閆 雯 張小珍 齊曉明 王 姣 尤崇革

(蘭州大學第二醫(yī)院檢驗醫(yī)學中心，蘭州730000)

類風濕性關節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一種累及外周關節(jié)、滑膜以及結締組織結構異常增生的慢性多系統(tǒng)性自身免疫障礙性疾病[1]，全球發(fā)病率可達1%，臨床表現(xiàn)為滑膜炎癥、關節(jié)損害和殘疾。其發(fā)病機制復雜，受環(huán)境、感染因素[2]和遺傳因素[3,4]多重影響，其中遺傳因素可達50%[5]。文獻報道日本人RTKN2基因rs3125734 C>T[6]、韓國人LDLR基因rs688 C>T、APOB基因rs693 C>T和APOC1基因rs4420638 A>G四個單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphisms,SNP)位點與RA易感相關[7]，但在中國人群尚無相關報道，需進一步驗證。由于國外研究多采用高通量或Sanger測序等方法，技術要求高[8]、成本昂貴[9]，不適合臨床常規(guī)化檢測。為此，本文采用高效、簡便、低成本的高分辨熔解曲線(High resolution melting，HRM)基因分型技術[10]，基于本實驗室的聚合酶鏈式反應-高分辨率熔解(Polymerase chain reaction-high resolution melting,PCR-HRM)檢測技術平臺，建立這四個SNP的常規(guī)化PCR-HRM分子診斷方法，研究其與中國蘭州地區(qū)漢族人群RA易感的相關性。

1 材料與方法

1.1研究對象 病例組588例為2011年7月至2014年5月經蘭州大學第二醫(yī)院風濕科確診的RA患者，男性133例，女性455例，年齡(47.6±14.9)歲；對照組200例為同期體檢健康者，男性72例，女性128例，年齡(49.6±15.4)歲。RA診斷采用2009年美國風濕病學會診斷標準[11]，排除合并其他慢性病，自身免疫性疾病及過敏史的患者。所有研究對象均為蘭州地區(qū)沒有血緣關系的漢族人，且已知情同意。本研究經蘭州大學第二醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2方法

1.2.1基因組DNA提取 采集研究對象空腹EDTA-K2抗凝血2 ml，嚴格按照Quick Gene全血基因組DNA提取試劑盒(日本Fujifilm公司)說明書提取基因組DNA。通過Nano-drop2000微量蛋白核酸檢測儀(美國Thermal Scientific公司)檢測DNA濃度和純度(A260/280nm>1.75，A260/230nm>2.0)，經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定DNA完整性后調整濃度至40 ng/μl，-40℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2引物設計與合成 使用Primer 3(http://www.simgene.com/Primer3)和Beacon designer 7.0軟件設計rs3125734、rs688、rs693和rs4420638的特異性引物，引物的特異性、有效性、Tm值(℃)和可辨性通過在線軟件Primer-BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/Primer-blast/)、Two-state melting(httP://mfold.rna.albany.edu/?q=DINAMelt/Two-state-folding)、OligoAnalyzer3.1(http:wwwJPidtdna.com/calc/analyzer)和uMelt(http://dna.utah.edu/umelt.com/)驗證。引物合成由上海生工生物工程股份有限公司完成，引物詳細信息見表1。

表1各位點引物序列及產物長度

Tab.1Sequenceandampliconsizeofprimersetsofloci

SNPsGeneSequence of primer sets(5′→3′)Amplicon size(bp)rs3125734RTKN2P1 TGGCTCACTTGCAGGATACA118P2 TGGGCAGTTCCTTATTGGTCArs688LDLRP1 GGCCGCCTCTACTGGGTTGAC107P2 GGGTGGGCCAGCCTCTTTTCArs693APOBP1 AAGCCTACAGGACACCAAAATAAC125P2 ACATTCGGTCTCGTGTATCTTCTArs4420638APOC1P1 GCAATGTCACTATGC TACACTTTTCC112P2 ATCCTGGGGGAGAGAGTGAG

