江澤友 徐 燦 葛一漫

(成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院檢驗科，成都610072)

乳頭狀甲狀腺癌是最常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)癌癥，近幾十年來發(fā)病率呈逐年上升的趨勢[1,2]。研究表明，乳頭狀甲狀腺癌常見早期癌細胞及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，是導致乳頭狀甲狀腺癌患者病情惡化及死亡的主要原因[3]。放射性碘治療是目前治療轉(zhuǎn)移性乳頭狀甲狀腺癌的主要方法，但對于出現(xiàn)遠端轉(zhuǎn)移的乳頭狀甲狀腺癌患者無顯著療效，10年內(nèi)生存率不足10%[4]。并且長期進行放射性碘治療還具有誘導繼發(fā)白血病等的風險[5,6]。信號通路狀態(tài)的異常改變是癌癥發(fā)展的主要表現(xiàn)之一[7]。胰島素受體底物-1 (Insulin receptor substrate-1,IRS-1)能調(diào)控多條與細胞生長及轉(zhuǎn)移相關(guān)信號通路激活，如PI3K信號通路、MEK/ERK信號通路、JAK/STAST信號通路等[8]。研究發(fā)現(xiàn)，IRS-1的表達量與肺癌患者預后呈負相關(guān)[9,10]。但IRS-1能否影響乳頭狀甲狀腺癌細胞生長和轉(zhuǎn)移還未見報道。本文用shRNA沉默IRS-1以探究IRS-1在乳頭狀甲狀腺中的作用及機制，以期為臨床乳頭狀甲狀腺治療提供新的潛在靶標。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器 CLARIOstar酶標儀購自德國BMG Labtech公司；ProFlex PCR儀購自美國Life Technologies公司；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀和凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。RPMI1640細胞培養(yǎng)液、胎牛血清和0.25%胰酶購自美國Gibco公司 (貨號：11875119，10099141，25200114)；轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaqMan One Step PCR試劑盒和Annexin V試劑盒購自北京索萊寶公司 (貨號：RP1100，T2210，CA1020)，BCA試劑盒購自碧云天生物科技公司 (貨號：P0011)；Matrigel購自美國BD公司 (貨號：354230)，Trizol試劑購自美國賽默飛公司(貨號：15596026)；PI3K、AKT、p-PI3K和p-AKT一抗購自英國Abcam公司(貨號：ab1678，ab8805，ab191606，ab38449) ，IRS-1抗體購自美國CST公司 (貨號：3048)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 人乳頭狀甲狀腺癌細胞系TPC-1購自上海紀寧公司。用含有10%胎牛血清的RIPM1640培養(yǎng)液培養(yǎng)TPC-1細胞，培養(yǎng)環(huán)境條件為37℃，5%CO2。2 d換液一次。

1.2.2細胞轉(zhuǎn)染 用胰酶收集細胞，用培養(yǎng)液將細胞密度調(diào)整為1×106個/ml并接種于12孔板中，將細胞隨機分為TPC-1組、sh-scram組和sh-IRS-1組，根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑盒說明書用Lipofectamine 2000將sh-IRS-1轉(zhuǎn)染進TPC-1細胞，shRNA轉(zhuǎn)染sh-IRS-1組細胞，TPC-1組僅加入載體處理，轉(zhuǎn)染6 h后將含有轉(zhuǎn)染試劑的培養(yǎng)液更換為正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，48 h 后進行檢測。

1.2.3RT-PCR 用Trizol試劑提取轉(zhuǎn)染后的細胞總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。用PCR進行擴增后，根據(jù)TaqMan One Step PCR試劑盒說明書對mRNA進行定量分析，用β-actin作為內(nèi)參。實驗所用到的引物采用Primer3網(wǎng)站設計，由上海生工合成，引物序列如下：IRS-1 上游引物：5′-AGCCCAAAAGCCCAGGAGAATA-3′，下游引物：5′-TTCCGAGCCAGTCTCTTCTCTA-3′；β-actin上游引物：5′-TCGTGCGTGACATCAAAGAG-3′，下游引物：5′-TGGACAGTGAGGCCAGGATG-3′。

1.2.4Western blot 用RIPA試劑提取各組細胞蛋白，BCA試劑盒測定各組蛋白濃度。將各組蛋白濃度調(diào)平，用10% SDS-PAGE分離蛋白，半干法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜，并用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜，室溫 2 h。2 h后加入適應濃度一抗于4℃封閉過夜，第二天洗凈未結(jié)合一抗，加入二抗室溫孵育 1 h，1 h后滴加顯色液于暗室曝光顯影，用凝膠成像系統(tǒng)獲取蛋白質(zhì)條帶圖片。以GAPDH為內(nèi)參，用Image J軟件對蛋白質(zhì)含量進行半定量分析。

1.2.5MTT 將細胞接種于96孔板內(nèi)，細胞密度為1×105個/ml。培養(yǎng)24 h后用sh-IRS-1轉(zhuǎn)染細胞，分別連續(xù)培養(yǎng)0、1、2、3和4 d后，每孔加入10 μl MTT試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，每孔加入150 μl二甲基亞砜溶液，于搖床上低速振蕩混勻后，用酶標儀于570 nm處檢測細胞吸光度，計算細胞增殖倍數(shù)。

