張 瑜 金建軍 白艷麗 朱晶晶 田笑笑

大腸癌為臨床較為常見的1種惡性腫瘤，對人們的生命健康產(chǎn)生了嚴(yán)重威脅，近些年來，隨著社會的不斷發(fā)展，人們的生活方式和飲食結(jié)構(gòu)也發(fā)生了很大的變化，大腸癌的發(fā)病與死亡率也呈現(xiàn)逐年增加的趨勢[1]。正常的大腸黏膜到大腸的腺瘤最后到大腸癌，是當(dāng)前關(guān)于大腸癌發(fā)病公認(rèn)的1個過程。相關(guān)研究顯示，Hh的信號通路在機(jī)體腸道發(fā)育中有這重要作用，如調(diào)節(jié)腸神經(jīng)、平滑肌和絨毛產(chǎn)生等。伴隨著相關(guān)專家對Hh的信號通路更深入的研究，人們發(fā)現(xiàn)機(jī)體消化系統(tǒng)內(nèi)惡性腫瘤產(chǎn)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移與Hh的信號通路異常的激活有密切關(guān)系[2-3]。所以，本文通過探究Hh的信號通路內(nèi)主要的蛋白Glil和Sufu在大腸癌發(fā)生、進(jìn)展中表達(dá)的情況，了解患者臨床的參數(shù)和其變化規(guī)律間的聯(lián)系情況。

1 材料與方法

1.1 一般資料

大腸癌的組織標(biāo)本選取2011年8月至2016年8月間在本院接受大腸癌的根治手術(shù)以后保存的蠟塊，共120例，其中男性患者76例，女性患者44例，平均年齡(55.3±11.7)歲；大腸腺瘤的組織標(biāo)本選取同期在本院消化內(nèi)鏡下所切除后保存的蠟塊，共100例，其中男性患者51例，女性患者49例，平均年齡(53.5±12.1)歲；大腸正常的黏膜標(biāo)本選取同期在消化內(nèi)鏡下的活檢樣本，共100例，其中男性55例，女性45例，平均年齡(52.7±10.9)歲；三組對象在性別和年齡等方面對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

標(biāo)本選取要求為18歲以上成人，患者既往沒有腫瘤的病史，沒有腺瘤、克羅恩病和潰瘍性的大腸炎等其他的疾??；告訴患者標(biāo)本的用途并征得其同意，詳細(xì)記錄患者的基本資料資料情況。

1.2 主要試劑、藥品和儀器

主要試劑、藥品：Sufu抗體(由英國Abcam公司生產(chǎn))、抗體的稀釋液(由北京中杉金橋公司生產(chǎn))、磷酸鹽的緩沖液(由北京中杉金橋公司生產(chǎn))、Glil抗體(由美國CellSignaling公司成產(chǎn))、碳酸鋰(由上海化學(xué)試劑公司生產(chǎn))、蘇木精(由上?；瘜W(xué)試劑公司生產(chǎn))、濃度的DAB試劑盒(由北京中杉金橋公司生產(chǎn))、二甲苯(由湖北奧新生新材料公司生產(chǎn))、二步法的免疫組化的檢測試劑盒(由北京中杉金橋公司生產(chǎn))。

主要儀器：ZT-12P的自動生物組織的脫水機(jī)(由孝感亞光醫(yī)用電子公司生產(chǎn))、55i的光學(xué)顯微鏡(由日本尼康公司生產(chǎn))、病理切片機(jī)(由德國萊卡儀器公司生產(chǎn))、電熱的恒溫培養(yǎng)箱(由上海精宏實驗設(shè)備公司生產(chǎn))、YT-7FB的生物組織的攤烤機(jī)(由孝感亞光醫(yī)用電子公司生產(chǎn))、普通冰箱(由中國海爾公司生產(chǎn))。

1.3 實驗方法

試劑配制。①配制蘇木精：將0.5 g蘇木精溶解在5 ml無水乙醇內(nèi)；10 g的硫酸鋁按加入100 ml三蒸水內(nèi)加熱至沸騰，然后加入無水乙醇內(nèi)，加熱至沸騰，在將0.25 g的一氧化汞加入加熱沸騰后冷卻，最后將0.5 ml的冰醋酸加入搖均勻；②配制磷酸鹽(phosphate buffer saline，PBS)的緩沖液：將1000 mlde PBS緩沖液溶解在1 000 ml三蒸水內(nèi)；③配制顯色液的二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)：將1 ml的三蒸水分別滴到試劑盒A、B、C液內(nèi)。

標(biāo)本的處理[4]。將患者組織標(biāo)本放在8%中性的福爾馬林溶液內(nèi)固定，一天后將標(biāo)本取出進(jìn)行脫水處理，然后放入包埋機(jī)中；放在溫臺上加熱，將組織標(biāo)本平放在鐵盒的底部，并整齊排列；滴蠟處理，凝固后放入冰箱中，凝固為蠟塊然后進(jìn)行切片處理；普通的載玻片使用HE進(jìn)行染色，再次確認(rèn)患者的病理診斷；涂膠的載玻片使用免疫組化染色。

