陳瑞鳳 梁紫堯 于旭華 尹碩淼 范 龍 林 琳 許銀姬 陳云波 王 奇

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣州510405)

香煙煙霧與脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)作為氣道炎癥刺激物，常用于慢性阻塞性肺病的動物模型的建立。盡管氣道炎癥的主要表現(xiàn)之一氣道免疫炎癥細(xì)胞的浸潤，然而國內(nèi)的多數(shù)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究著眼于香煙及脂多糖對氣道上皮細(xì)胞或肺組織的損傷作用[1]，而疏于對氣道免疫細(xì)胞的募集及功能的報(bào)道。本研究通過運(yùn)用香煙煙霧短期(4 d)刺激及LPS氣道滴注誘發(fā)氣道免疫反應(yīng)，報(bào)道熏煙及LPS對氣道免疫細(xì)胞分類計(jì)數(shù)、免疫細(xì)胞形態(tài)、免疫細(xì)胞應(yīng)激能力以及氣道組織對免疫細(xì)胞趨化成熟作用的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑 脂多糖(Sigma 公司，055：B5，批號:L2880)。NucleoZOL(MNG；貨號740404.2)。異丙醇(廣州化學(xué)試劑有限公司)。SYBR Premix Ex TapTMⅡ試劑盒(TaKaRa；貨號RR820A)。PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒(TaKaRa；貨號RR036A)。PDB(2-丁酸佛波醇酯；Sigma aldrich，貨號：P1269)和L-012(8-氨基-5-氯-7-苯基-2,3-二氫吡啶并[3,4-d]噠嗪-1,4-二酮；Wako Pure Chemical Industries，貨號：120-04891)。大前門牌過濾嘴香煙(煙堿含量0.8 mg，焦油量11 mg/支，上海煙草集團(tuán))。引物均來源于Invitrogen(Fisher Scientific公司)，CXCL-15：上游引物TCAATTCCCACCTT-GAGGCA，下游引物CCAGAATCAACGCAAAGCCA；GM-CSF：上游引物TCAAAGAAGCCCTGAACCTCC，下游引物GTGTTTCACAGTCCGTTTCCG；β-Actin：上游引物GCTCCTAGCACCATGAAGATCA，下游引物AGGGTGTAAAACGCAGCTCA。

1.1.2儀器 多功能臺式冷凍離心機(jī)(Allegra X-22R)，生物樣品均質(zhì)器(Bertin technologies)，UV-7504型單光束紫外可見分光光度計(jì)(上海欣茂儀器有限公司)，PCR擴(kuò)增儀(Applied Biosystem)，熒光定量PCR儀(ViiA7)，Countstar自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(上海睿鈺生物科技有限公司)，多功能酶標(biāo)儀(Infinite M1000 PRO)，自動液基薄層細(xì)胞制片機(jī)(HQTCT-Thin PlusⅠ)。

1.1.3實(shí)驗(yàn)動物 SPF級6～8周齡BALB/c小鼠，雌性，體重(20±2)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，許可證號：11400700173607。飼養(yǎng)溫度：(24±3)℃，相對濕度：(40±5)%，光照：明暗交替，噪聲<55 dB，自由攝水?dāng)z食，每周更換墊料2次。

1.2方法

1.2.1動物的分組及造模 動物分組：小鼠隨機(jī)分為3組，對照組、LPS滴注組和熏煙組，每組動物8～10只。

干預(yù)措施：熏煙組：小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，置于18 L熏煙箱中進(jìn)行熏煙。每次3支香煙，3次/d，煙霧用60 ml注射器注入熏煙箱中。于9 am、12 am、3 pm進(jìn)行，每次1 h，連續(xù)4 d后取材。脂多糖(LPS)組：小鼠進(jìn)行常規(guī)喂養(yǎng)，于取材前24 h經(jīng)4%戊巴比妥腹腔注射麻醉，切開氣管處皮毛，充分暴露氣管，微量注射器滴入10 μg LPS(濃度2 μg/μl)，滴注完成后傾斜上提小鼠軀體，輕揉按摩肺部，使LPS盡可能分布兩肺?？p合頸部皮膚，待小鼠清醒后，置籠內(nèi)正常飼養(yǎng)。對照組小鼠每天用60 ml注射器將空氣注入18 L熏煙箱中，其余操作同熏煙組小鼠。

