研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌中PD-L1的表達與乳腺癌患者的總體生存率有顯著的相關性。Pan等[11]研究中發(fā)現(xiàn)間質腫瘤浸潤淋巴細胞中PD-L1高表達能顯著提高總生存期和無進展生存。本研究發(fā)現(xiàn)對總生存期有影響的陽性淋巴結個數、腫瘤大小、TNM分期、ER、PR、分子分型、PD-L1表達等因素納入COX多因素分析，結果發(fā)現(xiàn)PD-L1的表達是影響乳腺癌臨床預后的唯一預測預后因子；亞組分析提示在三陰性乳腺癌及l(fā)uminal B型乳腺癌中PD-L1表達陽性與不良的總生存相關。

PD-1/PD-L1信號通路的激活可以使腫瘤細胞逃脫T淋巴細胞的監(jiān)視而導致免疫逃逸，從而使腫瘤細胞活躍終使機體患有腫瘤或者使腫瘤出現(xiàn)復發(fā)及轉移，而通過阻斷該通路可以使T淋巴細胞重新監(jiān)視腫瘤細胞繼而殺滅腫瘤細胞。PD-L1高表達患者能更好地進行有效的免疫治療，本研究證實了在乳腺癌中特別是三陰性乳腺癌PD-L1高表達，這為乳腺癌特別是三陰性乳腺癌的免疫治療研究，提供1個有效的實驗依據。