江曉明 張峰波 朱玥潔 甫拉提·熱西提 李智偉 龐 盼 丁劍冰

(新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫教研室，烏魯木齊830011)

布魯氏菌病(Brucellosis)是由布魯氏菌感染引起的，《中華人民共和國傳染病防治法》中規(guī)定報告的乙類傳染病，是一種呈世界范圍分布的人畜共患病[1]，布病主要流行于我國的農(nóng)牧區(qū)，新疆是主要的高發(fā)地區(qū)之一[2，3]。布病的早期癥狀多不典型，容易發(fā)生診斷不清，延誤治療，使病情拖延至慢性期引發(fā)多器官受累致殘甚至致死[4-6]，且目前缺乏有效的治療方法[7]。為了減少疾病痛苦與社會損失，有必要開發(fā)安全有效的疫苗[8]，尤其在布病流行趨式嚴(yán)峻的地區(qū)。

至今尚未有國際認(rèn)可的人用布病疫苗，目前我國用于動物的疫苗是A19和S2兩種減毒疫苗，但在廣泛用于布病防控的同時也存在一些缺陷[9]，主要是毒性較大，使一些接種對象出現(xiàn)不同程度的副反應(yīng)或急性布病癥狀。生物信息學(xué)技術(shù)助力推進(jìn)布病疫苗的研發(fā)，目前針對布病研發(fā)的基因工程疫苗如表位疫苗取得了一定進(jìn)展，其中以外膜蛋白OMP31的研究較為突出。

本研究應(yīng)用生物信息軟件預(yù)測分析布魯氏菌OMP31的T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞(T-B)的聯(lián)合表位，利用優(yōu)勢表位人工合成OMP31肽段后免疫小鼠，分析OMP31 T-B聯(lián)合表位誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答效果。

1 材料與方法

1.1材料 SPF級雌性BALB/c小鼠，6～8周齡，體重(20±2)g，由新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床研究院實驗動物科學(xué)研究部提供，實驗動物生產(chǎn)許可證編號A-20130216-155。

1.2方法

1.2.1表位預(yù)測與合成 采用SYFPEITHI (http://syfpeithi.de/) and ProPred Prediction Server (http://www.imtech.res.in/raghava/propred1/)預(yù)測T細(xì)胞表位，OMP31B細(xì)胞表位采用DNAstar(USA lynnon biosoft)and IEDB(http://tools.immuneepitope.org/bcell)預(yù)測。預(yù)測后T-B細(xì)胞表位肽段由上海生工生物工程公司合成。

1.2.2小鼠免疫 將24只小鼠隨機(jī)分成兩組，每組12只：A組(陰性對照PBS組)，B組(實驗組)。B組背部皮下多點注射10 μg/ml的肽段200 μl與等體積完全弗氏佐劑(F5881，Sigma,USA)，2周后使用相同濃度肽段200 μl與等體積不完全弗氏佐劑(F5881，Sigma,USA)加強(qiáng)免疫，一共加強(qiáng)免疫3次,共8周。陰性對照組相同方法注射生理鹽水200 μl/(只·次)。

1.2.3Th1免疫應(yīng)答檢測 末次免疫后2周，麻醉后頸椎脫臼法處死小鼠，無菌分離脾臟，調(diào)整脾細(xì)胞濃度至1×107ml-1，ELISPOT檢測試劑盒(BD公司)計數(shù)小鼠脾細(xì)胞中分泌IFN-γ的淋巴細(xì)胞。具體方法如下：純化的IFN-γ包被ELISPOT板，100 μl/孔，4℃靜置過夜后棄掉包被液，用10%小牛血清的1640做封閉液清洗ELISPOT板一次，加入封閉液200 μl/孔，室溫靜置2 h，棄去封閉液，拍干后加入10 μg/ml的稀釋肽50 μl/孔，終濃度為5 μg/L，同時加設(shè)50 μl/孔 刺激肽ConA的陽性對照。每孔加入脾細(xì)胞懸液50 μl，置于37℃含5%CO2孵育箱中24 h，棄去細(xì)胞液，無菌水沖洗2次，PBST沖洗3次。用稀釋液稀釋檢測抗體250倍后，加入培養(yǎng)板，每孔100 μl,室溫孵育2 h。棄去檢測抗體溶液，PBST沖洗3次，將酶標(biāo)結(jié)合物稀釋100倍后100 μl/孔 加入培養(yǎng)板，室溫孵育1 h，棄去液體，PBST沖洗4次，PBS沖洗2次。加入底物溶液100 μl/孔，室溫顯色5 min,流水終止顯色反應(yīng)，干燥后ELISPOT計數(shù)儀分析實驗結(jié)果。