1.2.2標(biāo)本采集 小鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，切開氣管處皮毛，充分暴露氣管，經(jīng)環(huán)狀軟骨間隙切開一小口，插入氣管灌洗管(剪成楔形的24G靜脈留置針)，向肺內(nèi)注入1.3 ml生理鹽水，共回收約1 ml含免疫細(xì)胞的灌洗液，用于細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類計(jì)數(shù)。完成氣管灌注后切開胸腹，充分暴露心肺，用5 ml生理鹽水進(jìn)行心臟灌流，洗去肺中殘存血液，切下兩側(cè)肺，濾干水分，分裝3份，液氮處理后轉(zhuǎn)移至-80℃保存，用于PCR檢測。

1.2.3支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類計(jì)數(shù) 將氣道灌洗液離心3 000 r/min 10 min，去上清液，細(xì)胞沉渣重懸于100 μl生理鹽水,加入500 μl的紅細(xì)胞裂解液，混勻靜置約2 min后離心2500 r/min，5 min。棄上清液，細(xì)胞沉淀重懸800 μl生理鹽水，混勻取20 μl進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，用Countstar自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)算總細(xì)胞數(shù),余重懸液進(jìn)行HE染色涂片,按形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行細(xì)胞分類。

1.2.4細(xì)胞PDB誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激測定 根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案，選用不透光的黑色96孔板，每孔加入50 μl 細(xì)胞混懸液。PBD刺激組加入150 μl kreb′s工作液，20 μl PDB工作液，PBD陰性對照組加入170 μl kreb′s工作液，立即進(jìn)行化學(xué)發(fā)光測定，每孔測定1 s，共30個循環(huán)。ROS含量(RLU/S/1 000 cell)=(測定值-空白值)/50 μl細(xì)胞數(shù)×1 000。

1.2.5PCR法測定肺組織細(xì)胞因子 使用

NucleoZOL試劑提取肺組織中的總RNA 后,用隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按照TaKaRa擴(kuò)增試劑盒說明書要求操作，根據(jù)2-ΔΔCT公式計(jì)算RNA的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1香煙煙霧及LPS對小鼠體重的影響 與實(shí)驗(yàn)前相比，對照組小鼠體重未見明顯變化(P>0.05)；熏煙4 d后，小鼠體重比熏煙前減少18.9%，其變化差異明顯高于對照組和LPS組(P<0.01)；氣管內(nèi)滴注10 μg LPS 24 h后，小鼠體重?zé)o明顯變化(P>0.05)。見表1。

2.2香煙煙霧及LPS對氣道灌洗液細(xì)胞總數(shù)和分類計(jì)數(shù)的影響 與對照組相比，熏煙組小鼠氣道灌洗液細(xì)胞總數(shù)、巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)，中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)和淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)均無明顯變化,(P>0.05)；LPS組小鼠在LPS氣道滴注24 h后，氣道灌洗液細(xì)胞總數(shù)明顯升高，高于對照組和熏煙組(P<0.01)并且巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)和中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)均高于對照組和熏煙組(P<0.01)。見表2、3，說明LPS誘導(dǎo)的免疫細(xì)胞募集以單核巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞為主。

2.3香煙煙霧和LPS對免疫細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響 對照組灌洗液中以巨噬細(xì)胞為主，偶見中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。巨噬細(xì)胞胞體呈圓或不規(guī)則形，胞核形態(tài)圓形，深染，大部分細(xì)胞質(zhì)量較少，粉紅色，僅少量細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)量多，呈淡粉色；中性粒細(xì)胞通常呈桿狀或2～3分葉狀。熏煙組細(xì)胞以巨噬細(xì)胞為主，形態(tài)與對照組細(xì)胞一致。LPS組小鼠氣道灌洗液可見大量中性粒細(xì)胞，細(xì)胞核多呈明顯的3～5分葉狀，偶見6～7分葉狀，葉與葉間多有細(xì)絲相連；與對照組相比，巨噬細(xì)胞體積較大，圓形或不規(guī)則形，細(xì)胞質(zhì)較多，淡染，內(nèi)可見空泡；偶見單核細(xì)胞。見圖1。