1.2.3PCR-HRM檢測 PCR反應體系12 μl，包括10×buffer 1.2 μl、10 mmol/L dNTP 0.24 μl、5 mmol/L SYTO 13熒光染料(美國Life Technologies公司)0.06 μl、5 U/μl Platinum Taq DNA聚合酶(上海英駿技術有限公司)0.06 μl、50 mmol/L Mg2+0.36 μl、基因組DNA 1 μl、20 mmol/L正、反向引物各0.12 μl和DEPC水8.84 μl。PCR-HRM檢測使用Rotor-Gene Q PCR儀(德國QIAGEN公司)。PCR擴增條件采用96℃預變性3 min；循環(huán)內rs3125734：96℃ 5 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)；rs688：85℃ 5 s，60℃ 5 s，70℃ 5 s，40個循環(huán)；rs693：90℃ 5 s，60℃ 5 s，70℃ 5 s，40個循環(huán)；rs4420638： 90℃ 5 s，62℃ 18 s，38個循環(huán)；終延伸72℃ 1 min。HRM檢測條件為96℃變性10 s，50℃退火30 s，以0.15℃/step的分辨率收集71℃至89℃的熔解曲線數(shù)據[12]。根據熔解曲線峰型和Tm值進行基因分型后，隨機挑選各位點不同基因型樣本各3例進行普通PCR擴增，經4%瓊脂糖凝膠電泳確定為單一明亮條帶后，將產物送上海生工生物技術有限公司進行測序驗證。

1.2.4血清學指標檢測 采集RA患者空腹靜脈血，分離血清，分別使用乳膠凝集法和ELISA法檢測抗環(huán)瓜氨酸肽抗體(anti-cyclic citrullinated peptide antibody,anti-CCP)和類風濕因子(Rheumatoid factor,RF)，結果以-/+表示。

1.3統(tǒng)計學分析 使用在線軟件SHEsis(http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php)進行四個位點基因型和等位基因頻率、Hardy-Weinberg遺傳平衡和單倍型分析；使用SPSS21.0分析上述位點與RA的關系，P<0.05定義為差異有統(tǒng)計學意義；對不同組間有顯著差異的位點行l(wèi)ogistic回歸分析，以野生純合型為參照，觀察純合突變和雜合突變基因型對RA發(fā)病的影響，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1基因分型與測序驗證 成功建立了rs3125734、rs688、rs693和rs4420638位點的PCR-HRM檢測方法并完成所有臨床標本的基因分型，隨機抽取各位點不同基因型樣本各3例進行測序驗證，結果與PCR-HRM基因分型結果完全一致(圖1)。

2.2RA易感性和單倍型分析 Hardy-Weinberg遺傳平衡分析顯示rs3125734、rs688、rs693和rs4420638位點的對照組均達到遺傳平衡，具有群體代表性(P值分別為0.346、0.796、0.457和0.138)，其基因型和等位基因頻率詳見表2。結果顯示rs3125734和rs688位點基因型和等位基因頻率在兩組間有顯著差異(P值分別為0.046和0.016、0.014和0.020)，與蘭州地區(qū)漢族人群RA易感相關；logistic回歸分析顯示rs3125734雜合突變型CT在兩組間有顯著差異(χ2=4.011,P=0.045,OR=1.613,95% CI:1.010-2.576)，是RA發(fā)病的危險因素；rs688純合突變型TT與野生型CC在兩組間有顯著差異(χ2=6.853,P=0.009,OR=0.273,95% CI:0.103-0.721)，是RA的保護性因素；rs693和rs4420638位點基因型和等位基因頻率在RA組和對照組間均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。LDLR基因和APOC1基因均位于19號染色體上，構建rs688和rs4420638的單倍型，結果顯示單倍型CA和TA在RA組和對照組間有顯著差異(P=0.020，OR=1.408，95%CI：1.054-1.881；P=5.73×10-5，OR=0.443，95%CI：0.295-0.664)，其中單倍型CA增加RA發(fā)病風險，TA降低其發(fā)病風險；單倍型TG在兩組間無顯著差異(P=0.651，OR=1.093，95%CI：0.745-1.603)，與RA發(fā)病無明顯相關。