1.2.4體液免疫應(yīng)答檢測 末次免疫后2周，小鼠麻醉后內(nèi)眥靜脈取血，分離血清，采用ELISA法檢測兩組小鼠血清中的IgG1和IgG2a抗體水平。具體方法如下：取未偶聯(lián)KLH多肽100 ng/孔包被ELISA檢測板，4℃靜置過夜，棄去包被多肽，PBST洗板5次后用10%小牛血清37℃封閉1 h后，棄去封閉液，PBST洗板5次。分別加入1∶100稀釋的待檢血清，37℃孵育1 h,棄去血清后PBST洗板5次，加入1∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體，37℃孵育1 h，移去二抗，PBST洗板5次，加入顯色液37℃5 min后，各孔加入2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，以450 nm/630 nm雙波長讀取各孔OD值。實驗組/對照組的OD值≥2∶1為陽性。

2 結(jié)果

2.1OMP31 T-B細(xì)胞聯(lián)合優(yōu)勢抗原表位檢測 通過IEDB軟件在線分析OMP31蛋白抗原指數(shù)，篩選出了20個得分較高的區(qū)域，得分由高到低排列分別為：19～25、22～28、4～10、3～9、18～24、21～27、20～26、2～8、94～100、71～77、230～236、23～29、5～11、98～104、232～238、82～88、97～103、17～23、1～7、201～207(見圖1)。

通過DNAStar綜合分析篩選出了4個T-B細(xì)胞聯(lián)合優(yōu)勢抗原表位，分別為：4～11、108～114、152～157、171～176區(qū)段(見表1)。這些區(qū)段有適當(dāng)?shù)目乖瓫Q定基特征,因此可能會有助于刺激細(xì)胞和體液免疫系統(tǒng)消除病原體，為構(gòu)建多價布病疫苗的研究提供新的數(shù)據(jù)資料。

2.2重組OMP31 T-B表位可增強(qiáng)Th1免疫應(yīng)答 ELISPOT計數(shù)脾細(xì)胞中分泌IFN-γ的淋巴細(xì)胞。如圖2所示： PBS組SFU為(2.08±0.99)/106細(xì)胞,T-B聯(lián)合表位組SFU為(90.08±19.05)/106細(xì)胞。ConA組SFU為(397.15±23.10)/106細(xì)胞。與PBS組相比，T-B聯(lián)合表位組SFU明顯增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，見圖2、3)。

圖1 OMP31蛋白抗原指數(shù)預(yù)測圖Fig.1 OMP31 protein antigen index prediction chart

表1T-B聯(lián)合表位

Tab.1CombinedT-Bepitope

EpitopesPositionSequenceT-B combined epitope4～11VILASIAA108～114GSSVTGS152～157GTGGLA171～176ASALHT

圖2 ELISPOT 檢測結(jié)果Fig.2 Test results of ELISPOT

圖3 不同分組IFN-γ陽性T淋巴細(xì)胞斑點數(shù)Fig.3 SFU of IFN-γ-positive T lymphocyte in each groupNote: **.P<0.01 vs PBS.SFU(Spot forming units).

2.3重組OMP31 T-B表位可刺激小鼠產(chǎn)生IgG抗體 小鼠免疫結(jié)束后2周，ELISA法在1∶100稀釋血清中檢測出一定水平的IgG1和IgG2a抗體。PBS組IgG1水平0.13±0.06，T-B聯(lián)合表位組IgG1水平1.20±0.39，T-B聯(lián)合表位組IgG1水平高于PBS組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。PBS組IgG2a水平0.10±0.07，T-B聯(lián)合表位組IgG2a水平1.54±0.37，T-B聯(lián)合表位組IgG2a水平高于PBS組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，見圖4)。

圖4 不同分組小鼠血清IgG1和IgG2a抗體水平Fig.4 Level of IgG1 and IgG2a antibody in serum of mice in each groupNote: **.P<0.01 vs PBS.