2.4香煙煙霧和LPS對細(xì)胞PDB誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激影響 與對照組和熏煙組相比，LPS氣管滴注的小鼠氣道灌洗液細(xì)胞在PDB的誘導(dǎo)下具有更高的ROS產(chǎn)出率(P<0.01)，在非PDB的誘導(dǎo)的LPS組小鼠氣道灌洗液細(xì)胞的ROS產(chǎn)出率仍較對照組和熏煙組高(P<0.01)。見表4。

GroupsPretest weight(g)Preset weight (g)Weight loss(%)Control group20.57±0.7321.00±1.660.01±3.08Smoke group19.98±0.5316.20±0.54-18.90±1.761)2)LPS group20.5±0.7621.40±0.754.39±1.2

Note:Compared to control group,1)P<0.01；compared to LPS group，2)P<0.01.

GroupsTotal cells(×105)Total macrophages(×105)Total neutrophils(×100)Total lymphocytes(×100)Control group2.86±0.82.66±0.78708.8±843.92 734.4±8 023.2Smoke group1.37±0.681.35±0.671 388.13±4 164.380.0±0.0LPS group6.41±1.982)3)3.11±1.421)3)252 799.93±79 050.362)3)451.58±1 497.7

Note:Compared to control group,1)P<0.05,2)P<0.01;compared to smoke group,3)P<0.01.

GroupsTotalmacrophages(%)Totalneutrophils(%)Totallymphocytes(%)Control group97.75±5.950.38±0.520.73±2.19Smoke group99.22±2.330.78±2.330.00±0.00LPS group49.33±19.701)3)42.29±11.942)3)0.04±0.15

Note:Compared to control group,1)P<0.05,2)P<0.01；compared to smoke group,3)P<0.01.

圖1 香煙煙霧和LPS對免疫細(xì)胞形態(tài)的影響(HE×400)Fig.1 Effects of cigarette smoke and LPS on immune cell morphology (HE×400)Note: A.Control group;B.Smoke group;C.LPS group.Yellow arrows represented alveolar acrophages,black arrows represented activated macrophages,red arrows represented neutrophils,and blue arrows represented monocytes.

GroupsPDB+PDB-Control group53.73±30.585.37±8.32Smoke group27.72±16.51.87±1.58LPS group4 325.33±159.261)2)21.56±3.041)2)

Note:Compared to control group,1)P<0.01；compared to smoke group,2)P<0.01.

GroupsGM-CSFCXCL-15Control group1.111±0.1721.011±0.048Smoke group1.336±0.1981.035±0.585LPS group10.28±1.4821)2)0.817 3±0.135

Note:Compared to control group,1)P<0.01；compared to smoke group,2)P<0.01.

2.5肺組織中CXCL-15和GM-CSF的影響 與對照組相比，熏煙組小鼠肺組織中GM-CSF和CXCL-15的表達(dá)均沒改變(P>0.05)。LPS氣管滴注的小鼠肺組織中GM-CSF表達(dá)增高9.26倍(P<0.01)，但CXCL-15并未發(fā)生改變(P>0.05),見表5。

3 討論

香煙煙霧中含有4 000多種化合物，其中包括了尼古丁、煙焦油、一氧化碳、甲醛、氨氣和DDT等有毒物質(zhì)[2]。吸煙可引起氣道炎癥，導(dǎo)致慢性支氣管炎、慢阻肺的發(fā)生。據(jù)報(bào)道，短期香煙煙霧刺激小鼠氣道可誘發(fā)氣道急性炎癥[3]，可表現(xiàn)為氣道巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞增多，而LPS誘導(dǎo)的氣道炎癥具有相似特點(diǎn)[4,5]。因此,本文分別用香煙煙霧和LPS誘導(dǎo)氣道的急性炎癥反應(yīng)，比較二者對氣道免疫細(xì)胞的影響和區(qū)別。