圖1 各位點PCR-HRM基因分型和測序驗證圖Fig.1 PCR-HRM genotyping and sequencing figures of loci

表2各位點基因型頻率和等位基因頻率在RA組和對照組中的分布[n(%)]

Tab.2Distributionsoffourlocigenotypeandallelefrequenciesincaseandcontrolgroups[n(%)]

SNPsGenotype/alleleRA groupControl groupχ2P valuers693CC498(0.847)180(0.900)3.8540.146C>TCT88(0.150)20(0.100)TT2(0.003)0(0.000)C1084(0.922)380(0.950)T92(0.078)20(0.050)3.6040.058rs4420638AA467(0.794)162(0.810)0.2310.631A>GAG121(0.206)38(0.190)GG0(0.000)0(0.000)A1055(0.897)362(0.905)G121(0.103)38(0.095)0.2050.651rs3125734CC473(0.804)175(0.875)6.1440.046C>TCT109(0.185)25(0.125)TT6(0.010)0(0.000)C1055(0.897)375(0.938)T121(0.103)25(0.062)5.7930.016rs688CC414(0.704)127(0.635)8.5820.014C>TCT166(0.282)64(0.320)TT8(0.014)9(0.045)C994(0.845)318(0.795)T182(0.155)82(0.205)5.4090.020

2.3血清學指標分層分析 病例組中有anti-CCP結果者441例，RF結果376例，經兩項血清學指標分層后，anti-CCP(+)RA組分別與anti-CCP(-)RA組和對照組進行統(tǒng)計學分析，RF(+)RA組分別與RF(-)RA組和對照組進行統(tǒng)計學分析，結果顯示rs4420638位點基因型和等位基因頻率在RF(-)RA組與對照組間有統(tǒng)計學差異(χ2=4.710，P=0.030；χ2=4.110，P=0.043)；logistic回歸分析顯示其雜合突變型AG在兩組間存在顯著差異(χ2=4.046，P=0.044，OR=1.799，95%CI：1.015-3.186)，表明AG基因型是RF(-)者RA發(fā)病的危險因素；rs693在各組間無顯著差異(P>0.05)。將病例組分為RF(+)CCP(+)組181例、RF(-)CCP(-)組55例、RF(+)CCP(-)組31例和RF(-)CCP(+)組55例，觀察各組單倍型分布情況，其中單倍型CA在四組中的頻率分別為0.950、0.927、0.982和0.968，單倍型TA在四組中頻率分別為0.287、0.218、0.327和0.355。