免疫組化的評分[5]。免疫組化評分應(yīng)用德國的半定量的系統(tǒng)，陽性染色強(qiáng)度：深褐色(重度)計3分；深黃色(中度)計2分；淡黃色(輕度)計1分；無染色計0分。陽性細(xì)胞數(shù)：陽性腺上皮細(xì)胞占總數(shù)75%及以上計4分；陽性腺上皮細(xì)胞占總數(shù)的50%～75%計3分；陽性腺上皮細(xì)胞占總數(shù)的25%～50%計2分；陽性腺上皮細(xì)胞占總數(shù)的5%～25%計2分；陽性腺上皮細(xì)胞占總數(shù)<50%計0分。最后總分是上述兩項之積，其中0～2分是陰性(-)，3～5分是陽性(+)，6～8分是陽性(++)，9～12分是陽性(+++)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Hh的信號通路內(nèi)負(fù)調(diào)控的因子SuFu蛋白表達(dá)的情況

大腸癌組織標(biāo)本中SuFu陽性表達(dá)率顯著低于大腸腺瘤和正常大腸黏膜，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 Hh信號通路內(nèi)負(fù)調(diào)控的因子SuFu蛋白表達(dá)情況對比

2.2 大腸癌患者病理參數(shù)與SuFu表達(dá)的關(guān)系

腫瘤分化程度、性別、病理類型和年齡與SuFu表達(dá)無關(guān)(P>0.05)，發(fā)病部位、臨床分期和浸潤深度與SuFu表達(dá)顯著相關(guān)(P<0.05)，見表2。

2.3 Hh信號通路內(nèi)轉(zhuǎn)錄的因子Glil蛋白表達(dá)的情況

正常大腸黏膜內(nèi)Glil陽性表達(dá)率顯著低于大腸腺瘤與大腸癌，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，大腸腺瘤內(nèi)Glil表達(dá)率略低于大腸癌，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 Hh信號通路內(nèi)轉(zhuǎn)錄的因子Glil蛋白表達(dá)情況對比

2.4 大腸癌病理參數(shù)與Glil表達(dá)的關(guān)系

腫瘤分化程度、性別、病理類型、年齡、發(fā)病部位和臨床分期與SuFu表達(dá)無關(guān)，腫瘤浸潤深度與Glil表達(dá)顯著相關(guān)(P<0.05)，見表4。

3 討論

近些年來，分子的生物學(xué)方面的研究有了很多實質(zhì)性的進(jìn)展，而信號通路的研究已成為目前腫瘤的產(chǎn)生方面研究的熱點[6]。1980年Wieschaus與Nusslein-Volhard研究果蠅的體節(jié)發(fā)育基因突變的遺傳分析的時候發(fā)現(xiàn)了Hh的信號通路。而后的很多相關(guān)研究顯示胚胎發(fā)育中Hh的信號通路起著非常重要的影響，腫瘤產(chǎn)生與進(jìn)展也與Hh的信號通路也有緊密的聯(lián)系[7-9]。但Hh的信號通路比較復(fù)雜，它在腫瘤的產(chǎn)生與進(jìn)展內(nèi)所起到的調(diào)控原理當(dāng)前尚不完全清楚。

表4 大腸癌病理參數(shù)與Glil表達(dá)的關(guān)系/例

本文使用免疫組化的研究方法對Hh的信號通路在大腸癌的病變進(jìn)程內(nèi)表達(dá)的情況進(jìn)行分析，結(jié)果顯示大腸癌患者的病情發(fā)展中可能有Hh的信號通路異?；罨膮⑴c，還可能加速了疾病的進(jìn)展。本研究結(jié)果和國內(nèi)外關(guān)于大腸癌與Hh的信號通路聯(lián)系的研究一致，Yoshikawa等[10]研究顯示Shh在大腸癌的組織內(nèi)表達(dá)水平較高，在正常的大腸黏膜中沒有Shh表達(dá)，而且Glil和Ptch表達(dá)水平伴隨著大腸的腺瘤向大腸瘤進(jìn)展呈現(xiàn)出上升的趨勢。本文研究顯示，在大腸的腺瘤向大腸癌進(jìn)展中Hh的信號通路內(nèi)關(guān)鍵的負(fù)調(diào)控的因子表達(dá)表現(xiàn)出下降趨勢，其在大腸癌內(nèi)陽性的表達(dá)明顯比大腸的腺瘤與正常的大腸黏膜要低。定位在初生纖毛SuFu蛋白是胞漿蛋白質(zhì)的復(fù)合體其主組成部分，而Hh信號的通路下游內(nèi)轉(zhuǎn)錄的因子Gli家族調(diào)控則依賴于初生的纖毛，所以SuFu蛋白降解對Gli能不能激活下游的轉(zhuǎn)錄因子有這決定性的作用[11-13]。可能是一些未知因素或者SuFu蛋白突變等致使SuFu蛋白出現(xiàn)降解[14-15]，對Gli家族的入核造成干擾，致使細(xì)胞的增殖與生長的狀態(tài)發(fā)生絮亂，進(jìn)一步造成了大腸癌發(fā)生與進(jìn)展。

綜上所述，大腸癌疾病進(jìn)展中有Hh的信號通路異常的活化參與，患者的浸潤深度和臨床分期與Hh的信號通路異常的活化可能有聯(lián)系。