在急性感染的過程中，體重下降往往代表了系統(tǒng)炎癥的發(fā)生[6]。然而在本次實(shí)驗(yàn)中，4 d(9支煙)二手香煙煙霧暴露并未產(chǎn)生明顯氣道炎癥，因此系統(tǒng)炎癥產(chǎn)生的可能性較低。但熏煙組小鼠體重明顯下降(18.9%)，體重下降程度高于既往文獻(xiàn)報(bào)道(5%～10%)[7]。熏煙導(dǎo)致體重下降的原因有二，一是炎癥促進(jìn)新陳代謝，增加了能量消耗；二是尼古丁通過刺激神經(jīng)受體、影響激素分泌和脂肪代謝，抑制食欲等減輕體重[8]。在本次實(shí)驗(yàn)中，短期熏煙并未導(dǎo)致氣道炎癥細(xì)胞明顯增加，因此熏煙組動物體重下降可能主要是由于尼古丁導(dǎo)致。并且本次實(shí)驗(yàn)小鼠體重下降的幅度較大，這可能與香煙尼古丁的含量不同有關(guān)。LPS氣道滴注24 h誘發(fā)了氣道急性炎癥，短時的急性炎癥反應(yīng)并未導(dǎo)致明顯的體重下降。

與國外報(bào)道相比，本次實(shí)驗(yàn)中4 d(9支煙/d)香煙煙霧暴露并未誘發(fā)明顯氣道炎癥反應(yīng)，細(xì)胞數(shù)目低于國外報(bào)道。其原因可能為：①香煙中成分含量差異；②同種類小鼠基因型可能存在差異，從而導(dǎo)致對刺激的反應(yīng)程度存在差異；③由于小鼠反應(yīng)的差異，產(chǎn)生急性炎癥峰值的時間可能有差異。相對于香煙煙霧，LPS可導(dǎo)致氣道炎癥細(xì)胞總數(shù)升高，主要表現(xiàn)為中性粒細(xì)胞數(shù)目升高，說明LPS可促進(jìn)中性粒細(xì)胞在氣道的聚集，符合急性炎癥反應(yīng)的特征。

免疫細(xì)胞的形態(tài)在一定程度上反映了其功能的狀態(tài)。本次實(shí)驗(yàn)通過對氣道灌洗液細(xì)胞涂片染色，發(fā)現(xiàn)短期(4 d)熏煙小鼠氣道灌洗液細(xì)胞在巨噬細(xì)胞大小、形狀、中性粒細(xì)胞核象方面與對照組并沒有明顯差別，說明短期熏煙并未引起小鼠氣道免疫細(xì)胞形態(tài)變化。LPS導(dǎo)致氣道巨噬細(xì)胞體積增大，形狀不規(guī)則改變，細(xì)胞質(zhì)增多，甚至空泡形成，說明單核細(xì)胞處于高度激活的狀態(tài)；與此同時，LPS導(dǎo)致小鼠氣道中性粒細(xì)胞核分葉增多，表明LPS可以誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞成熟，增強(qiáng)中性粒細(xì)胞的吞噬功能。此外，LPS組細(xì)胞灌洗液中還可見少量單核細(xì)胞，說明LPS刺激誘導(dǎo)血液中的單核細(xì)胞向氣道聚集，并可能在局部分化為巨噬細(xì)胞。

氣道免疫細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，是其發(fā)揮免疫作用、殺滅微生物的主要途徑之一[9]。PDB是公認(rèn)的氧化應(yīng)激產(chǎn)物誘導(dǎo)劑。本次實(shí)驗(yàn)中LPS組小鼠氣道灌洗細(xì)胞在無PDB的誘導(dǎo)刺激下，與對照組相比，即產(chǎn)生較多的ROS，說明LPS有類似PDB的作用。而在PDB的誘導(dǎo)下，LPS組氣道灌洗細(xì)胞產(chǎn)生的ROS約為對照組的80倍，說明LPS導(dǎo)致了氣道免疫細(xì)胞的強(qiáng)氧化應(yīng)激狀態(tài)，該反應(yīng)類似于宿主免疫細(xì)胞對微生物的反應(yīng)。而熏煙4 d，并未導(dǎo)致氣道灌洗細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)的改變。