3 討論

本研究通過自建PCR-HRM檢測體系成功對788例臨床樣本進行rs3125734、rs688、rs693和rs4420638的基因分型，其中rs3125734與rs688蘭州地區(qū)漢族人群RA易感相關。日本人群全基因組關聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)rs3125734位點與RA易感相關且T等位基因可增加RA患病風險[6]，與本研究結果一致。該位點是位于RTKN2基因第一個外顯子上的錯義突變，突變后導致組氨酸變?yōu)榫彼?，影響蛋白表達。此外，由于RTKN2基因編碼的Rho-GTPase效應蛋白在CD4+T細胞高表達[13]并參與調節(jié)NF-κB通路的激活，而NF-κB通路是RA發(fā)病機制的重要環(huán)節(jié)，因此其T等位基因可通過增加NF-κB活性影響RA易感性[6]。韓國人群研究發(fā)現(xiàn)rs688位點與RA易感相關且T等位基因增加RA易感性[7]，與本研究結果不一致，兩項研究的比對分析，發(fā)現(xiàn)T等位基因頻率在兩組對照間存在統(tǒng)計學差異(χ2=175.121,P<0.001)，其T等位基因可通過降低LDLR基因12外顯子的剪接效率使LDLR水平降低、TC和LDL-C水平升高[10]，而血脂紊亂常與RA相伴發(fā)生[14]，這可能是易感因素之一。本研究未發(fā)現(xiàn)rs693和rs4420638位點基因型和等位基因頻率在RA組和對照組間有統(tǒng)計學差異，但經血清學指標將病例組分層后發(fā)現(xiàn)rs4420638位點基因型和等位基因頻率在RF(-)RA組與對照組間有顯著差異，這與Park等[9]在韓國人群中報道rs693位點與RA易感無關而rs4420638位點與RA易感相關的結論基本一致，只是本研究中RA易感性僅在RF(-)RA患者中表現(xiàn)出來，該位點是APOC-I基因3′端的點突變，有可能影響編碼蛋白的表達，本次研究未發(fā)現(xiàn)rs4420638位點的突變純合基因型GG，這可能與樣本量不足有關。查詢四個位點千人基因組數(shù)據，對比CHB(中國北方人群)和CHS(中國南方人群)，其中rs3125734、rs693和rs4420638位點在兩組中均無顯著差異(P>0.05)，rs688位點基因型頻率在兩組間有統(tǒng)計學差異(χ2=7.167,P=0.028)，因其CHB數(shù)據不符合Hardy-Weinberg遺傳平衡(P=0.034)，說明不具有群體代表性，對此差異不做考慮。以本研究RA組和對照組分別與CHB、CHS、CHB+CHS組行χ2檢驗，結果顯示P均大于0.05，無統(tǒng)計學差異；將CHB、CHS和本研究對照組合并后，分別與RA組行χ2檢驗，結果顯示rs3125734的基因和基因型頻率在兩組間存在顯著差異(χ2=6.986,P=0.008；χ2=7.002,P=0.030)。與不同人群研究數(shù)據比對發(fā)現(xiàn)，其基因和基因型頻率與日本人和韓國人較為接近(P>0.05)，但與歐洲人群差異較大(P均<0.001)，提示其具有顯著的種族差異性(歐洲和日本人群數(shù)據來自千人基因組數(shù)據庫，韓國人群數(shù)據來自文獻[7])。

通過血清學指標將病例組分為RF(+)anti-CCP(+)組、RF(-)anti-CCP (-)組、RF(+)anti-CCP(-)組和RF(-)anti-CCP (+)組，觀察其單倍型分布情況發(fā)現(xiàn)單倍型CA在各組中頻率較高。由于RF檢測靈敏度高但特異性較低，而anti-CCP檢測特異性較高，目前臨床常通過二者聯(lián)合診斷RA。但當兩項指標均呈現(xiàn)陰性結果或只有其中一項顯示陽性結果時，通過單倍型檢測可提高RA診斷的準確性，本研究建立的方法可用于臨床常規(guī)檢測。

總之，本研究成功建立了RTKN2、LDLR、APOB和APOC1基因多態(tài)性的PCR-HRM檢測方法，通過病例對照研究發(fā)現(xiàn)rs3125734、rs688和rs4420638位點在蘭州地區(qū)漢族人群中RA的易感性。PCR-HRM檢測方法具有普遍適用性，除本研究使用的儀器和熒光染料外，還可使用Light Scanner 32、Light Cycler 480、ABI 7500和CFX 96等儀器和LC Green、Eva Green和ResoLight等飽和熒光染料[15]。多重PCR-HRM技術近年來快速發(fā)展[12]，這一技術有望在未來實現(xiàn)更大通量、更快速度的檢測。此外，在研究rs693與乳腺癌[16]、膽囊癌[17]和胰島素抵抗[9]等疾病的相關性以及rs4420638與他汀類藥物療效[18]、2型糖尿病和阿茨海默病[19]發(fā)病的相關性時，上述檢測體系同樣適用。