圖5 不同分組小鼠血清IgG2a/IgG1水平比較Fig.5 Level of IgG2a/IgG1 in serum of mice in each groupNote: *.P<0.05，vs PBS.

為進(jìn)一步了解Th1/Th2平衡的情況，本研究檢測了IgG2a/IgG1水平，結(jié)果顯示T-B聯(lián)合表位組IgG2a/IgG1為1.45±0.67，PBS組IgG2a/IgG1為0.83±0.53。T-B聯(lián)合表位組IgG2a/IgG1高于PBS組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖5)。

3 討論

布病在我國多個省市都有較高的患病率，特別是在畜牧業(yè)迅速發(fā)展的新疆[10]。鑒于布病發(fā)病范圍廣且病情較難控制，研制預(yù)防控制布病的高效疫苗顯得尤為重要。目前針對布病研發(fā)的基因工程疫苗如表位疫苗、DNA疫苗、亞單位疫苗等均取得了一定進(jìn)展，基因工程具有以下優(yōu)勢[11]：其一，免疫持久，能刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫；其二，借助分子生物學(xué)基因重組技術(shù)，對不同抗原進(jìn)行操作，從而達(dá)到使該種疫苗理想化的目的；其三，成本低、易使用、易于運(yùn)輸和保存[12]。由于布魯氏菌為胞內(nèi)寄生菌，有效的T細(xì)胞免疫反應(yīng)對布魯氏菌的清除有最重要作用，因此DNA疫苗和亞單位疫苗的保護(hù)效果遠(yuǎn)不如活減毒疫苗[13]，而表位疫苗則有望取代常規(guī)布病減毒疫苗用于布病的防控。研制表位疫苗面臨的關(guān)鍵問題就是如何找到特異性抗原，抗原上免疫原性最強(qiáng)的區(qū)域即表位所在的位置[14]。

本研究顯示：與PBS組相比，T-B聯(lián)合表位組脾淋巴細(xì)胞中分泌IFN-γ的淋巴細(xì)胞、血清中IgG1、IgG2a抗體水平，均高于PBS組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；且T-B聯(lián)合表位組IgG2a/IgG1高于PBS組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。表明基于OMP31的4個T-B聯(lián)合優(yōu)勢抗原表位設(shè)計合成的肽段可以誘導(dǎo)免疫小鼠產(chǎn)生較強(qiáng)的Th1免疫應(yīng)答和一定水平的體液免疫應(yīng)答。淋巴細(xì)胞增殖分化是機(jī)體免疫應(yīng)答過程中的一個重要階段，淋巴細(xì)胞增殖水平反映機(jī)體的細(xì)胞免疫狀態(tài)，CD4+T細(xì)胞在機(jī)體控制細(xì)菌增長繁殖中起關(guān)鍵作用，龐盼等[15]研究發(fā)現(xiàn)布魯氏菌病患者血清中IFN-γ表達(dá)降低，提示低水平的IFN-γ不利于布魯氏菌的清除。且大量研究表明Th1免疫應(yīng)答在機(jī)體控制布魯氏菌感染的過程中在發(fā)揮重要作用[16,17]。體液免疫應(yīng)答中抗原抗體相互作用同樣在控制感染中發(fā)揮關(guān)鍵作用，抗體可通過調(diào)解機(jī)體特定的免疫應(yīng)答來消除抗原。一個保護(hù)性強(qiáng)的表位疫苗應(yīng)含有B細(xì)胞和T細(xì)胞聯(lián)合優(yōu)勢抗原表位，T細(xì)胞和B細(xì)胞聯(lián)合表位抗原可誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生持久及高水平免疫應(yīng)答，以便更有效地消除病原微生物[18]。

表位疫苗是控制預(yù)防布魯氏菌感染的有效途徑，表位的篩選與鑒定是表位疫苗的研究中最為關(guān)鍵的工作，而鑒定疫苗的標(biāo)準(zhǔn)之一就是表位的抗原性及刺激產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng)的強(qiáng)弱。本研究表明這4個T-B聯(lián)合表位有良好的免疫原性，具有作為布魯氏菌表位疫苗的潛質(zhì)，為進(jìn)一步研制布魯氏菌疫苗提供了科學(xué)參考。