CXCL15表達(dá)于小鼠體內(nèi)，是屬于趨化因子家族中的一類細(xì)胞因子，其作用類似于CXCL8，可以促進(jìn)中性粒細(xì)胞的募集，其在肺和肺上皮細(xì)胞中高表達(dá)[10]。本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)，盡管LPS導(dǎo)致氣道中性粒細(xì)胞的聚集，但肺組織中CXCL15并未見明顯升高，說明LPS并不通過CXCL15招募中性粒細(xì)胞聚集氣道。GM-CSF具有促進(jìn)中性粒細(xì)胞成熟和趨化中性粒細(xì)胞的作用[11,12]，有報(bào)道認(rèn)為其為中性粒細(xì)胞的炎癥的生物標(biāo)志物。LPS組小鼠肺組織GM-CSF的表達(dá)明顯升高，說明LPS可通過提高肺組織GM-CSF的表達(dá)，促進(jìn)中性粒細(xì)胞的成熟和趨化。而香煙煙霧并未導(dǎo)致肺組織CXCL-15和GM-CSF表達(dá)升高，也未增加氣道中性粒細(xì)胞的數(shù)量。

COPD在女性中發(fā)病率為5.1%[13]，既往COPD實(shí)驗(yàn)研究中多以雄性小鼠作為實(shí)驗(yàn)動物，缺乏雌性小鼠數(shù)據(jù)?；谙銦煙熿F和LPS常用于COPD動物模型的建立，本研究在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上選用了雌性小鼠作為研究對象，有別于其他實(shí)驗(yàn)研究。此外，本研究對照組通過向箱體內(nèi)注入空氣的方法進(jìn)行“假熏煙”，排除了熏煙過程對小鼠造成的影響。但是并沒有向?qū)φ战M小鼠氣管內(nèi)滴注生理鹽水，忽略了手術(shù)操作和生理鹽水本身對氣道免疫細(xì)胞的影響，此為本研究設(shè)計(jì)上的缺陷。但是根據(jù)既往研究數(shù)據(jù)表明，假手術(shù)組(氣管內(nèi)滴注生理鹽水或PBS)跟空白對照組氣道內(nèi)炎癥細(xì)胞總數(shù)并沒有差異[14]，且本實(shí)驗(yàn)中對照組細(xì)胞總數(shù)與其他報(bào)道中假手術(shù)組細(xì)胞總數(shù)相似[14,15]，說明手術(shù)和生理鹽水尚未構(gòu)成對氣道免疫細(xì)胞數(shù)量明顯的影響，因此，在本次實(shí)驗(yàn)中未設(shè)LPS假手術(shù)組并未嚴(yán)重影響不同組別數(shù)據(jù)的可比性。

綜上所述，10 μg LPS氣道滴注可通過增加肺組織GM-CSF的表達(dá)，增加中性粒細(xì)胞的成熟和募集，并促進(jìn)了氣道免疫細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)及產(chǎn)生ROS的能力，而熏煙4 d未能產(chǎn)生氣道炎癥反應(yīng)。在建立熏煙聯(lián)合脂多糖的COPD動物模型之前，我們有必要了解香煙和脂多糖分別對氣道炎癥免疫的影響，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步分析熏煙聯(lián)合脂多糖對免疫細(xì)胞的交互影響，從而更好地了解并揭示吸煙和感染共同導(dǎo)致COPD的病理機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)僅揭示了短期香煙煙霧對氣道的急性炎癥刺激作用和免疫反應(yīng)，更長時間的香煙刺激以及合并反復(fù)感染的病理機(jī)制，有待進(jìn)一步研究。