1.2.6Transwell 將轉(zhuǎn)染后細胞消化接種于用Matrigel預先包被的Transwell小室上層中，用無血清培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，小室下層6孔板中則加入正常細胞培養(yǎng)液。連續(xù)培養(yǎng)48 h后，擦去小室上層未侵襲的細胞，用結(jié)晶紫將侵襲細胞染色，于顯微鏡下觀察，每孔隨機選取6個視野進行計數(shù)統(tǒng)計。

1.2.7劃痕實驗 實驗前一天用記號筆于12孔板背面劃出5條平行直線，消毒滅菌后備用。實驗當天將細胞接種于12孔板內(nèi)，用sh-IRS-1對細胞進行轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24 h，第2天用10 μl槍頭垂直于培養(yǎng)板背面劃痕，用預冷的PBS將劃下的細胞洗凈后，加入無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用顯微鏡拍照，每孔選取3個視野，測量劃痕寬度，計算劃痕閉合率，劃痕閉合率=(初始劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/初始劃痕寬度×100%。

2 結(jié)果

2.1sh-IRS-1對IRS-1表達的影響 如圖1所示，與sh-scram組比較，sh-IRS-1組TPC-1細胞IRS-1的mRNA表達水平明顯降低 (P<0.01，圖1)；同時，sh-IRS-1組TPC-1細胞IRS-1的蛋白表達水平也明顯低于sh-IRS-1組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，圖1)，提示轉(zhuǎn)染成功。

2.2下調(diào)IRS-1表達對細胞增殖能力的影響 sh-IRS-1轉(zhuǎn)染細胞后3 d和4 d，sh-IRS-1組細胞增殖倍數(shù)顯著低于sh-scram組，差異有統(tǒng)計學意義 (P<0.05，圖2)；同時，與sh-scram組比較，sh-IRS-1組細胞凋亡率明顯升高 (P<0.01，圖3)，表明下調(diào)IRS-1表達能降低人乳頭瘤甲狀腺癌細胞增殖能力。

2.3下調(diào)IRS-1表達對細胞轉(zhuǎn)移能力的影響 Transwell實驗結(jié)果表明，與sh-scram組比較，sh-IRS-1組細胞侵襲數(shù)明顯減少 (P<0.01，圖4)；同時，sh-IRS-1組TPC-1細胞劃痕閉合率明顯低于sh-scram組，差異具有統(tǒng)計學意義 (P<0.01，圖5)，表明下調(diào)IRS-1表達能降低TPC-1細胞的轉(zhuǎn)移能力。

圖1 sh-IRS-1對TPC-1細胞IRS-1的mRNA和蛋白質(zhì)表達的影響Fig.1 Effects of sh-IRS-1 on mRNA level and protein level of IRS-1Note: RT-PCR and Western blot were performed for mRNA level and protein level of IRS-1.n=6,**.P<0.01 versus sh-scram group.All experiments were repeated at least three times,β-actin was used as loading control of RT-PCR,GAPDH was used as loading control of Western blot.

圖2 sh-IRS-1對TPC-1細胞增殖的影響Fig.2 Effect of sh-IRS-1 on cell proliferation of TPC-1 cellsNote: Cell viability was measured by MTT assay.n=6,*.P<0.05 versus with sh-scram group.

2.4下調(diào)IRS-1表達對PI3K/AKT信號通路的影響 Western blot實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，sh-IRS-1能抑制TPC-1細胞p-PI3K和p-AKT表達，能顯著降低p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT的比值 (P<0.01，圖6)，表明下調(diào)IRS-1表達能抑制TPC-1細胞PI3K/AKT信號通路激活。

圖3 sh-IRS-1對TPC-1細胞凋亡的影響Fig.3 Effect of sh-IRS-1 on apoptosis of TPC-1 cellsNote: Cell apoptosis rate was determined by flow cymetory.n=6,**.P<0.01 versus sh-scram group.

圖4sh-IRS-1對TPC-1細胞侵襲能力的影響

Fig.4Effectofsh-IRS-1oninvasionabilityofTPC-1cells

Note: Transwell assay was employed to measure invasion ability of TPC-1 cells.n=6,**.P<0.01 versus sh-scram group.

圖5 sh-IRS-1對TPC-1細胞遷移能力的影響Fig.5 Effect of sh-IRS-1 on migration ability of TPC-1 cellsNote: Migration ability of TPC-1 cells was determined by wound healing assay.n=6,**.P<0.01 versus sh-scram group.

圖6 sh-IRS-1對PI3K/AKT信號通路的影響Fig.6 Effect of sh-IRS-1 on PI3K/AKT signaling pathwayNote: The expressions of PI3K,p-PI3K,AKT,p-AKT were measured by Western blot.GAPDH was used as loading control.n=6,**.P<0.01 versus sh-scram group.

3 討論

乳頭狀甲狀腺癌是最常見的甲狀腺癌類型，約占所有甲狀腺癌的80%[11]。一般而言，早期乳頭狀甲狀腺癌經(jīng)過手術(shù)治療可以基本治愈[12]。但約有50%的乳頭狀甲狀腺癌患者都具有癌細胞轉(zhuǎn)移的傾向，這類患者預后往往較差，并且具有較高的死亡風險[13,14]。因此，了解乳頭狀甲狀腺癌細胞轉(zhuǎn)移的機制、尋找治療的新靶標是降低死亡率的關(guān)鍵。IRS-1是一類與胰島素抵抗形成相關(guān)因子，能夠調(diào)節(jié)細胞新陳代謝和細胞有絲分裂過程[15]。Hua等[16]研究發(fā)現(xiàn)IRS-1在子宮內(nèi)膜癌中表達異常增多，與患者的預后呈負相關(guān)。IRS-1與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[15]。IRS-1還能促進惡性間皮細胞瘤細胞的生長[17]。有研究表明IRS-1在肝癌早期的高表達能促進肝癌患者的存活，但也有研究報道IRS-1的高表達能夠促進肝癌細胞的生長[8,18]。據(jù)研究報道，IRS-1在甲狀腺癌中表達也顯著升高，IRS-1的激活與甲狀腺癌患者較差的預后有關(guān)[19]。但還未見文獻報道IRS-1在乳頭狀甲狀腺癌中的作用。在本研究中，我們設計合成shRNA干擾乳頭狀甲狀腺癌TPC-1細胞IRS-1的表達發(fā)現(xiàn)，sh-IRS-1能顯著降低IRS-1的mRNA表達水平和蛋白質(zhì)表達水平，表明shRNA能抑制TPC-1細胞IRS-1的表達。TGFβ/Smad3能通過下調(diào)IRS-1在結(jié)腸癌細胞中的表達水平抑制癌細胞增殖、誘導癌細胞凋亡[20]。本文研究表明，sh-IRS-1轉(zhuǎn)染細胞后的3 d和4 d，細胞增殖速度顯著低于sh-scram組，并且sh-IRS-1還能顯著升高TPC-1細胞的凋亡率，表明下調(diào)IRS-1的表達水平能抑制乳頭狀甲狀腺癌TPC-1細胞增殖、誘導癌細胞凋亡，從而抑制TPC-1細胞生長。

研究表明，IRS-1在調(diào)控癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的過程中發(fā)揮著重要作用[21]。Gibson等[22]的研究發(fā)現(xiàn)，敲除IRS-1能促進乳腺癌腫瘤的轉(zhuǎn)移。下調(diào)IRS-1表達能促進頭頸部鱗狀細胞癌的轉(zhuǎn)移[23]。但在乳腺癌、前列腺癌和神經(jīng)母細胞瘤中，IRS-1能誘導癌細胞的轉(zhuǎn)移，升高癌細胞的運動能力[21,24]。IRS-1表達水平的異常升高與鼻咽癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[25]。miR-128也可通過調(diào)控IRS-1的表達抑制結(jié)腸癌細胞生長和轉(zhuǎn)移[26]。本文研究結(jié)果表明，用shRNA干擾IRS-1表達后，乳頭狀甲狀腺癌TPC-1細胞侵襲及遷移能力明顯減弱，表明下調(diào)IRS-1表達能抑制TPC-1細胞侵襲和遷移，降低TPC-1細胞的轉(zhuǎn)移能力，提示IRS-1在乳頭狀甲狀腺癌中可能發(fā)揮促癌作用。

PI3K/AKT信號通路是調(diào)控細胞生長、分化和轉(zhuǎn)移的主要信號通路之一，在乳頭狀甲狀腺癌中處于過度激活的狀態(tài)[27]。研究表明，IRS-1是PI3K/AKT信號通路的主要調(diào)控分子之一，IRS-1可通過調(diào)控PI3K/AKT信號通路的激活影響癌細胞的增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移。Wu等[26]研究發(fā)現(xiàn)，miR-128抑制結(jié)腸癌細胞增殖和遷移的作用與通過下調(diào)IRS-1表達抑制PI3K/AKT信號通路激活有關(guān)。GPCRs促進PI3K/AKT信號通路的激活與促進IRS-1表達有關(guān)[28]。在本研究中，下調(diào)IRS-1能抑制p-PI3K和p-AKT表達，即抑制PI3K和AKT磷酸化，顯著降低p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT的比值，表明sh-IRS-1能抑制PI3K/AKT信號通路激活。

綜上所述，sh-IRS-1能降低乳頭狀甲狀腺癌TPC-1細胞增殖速度、侵襲及遷移能力，還能升高TPC-1細胞的凋亡率；同時，sh-RNA還能顯著降低p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT的比值，表明shRNA干擾IRS-1能降低人乳頭狀甲狀腺癌TPC-1細胞增殖及轉(zhuǎn)移能力，作用機制可能與抑制PI3K/AKT信號通路激活有關(guān)。本研究首次探究了IRS-1在人乳頭狀甲狀腺癌中的作用并初步探討了作用機制，可能為抑制乳頭狀甲狀腺癌的轉(zhuǎn)移提供新的潛在治療靶標。